ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Intraveneuze injectie van kankercellen wordt vaak gebruikt in metastaseonderzoek, maar de gemetastaseerde tumorbelasting kan moeilijk te analyseren zijn. Hierin demonstreren we een staartaderinjectiemodel van metastase en nemen we een nieuwe benadering op om de resulterende gemetastaseerde longtumorbelasting te analyseren.
Abstract
Metastase, de primaire oorzaak van morbiditeit en mortaliteit voor de meeste kankerpatiënten, kan een uitdaging zijn om preklinisch te modelleren bij muizen. Er zijn weinig spontane uitzaaimodellen beschikbaar. Het experimentele metastasemodel met staartaderinjectie van geschikte cellijnen is dus een steunpilaar van metastaseonderzoek. Wanneer kankercellen in de laterale staartader worden geïnjecteerd, is de long hun voorkeursplaats van kolonisatie. Een mogelijke beperking van deze techniek is de nauwkeurige kwantificering van de gemetastaseerde longtumorbelasting. Terwijl sommige onderzoekers macrometastasen van een vooraf gedefinieerde grootte tellen en / of micrometastasen omvatten na sectie van weefsel, bepalen anderen het gebied van gemetastaseerde laesies ten opzichte van het normale weefselgebied. Beide kwantificeringsmethoden kunnen buitengewoon moeilijk zijn wanneer de metastatische belasting hoog is. Hierin demonstreren we een intraveneus injectiemodel van longmetastase gevolgd door een geavanceerde methode voor het kwantificeren van gemetastaseerde tumorbelasting met behulp van beeldanalysesoftware. Dit proces maakt het mogelijk om meerdere eindpuntparameters te onderzoeken, waaronder de gemiddelde metastasegrootte, het totale aantal metastasen en het totale metastasegebied, om een uitgebreide analyse te bieden. Bovendien is deze methode beoordeeld door een veterinaire patholoog-board-gecertificeerd door het American College of Veterinary Pathologists (SEK) om nauwkeurigheid te garanderen.
Introduction
Ondanks het feit dat het een zeer complex en inefficiënt proces1 is, levert metastase een belangrijke bijdrage aan de morbiditeit en mortaliteit van kankerpatiënten2. In feite worden de meeste kankergerelateerde sterfgevallen toegeschreven aan gemetastaseerde verspreiding van ziekte3,4. Om tumorcellen met succes te laten metastaseren, moeten ze zich losmaken van de primaire plaats, binnendringen door aangrenzend stroma, intravaseren in de bloedcirculatie of lymfevaten, reizen naar het capillaire bed van een secundaire plaats, extravaseren in het secundaire weefsel en prolifereren of groeien om metastatische laesies te vormen5. Het gebruik van muismodellen is van cruciaal belang geweest voor het bevorderen van het begrip van de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor gemetastaseerd zaaien en groei6,7. Hierin richten we ons op borstkankermetastase, waarvoor zowel genetisch gemodificeerde muismodellen als transplantatiemethoden vaak worden gebruikt - elk met hun eigen reeks voordelen en beperkingen.
Genetisch gemanipuleerde borsttumormodellen maken gebruik van borstklierspecifieke promotors, waaronder MMTV-LTR (muismamatumorvirus long terminal repeat) en WAP (Whey Acidic Protein), om de expressie van transgenen in het borstepitheel8 te stimuleren. Oncogenen waaronder polyoma midden T-antigeen (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, Wnt-1 en simian virus 40 (SV40) zijn op deze manier tot expressie gebracht9,10,11,12,13, en hoewel deze genetische modellen nuttig zijn voor het bestuderen van primaire tumorinitiatie en -progressie, zijn er maar weinig gemakkelijk uitgezaaid naar verre organen. Bovendien zijn deze genetische muismodellen vaak duurder dan spontane of experimentele metastasemodellen. Gezien de beperking van de meeste genetisch gemanipuleerde borsttumormodellen om metastase te bestuderen, zijn transplantatietechnieken aantrekkelijke methoden geworden om dit complexe proces te bestuderen. Dit omvat orthotopische, staartader-, intracardiale en intracraniale injectie van geschikte cellijnen.
Hoewel verschillende borstkankercellijnen gemakkelijk uitzaaien na orthotopische injectie in het borstvetkussen14,15, kan de consistentie en reproduceerbaarheid van gemetastaseerde tumorbelasting een uitdaging zijn en kan de duur van dergelijke onderzoeken enkele maanden zijn. Voor het evalueren van longmetastase, in het bijzonder, is intraveneuze injectie in de staartader vaak een meer reproduceerbare en tijdseffectieve methode met gemetastaseerde verspreiding die meestal binnen een tijdsbestek van enkele weken optreedt. Aangezien het intraveneuze injectiemodel echter de eerste stappen van de metastatische cascade omzeilt, moet voorzichtigheid worden betracht bij het interpreteren van de resultaten van deze onderzoeken. In deze demonstratie tonen we staartaderinjectie van borsttumorcellen samen met een nauwkeurige en uitgebreide analysemethode.
Hoewel de onderzoeksgemeenschap aanzienlijke vooruitgang heeft geboekt bij het begrijpen van het complexe proces van borstkankermetastase, wordt geschat dat meer dan 150.000 vrouwen momenteel gemetastaseerde borstkanker hebben16. Van degenen met stadium IV borstkanker heeft >36% van de patiënten longmetastase17; het plaatsspecifieke patroon en de incidentie van metastasen kunnen echter variëren op basis van moleculair subtype18,19,20,21. Patiënten met borstkanker-geassocieerde longmetastasen hebben een mediane overleving van slechts 21 maanden, wat de noodzaak benadrukt om effectieve behandelingen en nieuwe biomarkers voor deze ziekte te identificeren17. Het gebruik van experimentele metastasemodellen, waaronder de intraveneuze injectie van tumorcellen, zal onze kennis van deze belangrijke klinische uitdaging blijven vergroten. In combinatie met digitale beeldvormingspathologie en de methode van metastatische longtumorbelastingsanalyse die in dit protocol wordt beschreven, zijn staartaderinjecties een waardevol hulpmiddel voor onderzoek naar borstkankermetastase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van dieren volgde de voorschriften van de University Laboratory Animal Resources (ULAR) onder het OSU Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) - goedgekeurd protocol 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore).
1. Staartader injectie van borstkankercellen
- Bereiding van cellen en spuit voor injectie
- Plaats een passend aantal cellen op basis van het aantal muizen en de te gebruiken celconcentratie.
OPMERKING: Het aantal geïnjecteerde cellen en de tijd tot de ontwikkeling van metastasen zijn afhankelijk van de gebruikte cellijn en moeten worden geoptimaliseerd. In deze demonstratie worden 1 x 106 MDA-MB-231 cellen intraveneus geïnjecteerd in NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) muizen, en macroscopische longlaesies worden uiterlijk 24 dagen na injectie waargenomen. Voor de MVT1 murine borsttumor cellijn17 worden 3 x 106 cellen geïnjecteerd in immuun-competente FVB/N muizen met talrijke longmetastasen waargenomen door 14 dagen22,23. - Aanzuigmedium en spoelcelplaten met 1x PBS. Trypsiniseer cellen in minimaal volume, voeg het juiste volume media toe en tel cellen met behulp van een hematocytometer of een andere voorkeursmethode. Trypan blauw (0,4%) of andere levende / dode cel kleurstoffen kunnen worden gebruikt om levensvatbare cel tellingen te bepalen.
- Pelletcellen door gedurende 5 min op 180 x g te draaien.
- Resuspend het juiste aantal cellen in steriele 1x PBS, zodat een volume van 100 μL per muis wordt geïnjecteerd. Houd celsuspensie op ijs om de levensvatbaarheid te behouden.
- Vóór de injectie moet u de cellen grondig resuspenderen met een pipet van 200 μL of 1 ml om klonteren te voorkomen. Zuig 100 μL op in een insulinespuit van 28 G (zie Materiaaltabel).
- Verwijder eventuele luchtbellen door de spuit verticaal te houden, op de spuit te tikken en de zuiger langzaam aan te passen. Injectie van luchtbellen in de ader zal waarschijnlijk een lucht / gasembolie veroorzaken die fataal kan zijn.
- Plaats een passend aantal cellen op basis van het aantal muizen en de te gebruiken celconcentratie.
- Laterale staartader injectie
OPMERKING: Voor experimentele borstkankermetastasetests worden injecties uitgevoerd op > 6 weken oude vrouwelijke muizen.- Hanteer de muis bij de staart en schuif het dier in een buis met sleuf/bevestigingsinrichting van een geschikte grootte (zie de tabel met materialen voor de gebruikte beveiligingsinrichting).
- Plaats het pluggedeelte van het beveiligingssysteem en plaats de muis op zijn kant zodat de laterale staartader gemakkelijk te zien is. De muis heeft een ventrale slagader in lijn met de genitaliën, een dorsale ader en twee laterale caudale aderen.
- Reinig het oppervlak van de staart van de muis met een aseptisch doekje. Pak de staart tussen wijsvinger en duim met niet-dominante hand en breng lichte spanning aan.
- Begin bij het distale deel van de staart en steek de naald parallel aan de ader in met het uiteinde.
- Indien toegestaan, sluit u de naald voorzichtig af en buigt u deze in een hoek van 20-30°. Een eenhandige benadering of naald recapping-apparaat wordt ten zeerste aanbevolen.
OPMERKING: Het is niet nodig om te aspirateren, omdat dit ertoe kan leiden dat de ader instort. Er kan echter een kleine flits van bloed worden gezien wanneer deze voor het eerst wordt geplaatst. De naald zal soepel in de ader komen met de juiste plaatsing. - Doseer langzaam het volledige volume in de ader. Er mag geen weerstand zijn wanneer de zuiger wordt ingedrukt.
- Als er weerstand wordt gevoeld, verwijder dan onmiddellijk de naald van de spuit. Indien nodig, breng de naald opnieuw in (idealiter niet meer dan 3 pogingen) die naar het proximale uiteinde van de staart of de tegengestelde laterale ader beweegt.
- Een klein volume bloed zal waarschijnlijk worden verplaatst na injectie. Oefen zachte druk uit met steriel gaas en veeg af met aseptisch doekje.
- Gooi de spuit onmiddellijk weg in de juiste naaldencontainer.
- Breng de muis terug naar een schone, geventileerde kooi en controleer op tekenen van nood.
- Controleer muizen 2-3x / wekelijks op tekenen van metastasevorming (moeizame ademhaling, gebogen houding, gewichtsverlies) en algemene nood. De tijd tot ontwikkeling van metastase zal afhangen van cellijn en muis stam.
- Bij gebruik van een in vivo levend dierbeeldvormingsapparaat, beeld muizen onmiddellijk na staartaderinjectie in om succesvolle injectie van cellen te bevestigen en tijd "nul" -gegevens te verkrijgen (specifieke details over in vivo bioluminescentiebeeldvorming zijn hierin niet opgenomen, maar worden beschreven door Yang et al.24).
2. Longweefselfixatie en analyse van gemetastaseerde longtumorbelasting
- Longweefselinflatie om het structurele formaat van de longen voor histopathologie te behouden
- Nadat goedgekeurde euthanasieprocedures (bijv. koolstofdioxide bij 30 - 70% verplaatsing van het kamervolume / min) worden gevolgd, bevestigt u het muizenkarkas met pinnen aan een ontleedbord. Spray of breng 70% ethanol aan om de vacht van de muis uit de weg te houden tijdens de dissectie.
OPMERKING: Kooldioxide-verstikking kan pulmonale bloeding veroorzaken als een verwachte achtergrondlaesie, vooral bij langzamere stroomsnelheden. - Open de thorax met een middellijnincisie, verleng de incisie craniaal /caudaal door het peritoneum en snijd het diafragma weg door het xyfusische proces vast te pakken.
- Gebruik een aparte schaar om de messen niet te dof te maken, knip de ribben langs elke kant van het borstbeen en verwijder voorzichtig de ribbenkast, zodat er ruimte is voor de longen om uit te zetten.
- Isoleer de luchtpijp door submandibulaire speekselklieren en infrahyoïde spieren te verwijderen. Het plaatsen van pinnen aan weerszijden van de luchtpijp kan ongewenste bewegingen tijdens het inbrengen van de naald voorkomen.
- Vul een spuit van 26 G met 2-3 ml 10% neutraal gebufferde formaline en breng deze in de luchtpijp.
- Injecteer langzaam formaline en kijk uit voor de longen om uit te zetten (vereist meestal ~ 1,5 ml formaline).
- Zodra formaline uit de longen begint te lekken (vermijd overinflatie), knijp je de luchtpijp af met een tang, verwijder je de naald van de spuit en maak je het hele ademhalingsapparaat los. Plaats longen, hart, enz. direct in formaline, omdat extra trimmen van weefsel na fixatie kan worden gedaan.
- Volledige verwerking, inbedding, sectie van weefsel en hematoxyline en eosine (H & E) kleuring met behulp van standaardmethoden.
- Nadat goedgekeurde euthanasieprocedures (bijv. koolstofdioxide bij 30 - 70% verplaatsing van het kamervolume / min) worden gevolgd, bevestigt u het muizenkarkas met pinnen aan een ontleedbord. Spray of breng 70% ethanol aan om de vacht van de muis uit de weg te houden tijdens de dissectie.
- Analyse van gemetastaseerde longtumorbelasting
- Scan H&E-gekleurde longsecties op een diascanner met hoge resolutie bij een vergroting van 40x (figuur 3).
- Importeer afbeeldingen in beeldanalysesoftware (bijv. Visiopharm Image Analysis) voor kwantificering van longmetastasen.
OPMERKING: We raden nieuwe gebruikers aan om on-site of online training te krijgen om de beeldanalysesoftware te gebruiken. Tal van webinars zijn ook beschikbaar via de commerciële webpagina. - Selecteer de Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis-app in de app-bibliotheek van de software.
OPMERKING: Het doel van deze app is om longmetastasen op H & E-gekleurde dia's te labelen en te kwantificeren. Als onderdeel van de 10118 H&E Lung Metastasis App segmenteert de eerste beeldverwerkingsstap het longweefsel met de Tissue Detection App. De tweede beeldverwerkingsstap maakt gebruik van de Metastasis Detect App die de metastasen in het longweefsel identificeert. Metastasen worden geïdentificeerd via vorm samen met regio's die ofwel te misvormd, te rood of te schaars zijn om als metastasen te worden geïdentificeerd. - Pas de parameters die vorm en spaarzaamheid definiëren aan om het beste bij representatieve afbeeldingen te passen. Gesegmenteerde gebieden van tumormetastasen en normaal longweefsel kunnen worden weergegeven met behulp van verschillende kleurlabels voor elk weefseltype.
OPMERKING: In het geval dat de app metastasen niet nauwkeurig kan scheiden van normaal longweefsel, moet mogelijk een aangepaste app met behulp van het Visiopharm Decision Forest-programma worden geschreven zoals werd gedaan voor de experimenten (zie figuur 2 en figuur 3). Details voor het schrijven van een aangepast algoritme volgen hieronder. Ga anders verder met stap 2.2.9. - Open het Decision Forest-programma, dat werkt door meerdere klassen [d.w.z. longweefsel (niet-neoplastisch), metastasen, rode bloedcellen, epitheel en / of witruimte] te trainen op een gewenst beeld. In figuur 2 zijn tumormetastasen blauw, normaal weefsel is groen en bronchiolair epitheel is geel. Ook bevinden rode bloedcellen zich in rode en luchtruimtes in roze.
- Volg de gevraagde reeks ja- of nee-vragen om elke klas op de juiste manier te trainen voor een afbeelding. De nauwkeurigheid van het algoritme bepaalt het aantal ja/nee-vragen. Voor de analyse is het aangepaste algoritme /app geschreven met een nauwkeurigheid die is ingesteld op 50 (bereik 0-100).
- Pas functies voor elke klasse aan door filters toe te passen om te verscherpen, vervagen, sorteren op vorm, enz. om de nauwkeurigheid van het algoritme / app te verbeteren. Visiopharm bekijkt elke klasse via een of meerdere lenzen die bekend staan als Functies. Functies wijzigen de manier waarop de klasse de afbeelding ziet om bepaalde kleuren of intensiteiten naar voren te brengen.
OPMERKING: Voor het aangepaste algoritme worden metastasen van 8500 μm2 en hoger gelabeld en gemeten als metastasen. Dit verklaart de groottevariatie en metastasen die te klein zijn om te detecteren. Kleine misvormde gebieden en kleine gemetastaseerde gebieden onder 8500 μm2 werden opgenomen in de normale weefselkwantificering. - Sla de gewijzigde instellingen van de app of het aangepaste algoritme op en pas het algoritme / de app vervolgens toe op een hele set of reeks H & E-gekleurde weefsels.
- Exporteer ten slotte alle uitvoervariabelen, waaronder de variabelen die in tabel 1 zijn vermeld. Oppervlakte in micron in het kwadraat (μm2) kan worden gekwantificeerd voor elk weefseltype en percentages worden afgeleid van het totale netto weefseloppervlak van het monster (d.w.z. totaal weefsel minus luchtoppervlak).
- Bij het maken van een aangepast algoritme, bekijk weefselmarkeringen in overleg met een veterinaire patholoog-gecertificeerd door het American College of Veterinary Pathologists om nauwkeurige metingen te garanderen en onderscheid te maken tussen weefseltypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij gebruik van niet-gelabelde cellen voor staartaderinjectie kan het moeilijk zijn om longkolonisatie te bevestigen tot (1) het tijdstip van obductie als macrometastasen kunnen worden waargenomen of (2) na histologische analyse als er microscopische metastasen bestaan. Met uitgebreide uitgezaaide longtumorbelasting zullen muizen moeizaam ademhalen. Zoals bij elk tumoronderzoek, moeten muizen zorgvuldig worden gecontroleerd gedurende de hele duur van het onderzoek. Het gebruik van gelabelde cellen is een eenvoudige manier om succesvolle staartaderinjectie te bevestigen; vandaar het gebruik van luciferase-gelabelde MDA-MB-231 cellen in de demonstratie. In vivo beeldvorming is echter niet altijd mogelijk of noodzakelijk, afhankelijk van het experimentele ontwerp en andere factoren. Figuur 1A toont het bioluminescentiesignaal in de thoracale ruimte minder dan 2 uur na staartaderinjectie van luciferase-gelabelde MDA-MB-231-cellen als bevestiging van nauwkeurige injectie. Voor dit experiment neemt het aantal fotonen in het thoracale gebied in de loop van de tijd toe en is er een sterk bioluminescentiesignaal aanwezig op dag 24 na injectie (figuur 1B en C; let op de verandering in schaalbalk). Op het moment van obductie werden veel macroscopische longlaesies waargenomen bij deze muizen (figuur 1D).
Na de juiste weefselverwerking en kleuring kunnen H & E-gekleurde longsecties worden gescand of in beeld gebracht. Gemetastaseerde longtumorbelasting kwantificering kan effectief worden bereikt met behulp van beeldanalysesoftware en een aangepast algoritme. Met behulp van het aangepaste algoritme wordt het hele longweefsel gesegmenteerd door verschillende weefselkenmerken (figuur 2A en B). Door het longweefsel op deze manier te segmenteren, kan de software de verschillende parameters in tabel 1 kwantificeren. Deze analyse is uitgevoerd op longweefsel van muizen geïnjecteerd met MDA-MB-231-cellen, gevolgd door behandeling met een medicijn dat is ontworpen om gemetastaseerde kolonisatie of een voertuigcontrole (DMSO) te blokkeren. De ruwe gegevens van deze analyse zijn weergegeven in tabel 2. Bovendien toont figuur 3A representatieve H&E-beelden van MDA-MB-231 longmetastasen van DMSO of met geneesmiddelen behandelde muizen. Hoewel een verschil in gemetastaseerde tumorbelasting tussen deze behandelingsgroepen gemakkelijk over het hoofd kan zijn gezien, omdat het totale aantal longknobbels niet anders is, wijst een uitgebreide analyse van alle parameters op een significant verschil in het procentuele netto longmetastasegebied (figuur 3B, C). Dit onderstreept de noodzaak van een uitgebreide en grondige aanpak om gemetastaseerde longtumorbelasting te analyseren, zoals de hierin beschreven methode.
Voor de gegevens in figuur 3 werden alle statistische analyses uitgevoerd met GraphPad Prism 7. Gegevens werden beschouwd als normaal verdeeld na het slagen voor een van de volgende standaard normaliteitstests: D'Agostino-Pearson omnibus, Shapiro-Wilk en Kolmogorov-Smirnov. Vergelijking tussen de voertuig- en met drugs behandelde groepen (figuur 3) werd gedaan door middel van ongepaarde tweezijdige Student's t-test. De statistische significantie werd vastgesteld op P ≤ 0,05.
Figuur 1: In vivo bioluminescentie bevestiging van succesvolle staartaderinjectie.
(A) Representatief bioluminescentiesignaal bij muizen 1 uur na staartaderinjectie van luciferase-gelabelde MDA-MB-231-cellen. (B) Representatief bioluminescentiesignaal in dezelfde groep muizen als (A) 24 dagen na staartaderinjectie van luciferase-gelabelde MDA-MB-231-cellen. [Let op de verandering in de schaalbalk tussen (A) en (B)]. (C) Kwantificering van fotonentellingen in de loop van de tijd in MDA-MB-231 staartader geïnjecteerde muizen. Foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. (n = 8 muizen) (D) Representatief niet-tumordragend longweefsel (rechts) en MDA-MB-231 macrometastasen in de longen (links) op het moment van obductie. Schaalbalken = 50 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Weefselsegmentatie met Visiopharm-software.
(A) Representatieve snips van ongesegmenteerde en gesegmenteerde weefselmarkeringen met behulp van het aangepaste softwarealgoritme. (B) Legenda voor alle weefselcategorieën gesegmenteerd met behulp van software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve gemetastaseerde longtumorbelastingsanalyse van H&E-gekleurde weefsels.
(A) Representatieve H&E-kleuring van longweefsel van niet-geïnjecteerde muizen en controle (DMSO) en met geneesmiddelen behandelde muizen na staartaderinjectie van MDA-MB-231-cellen. Representatieve tumormetastasen worden aangegeven met pijlen. Schaalbalken = 500 μm voor 4x vergroting en 200 μm voor 10x vergroting. (B) Grafiek van procent netto longmetastasegebied van controle en met geneesmiddelen behandelde muizen. Foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD. (*) P = 0,022 door de t-test van student. (C) Tabel met een samenvatting van de analyse van de gemetastaseerde longtumorbelasting (n = 9 DMSO; n = 9 met geneesmiddelen behandelde). Na controle op normale verdeling van gegevens, werden alle P-waarden in de tabel bepaald door middel van ongepaarde, tweezijdige Student's t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Parameter | Beschrijving | |
| Totale weefseloppervlakte (μm2) | Gebied in vierkante micron inclusief alle tumormetastasen, normale longen en gebieden van rode bloedcellen. | |
| Metastase Count | Totaal aantal metastasen in het longweefsel. | |
| Metastase oppervlaktepercentage (μm2) | Totaal metastasegebied gedeeld door netto weefseloppervlak x 100. | |
| Totaal weefsel + witruimte (μm2) | Oppervlakte in vierkante microns inclusief alle weefsel en witruimte. | |
| Netto weefseloppervlak (μm2) | Weefselgebied in vierkante microns (mets en normale long) zonder witte ruimte en rode bloedcellen. | |
| Totale metastase oppervlakte (μm2) | Totale metastaseoppervlakte in vierkante micron zoals gesegmenteerd door de beschikking Forest algorithim. | |
| Gemiddeld metastasegebied (μm2) | Gemiddelde (gemiddelde) oppervlakte in vierkante micron van metastasen binnen elk beeld. | |
| Mediaan metastasegebied (μm2) | Mediaan metastasegebied in vierkante micron. Een gelijk aantal metastasen valt onder deze waarde en een gelijk aantal metastasen is groter dan de mediane waarde. | |
Tabel 1: Parameters gemeten met software. Lijst met parameters samen met een beschrijving van elke meting die wordt berekend met behulp van het aangepaste algoritme.
| Glijden | Metastase Count | Metastase oppervlaktepercentage (μm2) | Totaal weefsel + witruimte (μm2) | Totale witruimte (μm2) | Netto weefseloppervlak (μm2) | Totale metastase oppervlakte (μm2) | Rode bloedcellen gebied (μm2) | Gemiddeld metastasegebied (μm2) | Mediaan metastasegebied (μm2) |
| 171 Long slide 1 | 435 | 8.90 | 185698000 | 83201800 | 92031400 | 8189250 | 10464800 | 18825.86 | 14748.73 |
| 171 Long slide 2 | 323 | 8.37 | 185698000 | 83201800 | 92054740 | 7708990 | 10441460 | 23866.84 | 14748.73 |
| 172 Long slide 1 | 151 | 2.73 | 181546000 | 89509904 | 81571296 | 2225220 | 10464800 | 14736.56 | 12486.37 |
| 172 Long slide 2 | 142 | 2.60 | 170708000 | 81735504 | 80558196 | 2093040 | 8414300 | 14739.72 | 12119.62 |
| 173 Long slide 1 | 634 | 11.60 | 234104992 | 102153000 | 115606692 | 13406800 | 16345300 | 21146.37 | 15472.22 |
| 173 Long slide 2 | 667 | 12.70 | 223180992 | 86778600 | 122374592 | 15542700 | 14027800 | 23302.40 | 16531.00 |
| 174 Long slide 1 | 40 | 0.55 | 192452992 | 80340896 | 87591096 | 485121 | 24521000 | 12128.03 | 10484.05 |
| 174 Long slide 2 | 34 | 0.51 | 183918000 | 71287904 | 91242796 | 464830 | 21387300 | 13671.47 | 11181.81 |
| 175 Long slide 1 | 780 | 23.93 | 179544992 | 44799200 | 126995782 | 30388600 | 7750010 | 38959.74 | 19307.76 |
| 175 Long slide 2 | 1001 | 12.58 | 169191536 | 43425608 | 120610754 | 15169100 | 5155174 | 15153.95 | 19703.08 |
| 188 Long slide 1 | 569 | 13.20 | 162290000 | 54210000 | 98486310 | 12997300 | 9593690 | 22842.36 | 14463.91 |
| 188 Long slide 2 | 271 | 5.15 | 157146000 | 54250800 | 91996500 | 4738100 | 10898700 | 17483.76 | 12657.83 |
| 189 Long slide 1 | 74 | 1.70 | 185292992 | 95700800 | 77779392 | 1318820 | 11812800 | 17821.89 | 14551.08 |
| 189 Long slide 2 | 74 | 1.76 | 182272992 | 95700800 | 74759392 | 1318820 | 11812800 | 17821.89 | 14551.08 |
| 816 Long slide 1 | 246 | 5.65 | 185876000 | 87568896 | 81916204 | 4631050 | 16390900 | 18825.41 | 14371.99 |
| 816 Long slide 2 | 565 | 6.05 | 183220000 | 76954304 | 90305396 | 5462670 | 15960300 | 9668.44 | 14244.82 |
| 876 Long slide 1 | 468 | 10.36 | 208308000 | 99300096 | 100947064 | 10454500 | 8060840 | 22338.68 | 16011.37 |
| 876 Long slide 2 | 528 | 11.74 | 199750896 | 81642568 | 110450391 | 12963400 | 7657937 | 24551.89 | 16699.13 |
| 877 Long slide 1 | 732 | 17.98 | 219340992 | 99918600 | 107869992 | 19397100 | 11552400 | 26498.77 | 18137.52 |
| 877 Long slide 2 | 605 | 14.64 | 207925504 | 88539712 | 108168329 | 15839700 | 11217463 | 26181.32 | 18014.64 |
| 878 Long slide 1 | 377 | 10.05 | 178534000 | 85610896 | 81931104 | 8232340 | 10992000 | 21836.45 | 16671.03 |
| 878 Long slide 2 | 376 | 9.88 | 170544000 | 75337904 | 86108406 | 8511710 | 9097690 | 22637.53 | 16754.38 |
| 879 Long slide 1 | 205 | 5.22 | 167556000 | 89999000 | 68123630 | 3553860 | 9433370 | 17335.90 | 13845.69 |
| 879 Long slide 2 | 213 | 4.64 | 167931008 | 80789400 | 78489588 | 3638720 | 8652020 | 17083.19 | 14058.12 |
| 881 Long slide 1 | 1122 | 38.81 | 218880000 | 79713504 | 130893816 | 50802300 | 8272680 | 45278.34 | 22044.99 |
| 881 Long slide 2 | 628 | 21.67 | 184200992 | 74502600 | 99122692 | 21475200 | 10575700 | 34196.18 | 19857.40 |
| 882 Long slide 1 | 678 | 24.05 | 194476992 | 83941904 | 98484788 | 23684500 | 12050300 | 34932.89 | 20748.06 |
| 882 Long slide 2 | 645 | 21.93 | 185537040 | 75790040 | 101412430 | 22241700 | 8334570 | 34483.26 | 20325.11 |
| 883 Long slide 1 | 429 | 10.79 | 179400992 | 84955696 | 84699866 | 9138800 | 9745430 | 21302.56 | 15080.23 |
| 883 Long slide 2 | 342 | 85.30 | 175220992 | 76210896 | 90472386 | 77170200 | 8537710 | 225643.86 | 17078.26 |
| 884 Long slide 1 | 359 | 6.42 | 206751008 | 87752600 | 103825008 | 6669710 | 15173400 | 18578.58 | 14333.41 |
| 884 Long slide 2 | 480 | 9.12 | 200990000 | 77052496 | 111060804 | 10125700 | 12876700 | 21095.21 | 15679.88 |
| 885 Long slide 1 | 332 | 7.79 | 191398000 | 92896304 | 84752596 | 6605490 | 13749100 | 19896.05 | 14500.11 |
| 885 Long slide 2 | 537 | 81.02 | 187475008 | 85938000 | 89378408 | 72411104 | 12158600 | 134843.77 | 15360.29 |
| 886 Long slide 1 | 305 | 7.93 | 158435008 | 80433296 | 76541662 | 6068720 | 1460050 | 19897.44 | 14500.11 |
| 886 Long slide 2 | 898 | 8.84 | 155460000 | 70808600 | 83457470 | 7380490 | 1193930 | 8218.81 | 14744.92 |
Tabel 2: Representatieve tabel met resultaten. Tabel met resultaten voor elke parameter van het algoritme van een cohort muizenstaartader geïnjecteerd met MDA-MB-231 cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omdat onderzoekers intraveneuze injectie van tumorcellen blijven gebruiken als een experimenteel model voor metastase, ontbreken standaardpraktijken om de resulterende gemetastaseerde tumorbelasting te analyseren. In sommige gevallen kunnen significante verschillen in gemetastaseerde tumorbelasting bij manipulatie van bepaalde cellijnen en/of gebruik van chemische verbindingen macroscopisch worden waargenomen. In andere gevallen kunnen subtiele verschillen in gemetastaseerde zaaiing en groei echter over het hoofd worden gezien of verkeerd worden geïnterpreteerd zonder grondige pathologische analyse. Deze studie bevordert eerder gepubliceerde staartaderinjectieprotocollen door een uitgebreide methode van metastatische longtumorbelastingsanalyse op te nemen. Belangrijk is dat deze methode van digitale pathologie-analyse ook kan worden toegepast op de kwantificering van long gemetastaseerde tumorbelasting na orthotopische injectie van tumorcellen die in staat zijn tot spontane metastase, evenals andere experimentele metastasemodellen (d.w.z. intracardiaal, enz.) en patiënt-afgeleide xenograft (PDX) modellen. Het gebruik van digitale beeldvorming en software-algoritmeontwikkeling door veterinaire pathologen zorgt voor de reproduceerbaarheid, nauwkeurigheid en grondigheid van deze aanpak om de uitgezaaide longtumorbelasting te analyseren25.
Doordachte beslissing van cellijnen, celconcentratie en eindpunten op basis van eerder gepubliceerde studies of zorgvuldige experimentele optimalisatie is absoluut noodzakelijk. Aangezien gemetastaseerd zaaien en koloniseren sterk afhankelijk zijn van interacties met verschillende immuuncelpopulaties26,27, is het gebruik van immuun-competente muizen ideaal, hoewel niet altijd haalbaar. Om dezelfde reden moet de interpretatie van experimentele metastasestudies met athymische of NSG-muizen, die belangrijke immuuncelcomponenten missen, met de nodige voorzichtigheid worden genomen. Er zijn verschillende borsttumorcellijnen van muizen, waaronder de MVT1-cellen die in deze studie worden gebruikt, die zijn afgeleid van de FVB / N-muizenstam22,28,29. Er bestaan ook andere syngenetische modellen. Met betrekking tot celconcentratie kan injectie van een groot aantal cellen de uitgezaaide longtumorbelasting aanzienlijk versnellen en verbeteren. Als de longen echter overweldigd zijn, kan het moeilijk zijn om individuele gemetastaseerde foci te onderscheiden en emboli zijn waarschijnlijker. Ook vereist de staartaderinjectieprocedure voldoende oefening en training voordat veilig en / of routinematig injecties worden uitgevoerd. Veel instellingen bieden technische training aan en kunnen muizen leveren voor oefendoeleinden. Een goede plaatsing van de naald en een soepele injectie moeten wijzen op succes; voor trainings- / oefendoeleinden kan Evans Blue-kleurstof echter worden gebruikt om een succesvolle injectie te helpen bepalen (1% in steriele PBS). De ledematen van de muis worden kort na de injectie blauw, maar het dier moet daarna worden geëuthanaseerd.
Bovendien kan het belang van standaard obductie- en weefselbemonsteringstechnieken om diaartefacten te controleren en te voorkomen die het scannen en analyseren van dia's door de beeldanalysesoftware kunnen belemmeren, niet genoeg worden benadrukt. Inflatie van de longen op het moment van obductie is een cruciale stap in het handhaven van de weefselintegriteit en verbetert de daaropvolgende H & E-kleuring en de uiteindelijke analyse. Voor consistentie met resolutie en reproduceerbaarheid wordt aanbevolen dat alle dia's in een studieset met hetzelfde doel worden gescand. In deze studie werden alle dia's 40x gescand om de nauwkeurigheid van algoritme-instellingen en de juiste identificatie van tumormetastasen te garanderen wanneer ze werden toegepast op geanalyseerde velden. Voor elke dia werden consequent dezelfde longlobben gescand en geanalyseerd voor elke muis. Het wordt ook sterk aanbevolen dat een patholoog weefselmarkeringen beoordeelt op nauwkeurigheid van het toegepaste algoritme en dat hetzelfde algoritme wordt toegepast op elke dia in een onderzoek.
Het gepresenteerde protocol kan worden aangepast aan het experimentele ontwerp, de voorkeuren van de gebruiker en de gewenste uitkomstmetingen. Een dergelijke wijziging omvat het gebruik van een anesthesie-inductiekamer in plaats van een conventioneel fixatieapparaat voor een bewust dier. Op het gebied van diergezondheid en dierenwelzijn is geen van beide benaderingen superieur aan de andere en elk heeft zijn eigen reeks voordelen en beperkingen30. Ook voor zwarte of bruine muizen kan een lichtbron of verwarmingsapparaat nodig zijn om de staartaders te visualiseren. Infraroodlampen of een warmwaterbad kunnen worden gebruikt om de aderen te verwijden. De temperatuur moet echter zorgvuldig worden gecontroleerd. Bovendien zijn er verlichte beveiligingssystemen beschikbaar, evenals andere commerciële versies van knaagdierbeveiligingssystemen. Sommige onderzoekers geven de voorkeur aan Luer-Lok-spuiten voor injecties. We vinden het moeilijker om luchtbellen te elimineren met Luer-Lok spuiten, maar het is een kwestie van voorkeur. De levensvatbaarheid van cellen is een belangrijke overweging voor de staartaderinjectieprocedure en daarom zijn nauwkeurige celtellingen en het onderhouden van cellen op ijs voorafgaand aan injectie noodzakelijke stappen. Bij het vergelijken van longzaaien en kolonisatie van gemanipuleerde cellijnen, is het van cruciaal belang om eventuele verschillen in celgrootte en levensvatbaarheid voorafgaand aan injectie te bepalen, omdat deze de interpretatie van de resultaten kunnen bemoeilijken. Celdood en/of schade kan optreden bij gebruik van een smalspoornaald; het wordt echter niet aanbevolen om een naald groter dan 25 G te gebruiken, omdat dit pijn en ongemak voor het dier kan veroorzaken.
Als een manier om te valideren dat longlaesies worden gevormd door geïnjecteerde tumorcellen, kan immunostaining worden gedaan op weefselsecties. Bij gebruik van menselijke cellijnen kunnen mensspecifieke antilichamen worden gebruikt om gemetastaseerde laesies te onderscheiden. Als alternatief, als u gelabelde cellijnen gebruikt (bijv. GFP), kunnen overeenkomstige antilichamen worden gebruikt. Ook zijn veel borstkankercellijnen positief voor epitheliale markers (d.w.z. cytokeratinen, E-cadherine en EpCAM), maar voorkennis van expressie is essentieel. Het longepitheel dat de luchtwegen bekleedt, zal echter ook positief zijn voor deze markers en dus moet ook rekening worden gehouden met de structuur. Er kunnen gevallen zijn waarin de ontwikkeling van primaire longtumoren moet worden uitgesloten. Om dit te doen, kan immunohistochemische kleuring voor thyroid transcription factor-1 (TTF1) worden gebruikt als een marker van primair longadenocarcinoom. TTF1-kleuring moet worden geëvalueerd door een gecertificeerde patholoog.
Hierin werd een aangepast algoritme geschreven met behulp van een Decision Forest-classificatiealgoritme omdat het gevestigde longmetastase-algoritme niet kon worden afgestemd voor nauwkeurige detectie van metastasen die in grootte varieerden. Dit aangepaste algoritme maakt complexe metingen mogelijk, maakt nauwkeurige segmentatie van metastasen op grootte mogelijk en ondersteunt een maatafsnijding zodat kleine misvormde gebieden en normale structuren niet verkeerd worden geïnterpreteerd en daarom kunnen worden opgenomen in de uiteindelijke dataset. We verwachten dat dit algoritme van toepassing zal zijn op de meeste in vivo longmetastasestudies, maar gebruikers moeten mogelijk instellingen binnen de software aanpassen aan hun individuele onderzoeksbehoeften. Dit algoritme dient echter als een platform voor onderzoekers die de longmetastatische belasting op een vergelijkbare manier willen analyseren. Er zijn veel verschillende opties voor beeldanalyseplatforms waarbij toegang of beschikbaarheid, kosten en training, evenals het ervaringsniveau het beste platform kunnen dicteren om te gebruiken36. Het scala aan opties omvat gratis platforms zoals QuPath en duurdere, maar geavanceerde platforms, zoals Visiopharm. Het wordt geadviseerd om een beeldanalyse pathologie kern en patholoog te raadplegen bij het beslissen welk platform beschikbaar en het best gebruikt kan worden voor een bepaald onderzoeksproject.
Spontane muis borsttumormodellen (bijv. MMTV-PyMT) of orthotopische borstvetkusseninjectiemethoden vertegenwoordigen het meest fysiologisch relevante model voor het bestuderen van longmetastase. Een ernstig nadeel van het staartaderinjectiemodel is dat het niet de volledige gemetastaseerde cascade samenvat en daarom beperkt is tot de studie van tumorcelexvasatie en secundaire orgaankolonisatie. Dit experimentele metastasemodel is echter relevant voor borstkankeronderzoek, omdat longmetastasen gevormd na staartaderinjectie genomische profielen hebben die vergelijkbaar zijn met gemetastaseerde laesies die zich ontwikkelen na orthotopische implantatie van dezelfde cellen31. Om een longmetastasemodel vast te stellen, wordt vaak een groot aantal cellen intraveneus geïnjecteerd, wat mogelijk niet nauwkeurig het proces van metastase weergeeft, omdat het betrekking heeft op zaaien, immuunreactie en rust. Ook komen longmetastasen op basis van de bloedsomloop het meest voor bij staartaderinjectie32. Bij de meeste borstkankercellijnen wijzen gepubliceerde rapporten op een relatief lage incidentie van bot-, lever- of hersenmetastasen na staartaderinjectie7. Alternatieve experimentele metastasemethoden zoals intracardiale, intratibiale, poortader- en intracarotide-injecties zijn geschikter voor het onderzoeken van metastasen naar andere plaatsen33,34,35,36,37. Nogmaals, spontane borsttumormodellen of orthotopische vetkusseninjectiemethoden die alle stappen van de metastatische cascade samenvatten, hebben de voorkeur. Problemen met consistente gemetastaseerde tumorbelasting, duur van het onderzoek en het aantal dieren dat nodig is voor dergelijke studies zijn een nadeel. De hier gepresenteerde methode van digitale pathologie-analyse kan echter worden toegepast op longmetastasen die worden gevormd door elk spontaan of experimenteel metastasemodel.
De analysemethode levert ook bepaalde beperkingen op, zoals subjectiviteit bij het maken van algoritmen. Hoewel beeldvorming van hele dia's digitale analyse mogelijk maakt op een hele weefselsectie en op alle longlobben van een enkele muis, is het beperkt tot een tweedimensionale analyse van een 3D-weefsel. Stereologie wordt een gangbare praktijk die 3D-informatie verkrijgt voor beeldanalyse en rekening kan houden met factoren zoals weefselkrimp die optreedt tijdens weefselverwerking38. Stereologie heeft echter zijn eigen beperkingen, zoals weefsel-, middelen- en tijdsbeperkingen.
Gezien het aantal kankerpatiënten dat wordt getroffen door gemetastaseerde verspreiding van hun ziekte, zal de staartaderinjectiemethode om metastase te bestuderen een nuttig hulpmiddel blijven in termen van het begrijpen van de gecompliceerde biologie van gemetastaseerde verspreiding en bij het bepalen van de preklinische werkzaamheid van nieuwe therapieën. In vivo muismodellen van metastase, met name die met immuun-competente dieren, worden nog belangrijker voor kankeronderzoek gezien de wijdverspreide interesse in immunotherapie29. Ook zijn experimentele metastasemodellen van cruciaal belang in termen van het onderzoeken van metastasesuppressorgenen (d.w.z. genen die het gemetastaseerde potentieel van kankercellen onderdrukken zonder de primaire tumorgroei te beïnvloeden), en daarom blijven ze een waardevol onderzoeksinstrument.
Digitale beeldvorming en dia-analyse zijn snel een steunpilaar geworden in diagnostische en experimentele muismodellering39. Het gebruik van het type benadering dat hierin wordt beschreven om de longmetastasische tumorbelasting te analyseren, zal analyses met een hoge doorvoer op een uitgebreidere en nauwkeurigere manier mogelijk maken. Bovendien biedt digitale beeldvormingspathologie een mogelijkheid voor meer collaboratieve onderzoeksprojecten met pathologen die gespecialiseerd zijn in gebieden zoals muismodellen van borstkankermetastase. Naarmate multiplexweefselbeeldvormingsmethoden en 3D-beeldvormingstechnologieën (zoals hierboven vermeld) verder worden ontwikkeld, zullen digitale beeldvormingspathologie, geavanceerde softwareprogramma's voor beeldanalyse en de expertise van pathologen zeker nodig zijn voor het bevorderen van metastaseonderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Representatieve gegevens werden gefinancierd door het National Cancer Institute (K22CA218549 tot S.T.S). Naast hun hulp bij het ontwikkelen van de uitgebreide analysemethode die hierin wordt gerapporteerd, bedanken we de Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Directeur - Krista La Perle, DVM, PhD) voor histologie en immunohistochemiediensten en de Pathology Imaging Core voor de ontwikkeling en analyse van algoritmen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alcohol prep pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | for cleaning tail prior to injection |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | for mouse dissection and lung tissue inflation |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013CV | cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Fisher Scientific | MT21030CV | used for resuspending tumor cells for injection |
| ethanol (70 % solution) | OSU | used to minimize mouse's fur during dissection; use caution - flammable | |
| Evan's blue dye | Millipore Sigma | E2129 | used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | F4135 | cell culture media additive; used at 10% in DMEM |
| forceps | Fisher Scientific | 10-270 | for dissection and lung tissue inflation |
| FVB/NJ mice | The Jackson Laboratory | 001800 | syngeneic mouse strain for MVT1 cells |
| hemacytometer (Bright-Line) | Millipore Sigma | Z359629 | for use in cell culture to obtain cell counts |
| insulin syringe (28 G) | Fisher Scientific | 14-829-1B | for tail-vein injections (BD 329424) |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | human breast cancer cell line | |
| MVT1 cells | mouse mammary tumor cells | ||
| needles (26 G) | Fisher Scientific | 14-826-15 | used to inflate the mouse's lungs |
| neutral buffered formalin (10%) | Fisher Scientific | 245685 | used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource |
| Penicillin Streptomycin 100x | ThermoFisher | 15140163 | cell culture media additive |
| sterile gauze | Fisher Scientific | NC9379092 | for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs |
| syringe (5 mL) | Fisher Scientific | 14-955-458 | used to inflate mouse lung tissue |
| tail-vein restrainer | Braintree Scientific, Inc. | TV-150 STD | used to restrain mouse for tail-vein injections |
| Trypan blue (0.4 %) | ThermoFisher | 15250061 | used in cell culture to assess viability |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | ThermoFisher | 25200-114 | used in cell culture to detach tumor cells from plate |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews: Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Steeg, P. S.
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nature Medicine. 12 (8), 895-904 (2006).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Eckhardt, B. L., Francis, P. A., Parker, B. S., Anderson, R. L. Strategies for the discovery and development of therapies for metastatic breast cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (6), 479-497 (2012).
- Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Schoenenberger, C. A., et al. Targeted c-myc gene expression in mammary glands of transgenic mice induces mammary tumours with constitutive milk protein gene transcription. EMBO Journal. 7 (1), 169-175 (1988).
- Nusse, R., Varmus, H. E. Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell. 31 (1), 99-109 (1982).
- Muller, W. J., Sinn, E., Pattengale, P. K., Wallace, R., Leder, P. Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene. Cell. 54 (1), 105-115 (1988).
- Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. American Journal of Pathology. 163 (5), 2113-2126 (2003).
- Green, J. E., et al. The C3(1)/SV40 T-antigen transgenic mouse model of mammary cancer: ductal epithelial cell targeting with multistage progression to carcinoma. Oncogene. 19 (1), 1020-1027 (2000).
- Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PloS One. 7 (10), 47995 (2012).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (3), 443-447 (2010).
- Mariotto, A. B., Etzioni, R., Hurlbert, M., Penberthy, L., Mayer, M. Estimation of the Number of Women Living with Metastatic Breast Cancer in the United States. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 26 (6), 809-815 (2017).
- Xiao, W., et al. Risk factors and survival outcomes in patients with breast cancer and lung metastasis: a population-based study. Cancer Medicine. 7 (3), 922-930 (2018).
- Smid, M., et al. Subtypes of breast cancer show preferential site of relapse. Cancer Research. 68 (9), 3108-3114 (2008).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Soni, A., et al. Breast cancer subtypes predispose the site of distant metastases. American Journal of Clinical Pathology. 143 (4), 471-478 (2015).
- Leone, B. A., et al. Prognostic impact of metastatic pattern in stage IV breast cancer at initial diagnosis. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (3), 537-548 (2017).
- Pei, X. F., et al. Explant-cell culture of primary mammary tumors from MMTV-c-Myc transgenic mice. In Vitro Cellular and Developmental Biology: Animal. 40 (1-2), 14-21 (2004).
- Mathsyaraja, H., et al. CSF1-ETS2-induced microRNA in myeloid cells promote metastatic tumor growth. Oncogene. 34 (28), 3651-3661 (2015).
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
- La Perle, K. M. D. Comparative Pathologists: Ultimate Control Freaks Seeking Validation. Veterinary Pathology. 56 (1), 19-23 (2019).
- Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes and Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
- Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical and Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
- Yang, Y., et al. Immunocompetent mouse allograft models for development of therapies to target breast cancer metastasis. Oncotarget. 8 (19), 30621-30643 (2017).
- Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia. Laboratory Animals. 53 (2), 190-201 (2019).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 75 (4), 344-355 (2009).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).
- Simmons, J. K., et al.
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
- Brown, D. L. Practical Stereology Applications for the Pathologist. Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).
- Aeffner, F., et al. Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).
Tags
Kankeronderzoek Nummer 159 staartaderinjectie borstkanker longmetastasen H & E-gekleurde secties kwantitatieve digitale pathologie beeldanalyseErratum
Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.
The author list was updated from:
Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
to:
Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
