Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Patologisk analyse af lungemetasase Efter Lateral Hale-Vene Injektion af tumorceller

Published: May 20, 2020 doi: 10.3791/61270
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center, 2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

ERRATUM NOTICE

Summary

Intravenøs injektion af kræftceller bruges ofte i metastaserforskning, men den metastatiske tumorbyrde kan være vanskelig at analysere. Heri demonstrerer vi en hale-vene injektion model af metastaser og omfatter en ny tilgang til at analysere den resulterende metastatiske lungetumor byrde.

Abstract

Metastaser, den primære årsag til sygelighed og dødelighed for de fleste kræftpatienter, kan være udfordrende at modellere præklinisk i mus. Få spontane metastaser modeller er tilgængelige. Således er den eksperimentelle metastasemodel, der involverer haleåreindsprøjtning af egnede cellelinjer, en grundpille i metastaseforskning. Når kræftceller injiceres i den laterale hale-vene, lungen er deres foretrukne sted for kolonisering. En potentiel begrænsning af denne teknik er den nøjagtige kvantificering af den metastatiske lungetumor byrde. Mens nogle efterforskere tæller makrometastaser af en foruddefineret størrelse og / eller omfatter mikromekanikaer efter afsnit af væv, andre bestemme området af metastatiske læsioner i forhold til normale vævsområde. Begge disse kvantificeringsmetoder kan være yderst vanskelige, når den metastatiske byrde er høj. Heri demonstrerer vi en intravenøs injektionsmodel af lungemetastase efterfulgt af en avanceret metode til kvantificering af metastatisk tumorbyrde ved hjælp af billedanalysesoftware. Denne proces giver mulighed for undersøgelse af flere slutpunktsparametre, herunder gennemsnitlig metastasestørrelse, det samlede antal metastaser og det samlede metastaseområde for at give en omfattende analyse. Desuden er denne metode blevet gennemgået af en veterinær patolog bord-certificeret af American College of Veterinary Patologer (SEK) for at sikre nøjagtighed.

Introduction

På trods af at være en meget kompleks og ineffektiv proces1, metastaser er en betydelig bidragyder til sygelighed og dødelighed af kræftpatienter2. Faktisk tilskrives de fleste kræftrelaterede dødsfald metastatisk spredning af sygdom3,4. For at tumorceller med succes kan metastasere, skal de løsne sig fra det primære sted, invadere gennem tilstødende stroma, intravasere i blodcirkulationen eller lymfeknuderne, rejse til kapillærbunden på et sekundært sted, ekstravasere ind i det sekundære væv og formere sig eller vokse til at danne metastatiske læsioner5. Brugen af musemodeller har været afgørende for at fremme forståelsen af de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for metastatisk såning og vækst6,7. Heri fokuserer vi på brystkræftmetase, som både genetisk modificerede musemodeller og metoder til transplantation ofte anvendes til – hver med deres eget sæt af fordele og begrænsninger.

Genetisk manipulerede brystsvulstmodeller gør brug af brystkirtlen specifikke initiativtagere, herunder MMTV-LTR (mus mammary tumor virus lang terminal gentage) og WAP (Whey Acidic Protein), at drive udtryk for transgeners i bryst epitel8. Onkogener, herunder polyoma midten T antigen (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1, og simian virus 40 (SV40) er blevet udtrykt på denne måde9,10,11,12,13, og mens disse genetiske modeller er nyttige til at studere primær tumor indledning og progression, få let metastasere til fjerne organer. Desuden er disse genetiske musemodeller ofte mere tid og omkostninger uoverkommelige end spontane eller eksperimentelle metastasermodeller. I betragtning af begrænsningen af de fleste genetisk manipulerede brystsvulstmodeller til at studere metastaser er transplantationsteknikker blevet attraktive metoder til at studere denne komplekse proces. Dette omfatter ortotopisk, hale-vene, intra hjerte, og intrakraniel injektion af egnede cellelinjer.

Selv om flere brystkræft cellelinjer let metastasere efter ortotopisk injektion i bryst fedt pad14,15, konsistens og reproducerbarhed af metastatisk tumor byrde kan være en udfordring, og varigheden af sådanne undersøgelser kan være på rækkefølgen af flere måneder. Til evaluering af lungemetastase er især intravenøs injektion i halevenen ofte en mere reproducerbar og tidseffektiv metode med metastatisk spredning, der typisk forekommer inden for et par uger. Da den intravenøse injektionsmodel imidlertid omgår de første trin i den metastatiske kaskade, skal der udvises forsigtighed ved fortolkningen af resultaterne af disse undersøgelser. I denne demonstration viser vi haleåreindsprøjtning af brysttumorceller sammen med en nøjagtig og omfattende analysemetode.

Selv om forskersamfundet har gjort betydelige fremskridt med at forstå den komplekse proces med brystkræftmetase, anslås det, at over 150.000 kvinder i øjeblikket har metastatisk brystkræft16. Af dem med fase IV brystkræft, >36% af patienterne har lungemetastase17; Det stedspecifikke mønster og forekomsten af metastaser kan dog variere baseret på molekylær undertype18,19,20,21. Patienter med brystkræft-associerede lungemetastaser har en median overlevelse på kun 21 måneder fremhæver behovet for at identificere effektive behandlinger og nye biomarkører for denne sygdom17. Brugen af eksperimentelle metastaser modeller, herunder intravenøs injektion af tumorceller, vil fortsætte med at fremme vores viden om denne vigtige kliniske udfordring. Når det kombineres med digital billeddannelse patologi og metoden til metastatisk lungetumor byrde analyse beskrevet i denne protokol, hale-vene injektioner er et værdifuldt værktøj til brystkræft metastaser forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrebrug fulgte University Laboratory Animal Resources (ULAR) regler i henhold til OSU Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)-godkendt protokol 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore).

1. Hale-vene injektion af brystkræftceller

  1. Forberedelse af celler og sprøjte til injektion
    1. Plade et passende antal celler baseret på antallet af mus og cellekoncentration, der skal anvendes.
      BEMÆRK: Antallet af injicerede celler og tid til udvikling af metastaser vil afhænge af den anvendte cellelinje og skal optimeres. I denne demonstration injiceres 1 x 106 MDA-MB-231 celler intravenøst i NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mus, og makroskopiske lungelæsioner observeres senest 24 dage efter injektionen. For MVT1 murin mammary tumor celle linje17, 3 x 106 celler injiceres i immun-kompetente FVB /N mus med mange lunge metastaser observeret af 14 dage22,23.
    2. Aspirere medier og skyl celleplader med 1x PBS. Trypsinize celler i minimal volumen, tilføje passende volumen af medier, og tælle celler ved hjælp af et hæmatocytometer eller en anden foretrukken metode. Trypan blå (0,4%) eller andre levende / døde celle farvestoffer kan bruges til at bestemme levedygtige celletal.
    3. Pelletceller ved at dreje ved 180 x g i 5 min.
    4. Resuspend passende antal celler i sterile 1x PBS således, at et volumen på 100 μL injiceres pr. mus. Hold celleaffjedring på is for at opretholde levedygtigheden.
    5. Før injektionen skal celler genbruges grundigt med en 200 μL- eller 1 mL-pipette for at undgå klumpning. Der opstilles 100 μL i en insulinsprøjte på 28 G (se Materialetabel).
    6. Eliminer eventuelle luftbobler ved at holde sprøjten lodret, trykke på sprøjten og langsomt justere stemplet. Injektion af luftbobler i venen vil sandsynligvis forårsage en luft /gas emboli, der kan være dødelig.
  2. Lateral hale-vene injektion
    BEMÆRK: For eksperimentelle brystkræft metastaser assays, injektioner udføres på > 6 uger gamle hunmus.
    1. Håndter musen ved halen, og skub dyret ind i et slidset rør/fastholdelsesanordning af en passende størrelse (se materialetabellen for den anvendte fastholdelsesanordning).
    2. Sæt stikdelen af fastholdelsesanordningen og placer musen på siden, så dens laterale haleåre er let at se. Musen har en ventral arterie i overensstemmelse med kønsorganerne, en rygåre, og to laterale kaukasal vener.
    3. Rengør overfladen af musens hale med en aseptisk klud. Tag fat i halen mellem pegefinger og tommelfinger med ikke-dominerende hånd og påfør let spænding.
    4. Begyndende ved den distale del af halen, skal du indsætte nålen parallelt med venen med facet ender.
    5. Hvis det er tilladt, skal du forsigtigt opsummere nålen og bøje til en 20-30 ° vinkel. En enkelthånds tilgang eller nåle recapping enhed anbefales stærkt.
      BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at aspirere, da dette kan få venen til at kollapse. Men, en lille flash af blod kan ses, når først placeret. Nålen vil gå glat ind i venen med korrekt placering.
    6. Hæld langsomt det samlede volumen ud i venen. Der bør ikke være modstand, når stemplet skubbes.
    7. Hvis der mærkes modstand, skal sprøjtenålen straks fjernes. Hvis det er nødvendigt, skal du indsætte nålen igen (ideelt set ikke mere end 3 forsøg) bevæger sig mod den proksimale ende af halen eller modsatrettede laterale vene.
    8. En lille mængde blod vil sandsynligvis blive fortrængt efter injektion. Påfør blidt tryk med steril gaze og tør med aseptisk aftørring.
    9. Straks bortskaffe sprøjten i passende skarpe beholder.
    10. Returner musen til et rent, ventileret bur og skærm for tegn på nød.
    11. Overvåg mus 2-3x/ugentlig for tegn på metastaser dannelse (besværet vejrtrækning, forspændt kropsholdning, vægttab) og generel nød. Tiden til udvikling af metastaser vil afhænge af cellelinje og musestamme.
    12. Hvis du bruger en in vivo levende dyrebilleddannelsesenhed, er billedmus umiddelbart efter injektionen af halevene for at bekræfte vellykket injektion af celler og opnå tid "nul" data (specifikke detaljer om in vivo bioluminescensbilleddannelse er ikke inkluderet heri, men beskrives af Yang et al.24).

2. Lungevæv fiksering og analyse af metastatisk lungetumor byrde

  1. Lungevæv inflation for at opretholde det strukturelle format af lungerne for histopatologi
    1. Efter godkendte aktiv dødshjælpsprocedurer (f.eks. kuldioxid ved 30 -70% forskydning af kammervolumen/min) følges, skal musekroppen fastgøres til et dissekeringsbræt med stifter. Enten spray eller anvende 70% ethanol for at holde musens pels ud af vejen under dissektion.
      BEMÆRK: Kuldioxid kvælning kan forårsage lunge hemorhhage som en forventet baggrund læsion, især ved langsommere flowhastigheder.
    2. Åbn brystkassen med et midterlinje snit, udvid snittet cranially / caudally gennem bughinden, og skær væk mellemgulvet ved at gribe xyphoid processen.
    3. Brug et separat sæt saks til ikke at sløve knivene, skær ribbenene langs hver side af brystbenet og fjern forsigtigt brystkassen, så lungerne kan udvide sig.
    4. Isoler luftrøret ved at fjerne submandibulære spytkirtler og infrahyoid muskulatur. Placering af stifter på begge sider af luftrøret kan forhindre uønsket bevægelse under indsættelse af nålen.
    5. Fyld en 26 G sprøjte med 2-3 mL 10% neutral buffer formalin og sæt ind i luftrøret.
    6. Langsomt injicere formalin og se for lungerne til at udvide (normalt kræver ~ 1,5 mL af formalin).
    7. Når formalin begynder at lække ud af lungerne (undgå over inflation), klemme luftrøret med et par sammentrækninger, fjerne sprøjtenål og løsne hele åndedrætsapparatet. Placer lunger, hjerte, etc. direkte i formalin som yderligere trimning af væv kan gøres efter fiksering.
    8. Komplet behandling, indlejring, eskapsling af væv, og hæmatoxylin og eosin (H &E) farvning ved hjælp af standard metoder.
  2. Analyse af metastatisk lungetumor byrde
    1. Scan H&E-farvede lungesektioner på en diasscanner i høj opløsning ved 40x forstørrelse (figur 3).
    2. Importer billeder til billedanalysesoftware (f.eks. Visiopharm Image Analysis) til kvantificering af lungemetatastaser.
      BEMÆRK: Vi anbefaler, at nye brugere enten får onsite- eller onlinetræning for at bruge billedanalysesoftwaren. Talrige webinarer er også tilgængelige via den kommercielle webside.
    3. Vælg Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis App fra softwarens appbibliotek.
      BEMÆRK: Formålet med denne app er at mærke og kvantificere lungemetastase på H&E-farvede dias. Som en del af 10118 H&E Lung Metastasis App segmenterer det første billedbehandlingstrin lungevævet med Tissue Detection App. Det andet billedbehandlingstrin bruger Metastasis Detect App, som identificerer metastaserne inde i lungevævet. Metastaser identificeres via form sammen med områder, der enten er for for forformede, for røde eller for sparsomme til at blive identificeret som metastaser.
    4. Juster de parametre, der definerer form og sparsomhed, så de passer bedst til repræsentative billeder. Segmenterede områder af tumormetastaser og normalt lungevæv kan vises ved hjælp af forskellige farveetiketter for hver vævstype.
      BEMÆRK: I tilfælde af, at appen ikke kan adskille metastaser nøjagtigt fra normalt lungevæv, skal der muligvis skrives en brugerdefineret app ved hjælp af Visiopharm Decision Forest-programmet, som det blev gjort for forsøgene (se figur 2 og figur 3). Detaljer for at skrive en brugerdefineret algoritme følger nedenfor. Ellers skal du gå videre til trin 2.2.9.
    5. Åbn Decision Forest-programmet, som fungerer ved at træne flere klasser [dvs. lungevæv (ikke-neoplastisk), metastaser, røde blodlegemer, epitel og/eller blanktegn] på et ønsket billede. I figur 2 er tumormetastaser blå, normalt væv er grønt, og bronchiolar epitel er gult. Også røde blodlegemer er i røde og luftrum i pink.
    6. Følg den stillede serie af ja eller nej spørgsmål for passende at træne hver klasse til et billede. Nøjagtigheden af algoritmen vil bestemme antallet af ja / nej spørgsmål. Til analysen blev den brugerdefinerede algoritme / app skrevet med nøjagtighed indstillet til 50 (interval 0-100).
    7. Juster funktioner for hver klasse ved at anvende filtre til at skærpe, sløre, sortere efter form osv. for at forbedre nøjagtigheden af algoritmen/appen. Funktioner ændrer, hvordan klassen ser billedet for at få visse farver eller intensiteter frem.
      BEMÆRK: For den brugerdefinerede algoritme mærkes og måles metastaser, der måler 8500 μm2 og derover, som metastaser. Dette tegner sig for størrelsesafvigelse og metastaser for små til at registrere. Små fejlformede områder og små metastatiske områder under 8500 μm2 blev inkluderet i den normale vævskvantificering.
    8. Gem de ændrede indstillinger fra enten appen eller den brugerdefinerede algoritme, og anvend derefter algoritmen/appen på et helt sæt eller en række H&E-farvede væv.
    9. Endelig eksporteres alle outputvariabler, som omfatter dem, der er anført i tabel 1. Areal i mikron i anden (μm2) kan kvantificeres for hver vævstype, og procenterne er afledt af det samlede nettovævsområde for prøver (dvs. samlet væv minus luftrum).
    10. Når du opretter en brugerdefineret algoritme, gennemgå vævsmarkeringer i samråd med en veterinær patolog bord-certificeret af American College of Veterinary Patologer for at sikre nøjagtige målinger og skelne mellem vævstyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hvis der anvendes umærkede celler til injektion med haleåre, kan det være vanskeligt at bekræfte lungekoloniseringen før (1) tidspunktet for obduktion, hvis makrometastaser kan observeres, eller (2) efter histologisk analyse, hvis der findes mikroskopiske metastaser. Med omfattende metastatisk lungetumor byrde, mus vil have besværet vejrtrækning. Som med enhver tumorundersøgelse skal mus overvåges nøje i hele undersøgelsens varighed. Brugen af mærkede celler er en nem måde at bekræfte vellykket hale-vene injektion; derfor brugen af luciferase-tagged MDA-MB-231 celler i demonstrationen. In vivo-billeddannelse er dog ikke altid mulig eller nødvendig afhængigt af det eksperimentelle design og andre faktorer. Figur 1A viser bioluminescenssignal i brystrummet mindre end 2 timer efter injektion af luciferase-taggedE MDA-MB-231-celler som bekræftelse af nøjagtig injektion. Til dette eksperiment øges antallet af fotoner i brystregionen over tid, og der er et stærkt bioluminescenssignal til stede ved dag 24 efter injektionen (figur 1B og C; bemærk ændringen i skalalinjen). På tidspunktet for obduktionen blev der observeret mange makroskopiske lungelæsioner hos disse mus (figur 1D).

Efter korrekt vævsbehandling og farvning kan H&E-farvede lungesektioner scannes eller afbildes. Metastatisk lungetumor byrde kvantificering kan opnås effektivt ved hjælp af billedanalyse software og en brugerdefineret algoritme. Ved hjælp af den tilpassede algoritme segmenteres hele lungevæv efter forskellige vævsfunktioner (Figur 2A og B). Ved at segmentere lungevævet på denne måde kan softwaren kvantificere de forskellige parametre, der er anført i tabel 1. Denne analyse er udført på lungevæv fra mus injiceret med MDA-MB-231 celler efterfulgt af behandling med et lægemiddel designet til at blokere metastatisk kolonisering eller en køretøjskontrol (DMSO). De rå data fra denne analyse er vist i tabel 2. Desuden viser figur 3A repræsentative H&E-billeder af MDA-MB-231 lungemetaser fra enten DMSO eller lægemiddelbehandlede mus. Mens en forskel i metastatisk tumor byrde mellem disse behandlingsgrupper kan have let blive overset som det samlede antal lunge knuder er ikke anderledes, en omfattende analyse af alle parametre indikerer en betydelig forskel i procent netto lunge metastaser område (Figur 3B,C). Dette understreger behovet for en omfattende og grundig tilgang til at analysere metastatisk lungetumor byrde såsom den metode, der er beskrevet heri.

For de data, der præsenteres i figur 3, blev alle statistiske analyser udført ved hjælp af GraphPad Prism 7. Data blev betragtet som normalt fordelt ved at have bestået en af følgende standard normalitetstest: D'Agostino-Pearson omnibus, Shapiro-Wilk og Kolmogorov-Smirnov. Sammenligning mellem køretøjs- og narkotikabehandlede grupper (figur 3) blev foretaget ved umalet tohalet Student's t-test. Statistisk signifikans blev etableret på P ≤ 0,05.

Figure 1
Figur 1: In vivo bioluminescens bekræftelse af vellykket hale-vene injektion.
(A) Repræsentativt bioluminescenssignal hos mus 1 time efter injektion med haleåre af luciferasemærkede MDA-MB-231-celler. (B) Repræsentativt bioluminescenssignal i samme sæt mus som (A) 24 dage efter injektion af haleåreindsprøjtning af luciferasemærkede MDA-MB-231-celler. [Bemærk ændringen i skalalinjen mellem (A) og (B)]. (C) Kvantificering af foton tæller over tid i MDA-MB-231 hale-vene injicerede mus. Fejlbarer repræsenterer middel ± SEM. (n = 8 mus) (D) Repræsentativt ikke-tumorbærende lungevæv (højre) og MDA-MB-231 makrometastaser i lungerne (venstre) på tidspunktet for obduktion. Skalalinjer = 50 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Vævssegmentering ved hjælp af Visiopharm-software.
(A) Repræsentative klip af usegmenterede og segmenterede vævsmærke-ups ved hjælp af den tilpassede softwarealgoritme. (B) Forklaring for alle vævskategorier segmenteret ved hjælp af software. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentativ metastatisk lungetumorbyrdeanalyse af H&E-farvet væv.
A) Repræsentativ H&E-farvning af lungevæv fra ikke-injicerede mus og kontrol (DMSO) og lægemiddelbehandlede mus efter injektion med haleåre af MDA-MB-231-celler. Repræsentative tumormetastaser er angivet med pile. Skalastænger = 500 μm for 4x forstørrelse og 200 μm for 10x forstørrelse. (B) Graf over procent netto lungemetastase område af kontrol og lægemiddelbehandlede mus. Fejllinjer repræsenterer middel ± SD. (*) P = 0,022 ved elevs t-test. (C) Tabel, der opsummerer den metastatiske lungesvulstbyrdeanalyse (n = 9 DMSO; n = 9 lægemiddelbehandlede). Efter at have kontrolleret for normal fordeling af data blev alle P-værdier i tabellen bestemt af umalet, to-tailed Student's t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.

Parameter Beskrivelse
Vævsområde i alt (μm2) Område i kvadratiske mikroner inklusive alle tumormetastaser, normal lunge og områder med røde blodlegemer.
Metastaser tæller Samlet antal metastaser i lungevævet.
Metastasisområdeprocent (μm2) Samlet metastaseområde divideret med nettovævsområde x 100.
Væv + blankt område i alt (μm2) Areal i firkantede mikron inklusive alt væv og hvidt rum.
Nettovævsområde (μm2) Vævsområde i firkantede mikron (mets og normal lunge) uden hvide rum og røde blodlegemer.
Metastaserareal i alt (μm2) Samlet metastaseareal i kvadratmikroen som segmenteret af beslutningsskovens algorithim.
Middelmetaaseområde (μm2) Gennemsnitligt (gennemsnitligt) område i kvadratiske mikron af metastaser inden for hvert billede.
Median metastaser område (μm2) Medianmetastaseområde i firkantede mikron. Et tilsvarende antal metastaser falder under denne værdi, og et tilsvarende antal metastaser er større end medianværdien.

Tabel 1: Parametre målt med software. Liste over parametre sammen med en beskrivelse af hver måling, der beregnes ved hjælp af den brugerdefinerede algoritme.

Glide Metastaser tæller Metastasisområdeprocent (μm2) Væv + blankt område i alt (μm2) Samlet blanktegn (μm2) Nettovævsområde (μm2) Metastaserareal i alt (μm2) Rødt blodlegemer Område (μm2) Middelmetaseområde (μm2) Median metastaser område (μm2)
171 Lunge slide 1 435 8.90 185698000 83201800 92031400 8189250 10464800 18825.86 14748.73
171 Lunge slide 2 323 8.37 185698000 83201800 92054740 7708990 10441460 23866.84 14748.73
172 Lunge slide 1 151 2.73 181546000 89509904 81571296 2225220 10464800 14736.56 12486.37
172 Lunge slide 2 142 2.60 170708000 81735504 80558196 2093040 8414300 14739.72 12119.62
173 Lunge slide 1 634 11.60 234104992 102153000 115606692 13406800 16345300 21146.37 15472.22
173 Lunge slide 2 667 12.70 223180992 86778600 122374592 15542700 14027800 23302.40 16531.00
174 Lunge slide 1 40 0.55 192452992 80340896 87591096 485121 24521000 12128.03 10484.05
174 Lunge slide 2 34 0.51 183918000 71287904 91242796 464830 21387300 13671.47 11181.81
175 Lunge slide 1 780 23.93 179544992 44799200 126995782 30388600 7750010 38959.74 19307.76
175 Lunge slide 2 1001 12.58 169191536 43425608 120610754 15169100 5155174 15153.95 19703.08
188 Lunge slide 1 569 13.20 162290000 54210000 98486310 12997300 9593690 22842.36 14463.91
188 Lunge slide 2 271 5.15 157146000 54250800 91996500 4738100 10898700 17483.76 12657.83
189 Lunge slide 1 74 1.70 185292992 95700800 77779392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
189 Lunge slide 2 74 1.76 182272992 95700800 74759392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
816 Lunge slide 1 246 5.65 185876000 87568896 81916204 4631050 16390900 18825.41 14371.99
816 Lunge slide 2 565 6.05 183220000 76954304 90305396 5462670 15960300 9668.44 14244.82
876 Lunge slide 1 468 10.36 208308000 99300096 100947064 10454500 8060840 22338.68 16011.37
876 Lunge slide 2 528 11.74 199750896 81642568 110450391 12963400 7657937 24551.89 16699.13
877 Lunge slide 1 732 17.98 219340992 99918600 107869992 19397100 11552400 26498.77 18137.52
877 Lunge slide 2 605 14.64 207925504 88539712 108168329 15839700 11217463 26181.32 18014.64
878 Lunge slide 1 377 10.05 178534000 85610896 81931104 8232340 10992000 21836.45 16671.03
878 Lunge slide 2 376 9.88 170544000 75337904 86108406 8511710 9097690 22637.53 16754.38
879 Lunge slide 1 205 5.22 167556000 89999000 68123630 3553860 9433370 17335.90 13845.69
879 Lunge slide 2 213 4.64 167931008 80789400 78489588 3638720 8652020 17083.19 14058.12
881 Lunge slide 1 1122 38.81 218880000 79713504 130893816 50802300 8272680 45278.34 22044.99
881 Lunge slide 2 628 21.67 184200992 74502600 99122692 21475200 10575700 34196.18 19857.40
882 Lunge slide 1 678 24.05 194476992 83941904 98484788 23684500 12050300 34932.89 20748.06
882 Lunge slide 2 645 21.93 185537040 75790040 101412430 22241700 8334570 34483.26 20325.11
883 Lunge slide 1 429 10.79 179400992 84955696 84699866 9138800 9745430 21302.56 15080.23
883 Lunge slide 2 342 85.30 175220992 76210896 90472386 77170200 8537710 225643.86 17078.26
884 Lunge slide 1 359 6.42 206751008 87752600 103825008 6669710 15173400 18578.58 14333.41
884 Lunge slide 2 480 9.12 200990000 77052496 111060804 10125700 12876700 21095.21 15679.88
885 Lunge slide 1 332 7.79 191398000 92896304 84752596 6605490 13749100 19896.05 14500.11
885 Lunge slide 2 537 81.02 187475008 85938000 89378408 72411104 12158600 134843.77 15360.29
886 Lunge slide 1 305 7.93 158435008 80433296 76541662 6068720 1460050 19897.44 14500.11
886 Lunge slide 2 898 8.84 155460000 70808600 83457470 7380490 1193930 8218.81 14744.92

Tabel 2: Repræsentativ resultattabel. Tabel over resultater for hver parameter i algoritmen fra en kohorte af mus hale-vene injiceret med MDA-MB-231 celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som forskere fortsætter med at bruge intravenøs injektion af tumorceller som en eksperimentel model for metastaser, standard praksis for at analysere den resulterende metastatiske tumor byrde mangler. I nogle tilfælde kan signifikante forskelle i metastatisk tumorbyrde ved manipulation af bestemte cellelinjer og / eller brug af kemiske forbindelser observeres makroskopisk. Men i andre tilfælde kan subtile forskelle i metastatisk såning og vækst overses eller fejlfortolkes uden grundig patologisk analyse. Denne undersøgelse forskud tidligere offentliggjort hale-vene injektion protokoller ved at inkludere en omfattende metode til metastatisk lungetumor byrde analyse. Det er vigtigt, at denne metode til digital patologianalyse også kan anvendes på kvantificering af lungemetostatisk tumorbyrde efter ortotopisk injektion af tumorceller, der er i stand til spontan metastaser samt andre eksperimentelle metastasemodeller (dvs. intracardiac osv.) og patientafledte xenograft (PDX) modeller. Brugen af digital billedbehandling og software algoritme udvikling af veterinære patologer sikrer reproducerbarhed, nøjagtighed, og grundighed af denne tilgang til at analysere metastatisk lungetumor byrde25.

Tankevækkende beslutning af cellelinjer, cellekoncentration og slutpunkter baseret på enten tidligere offentliggjorte undersøgelser eller omhyggelig eksperimentel optimering er absolut nødvendig. I betragtning af at metastatisk såning og kolonisering er meget afhængig af interaktioner med forskellige immuncellepopulationer26,27, er brugen af immunkompek kompetente mus ideel, omend ikke altid mulig. Af samme grund bør fortolkningen af eksperimentelle metastaserundersøgelser ved hjælp af athymiske mus eller NSG-mus, som mangler centrale immuncellekomponenter, tages med forsigtighed. Der er flere mus mammary tumor cellelinjer, herunder MVT1 celler, der anvendes i denne undersøgelse, der er afledt af FVB / N mus stamme22,28,29. Andre syngeneic modeller findes så godt. Med hensyn til cellekoncentration, injektion af et stort antal celler kan i høj grad fremskynde og øge metastatisk lungetumor byrde. Men hvis lungerne er overvældet, kan det være svært at skelne individuelle metastatiske foci og emboli er mere tilbøjelige til at forekomme. Også, hale-vene injektion procedure kræver rigelig øvelse og uddannelse, før sikkert og / eller rutinemæssigt udfører injektioner. Mange institutioner vil tilbyde teknisk uddannelse og kan give mus til praksis formål. Korrekt placering af nålen og en glat injektion bør indikere succes; Til trænings-/øvelsesformål kan Evans Blue dye dog bruges til at hjælpe med at bestemme vellykket injektion (1% i steril PBS). Musens ekstremiteter bliver blå kort efter injektionen, men dyret skal aflives bagefter.

Derudover kan betydningen af standard obduktions- og vævsprøvetagningsteknikker til at kontrollere og forhindre diasartefakter, der kan forringe diasscanning og analyse af billedanalysesoftwaren, ikke understreges nok. Inflation af lungerne på tidspunktet for obduktion er et kritisk skridt i at opretholde væv integritet og forbedrer efterfølgende H &E farvning samt slutanalyse. For at være i overensstemmelse med opløsning og reproducerbarhed anbefales det, at alle dias i et studiesæt scannes med samme mål. I denne undersøgelse blev alle dias scannet ved 40x for at sikre nøjagtigheden af algoritmeindstillinger og korrekt identifikation af tumormetastaser, når de anvendes på analyserede felter. For hvert dias blev de samme lungelapper konsekvent scannet og analyseret for hver mus. Det anbefales også kraftigt, at en patolog gennemgår vævsmarkeringer for nøjagtigheden af den anvendte algoritme, og at den samme algoritme påføres hvert dias i en undersøgelse.

Den præsenterede protokol kan ændres i henhold til eksperimentelt design, brugerpræferencer og ønskede resultatmålinger. En sådan ændring omfatter brugen af en anæstesi induktion kammer snarere end konventionel restrainer enhed til et bevidst dyr. Med hensyn til dyresundhed og wellness, hverken tilgang er overlegen i forhold til den anden, og hver har sit eget sæt af fordele samt begrænsninger30. For sorte eller brune mus kan der også være behov for en lyskilde eller varmeenhed for at visualisere haleårerne. Infrarøde lamper eller et varmt vandbad kan bruges til at udvide venerne. Temperaturen skal dog overvåges nøje. Desuden er der belyste fastholdelsesanordninger til rådighed samt andre kommercielle versioner af gnaver fastholdelsesanordninger. Nogle efterforskere foretrækker Luer-Lok sprøjter til injektioner. Vi har sværere ved at fjerne luftbobler med Luer-Lok sprøjter, men det er et spørgsmål om præference. Cellernes levedygtighed er en vigtig overvejelse for hale-vene injektion procedure, og derfor, nøjagtige celletal samt opretholde celler på is før injektion er nødvendige skridt. Hvis man sammenligner lungesåning og kolonisering af manipulerede cellelinjer, er det afgørende at bestemme eventuelle forskelle i cellestørrelse og levedygtighed før injektion, da disse kan komplicere fortolkningen af resultaterne. Celledød og/eller -skade kan forekomme ved brug af en smalsporet nål; Det anbefales dog ikke, at der anvendes en nål større end 25 G, da det kan forårsage smerte og ubehag for dyret.

Som en måde at validere, at lungelæsioner er dannet af injicerede tumorceller, immunstaining kan gøres på væv sektioner. Hvis du bruger menneskelige cellelinjer, kan menneskespecifikke antistoffer bruges til at skelne metastatiske læsioner. Alternativt kan der anvendes tilsvarende antistoffer, hvis du bruger mærkede cellelinjer (f.eks. GFP). Også, mange brystkræft cellelinjer er positive for epitel markører (dvs. cytokeratins, E-cadherin, og EpCAM), men forudgående kendskab til udtryk er afgørende. Men lungeepilet foring luftvejene vil også være positiv for disse markører og dermed, struktur skal også overvejes. Der kan være tilfælde, hvor primær lungetumor udvikling skal udelukkes. For at gøre dette, immunohistokemisk farvning til skjoldbruskkirtlen Transskription Faktor-1 (TTF1) kan bruges som en markør for primær lunge adenocarcinom. TTF1 farvning bør evalueres af en certificeret patolog.

Heri blev der skrevet en brugerdefineret algoritme ved hjælp af en Decision Forest-klassificeringsalgoritme, fordi den etablerede lungemetastasealgoritme ikke kunne finjusteres til nøjagtig påvisning af metastaser, der varierede i størrelse. Denne tilpassede algoritme muliggør komplekse målinger, giver mulighed for nøjagtig segmentering af metastaser efter størrelse og understøtter en størrelsesskæring, så små fejlformede områder og normale strukturer ikke fejlfortolkes og derfor kan medtages i det endelige datasæt. Vi forventer, at denne algoritme vil være gældende for de fleste in vivo lungemetastaseundersøgelser, men brugerne kan være nødt til at justere indstillingerne i softwaren, så den passer til deres individuelle undersøgelsesbehov. Men denne algoritme fungerer som en platform for efterforskere, der ønsker at analysere lunge metastatisk byrde på samme måde. Der er mange forskellige muligheder for billedanalyseplatforme, hvor adgang eller tilgængelighed, omkostninger og træning samt erfaringsniveau kan diktere den bedste platform til at udnytte36. Udvalget af muligheder omfatter gratis platforme som QuPath og dyrere, men sofistikerede platforme, såsom Visiopharm. Det anbefales, at man rådfører sig med en billedanalyse patologi kerne og patolog, når de beslutter, hvilken platform der kan være tilgængelig og bedst udnyttet til et bestemt forskningsprojekt.

Spontane musemorselulstmodeller (f.eks. MMTV-PyMT) eller ortotopiske brystfedtpudeindsprøjtningsmetoder repræsenterer den mest fysiologisk relevante model til undersøgelse af lungemetastase. En alvorlig ulempe ved hale-vene injektion model er, at det ikke rekapitulere den fulde metastatiske kaskade og er derfor begrænset til studiet af tumorcelle ekstravasation og sekundær organ kolonisering. Men, denne eksperimentelle metastase model er relevant for brystkræft forskning som lunge metastaser dannet efter hale-vene injektion har genomiske profiler svarende til metastatiske læsioner, der udvikler sig efter ortotopisk implantation af de samme celler31. For at etablere en lungemetastase model, et stort antal celler er ofte injiceres intravenøst, som ikke præcist repræsenterer processen med metastaser, da det vedrører såning, immunreaktion, og dvale. Også, baseret på kredsløbsvejen, lungemetastaser er mest almindelige med hale-vene injektion32. Med de fleste brystkræft cellelinjer, offentliggjorte rapporter viser en relativt lav forekomst af knogle, lever, eller hjernen metastaser efter hale-vene injektion7. Alternative eksperimentelle metastaser metoder såsom intracardiac, intratibial, portal vene og intratracarotid injektioner er mere passende til at undersøge metastaser til andre steder33,34,35,36,37. Igen, spontane brystsvulst modeller eller ortotopisk fedt pad injektion metoder, der opsummerer alle trin i den metastatiske kaskade foretrækkes. Problemer med konsekvent metastatisk tumor byrde, varigheden af undersøgelsen, og antallet af dyr, der kræves for sådanne undersøgelser er en ulempe. Metoden til digital patologianalyse, der præsenteres her i, kan dog anvendes på lungemetastaser dannet gennem enhver spontan eller eksperimentel metastasemodel.

Analysemetoden giver også visse begrænsninger såsom subjektivitet i algoritmeoprettelse. Selv om hele slide imaging giver mulighed for digital analyse på en hel væv sektion og på alle lungelapper af en enkelt mus, det er begrænset til en to-dimensionel analyse af en 3D-væv. Stereologi er ved at blive en almindelig praksis, der opnår 3D-oplysninger til billedanalyse og kan redegøre for faktorer som vævssvind, der opstår under vævsbehandling38. Stereologi har imidlertid sine egne begrænsninger som væv, ressource og tidsbegrænsninger.

I betragtning af antallet af kræftpatienter, der er ramt af metastatisk spredning af deres sygdom, vil hale-vene injektion metode til at studere metastaser fortsat være et nyttigt redskab med hensyn til at forstå den komplicerede biologi metastatisk spredning og til bestemmelse af den prækliniske effekt af nye lægemidler. In vivo mus modeller af metastaser, især dem, der bruger immun-kompetente dyr, bliver endnu vigtigere for kræftforskning i betragtning af den udbredte interesse i immunterapi29. Også, eksperimentelle metastaser modeller er afgørende med hensyn til at undersøge metastaser suppressor gener (dvs. dem, der undertrykker metastatisk potentiale kræftceller uden at påvirke primær tumorvækst), og derfor fortsætter med at være et værdifuldt forskningsværktøj.

Digital billedbehandling og slide analyse er hurtigt blevet en grundpille i diagnostiske og eksperimentelle mus modellering39. Ved hjælp af den type tilgang, der er beskrevet heri til at analysere lunge metastatisk tumor byrde vil give mulighed for høj gennemløb analyser i en mere omfattende og præcis måde. Desuden giver digital billedbehandling patologi en mulighed for mere samarbejdsforskningsprojekter, der involverer patologer, der specialiserer sig i områder som musemodeller af brystkræft metastaser. Som multiplex væv imaging metoder og 3D-billeddannelse teknologier (som nævnt ovenfor) fortsat udvikles, digital billedbehandling patologi, sofistikerede software-programmer til billedanalyse, og ekspertise patologer vil helt sikkert være nødvendig for at fremme metastaser forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Repræsentative data blev finansieret gennem National Cancer Institute (K22CA218549 til S.T.S). Ud over deres hjælp til at udvikle den omfattende analysemetode rapporteret heri, takker vi The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Direktør - Krista La Perle, DVM, PhD) for histologi og immunohistochemistry tjenester og Patologi Imaging Core for algoritme udvikling og analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
alcohol prep pads Fisher Scientific 22-363-750 for cleaning tail prior to injection
dissection scissors Fisher Scientific 08-951-5 for mouse dissection and lung tissue inflation
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Fisher Scientific MT10013CV cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Fisher Scientific MT21030CV used for resuspending tumor cells for injection
ethanol (70 % solution) OSU used to minimize mouse's fur during dissection; use caution - flammable
Evan's blue dye Millipore Sigma E2129 used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent
Fetal Bovine Serum Millipore Sigma F4135 cell culture media additive; used at 10% in DMEM
forceps Fisher Scientific 10-270 for dissection and lung tissue inflation
FVB/NJ mice The Jackson Laboratory 001800 syngeneic mouse strain for MVT1 cells
hemacytometer (Bright-Line) Millipore Sigma Z359629 for use in cell culture to obtain cell counts
insulin syringe (28 G) Fisher Scientific 14-829-1B for tail-vein injections (BD 329424)
MDA-MB-231 cells ATCC human breast cancer cell line
MVT1 cells mouse mammary tumor cells
needles (26 G) Fisher Scientific 14-826-15 used to inflate the mouse's lungs
neutral buffered formalin (10%) Fisher Scientific 245685 used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice The Jackson Laboratory 005557 maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource
Penicillin Streptomycin 100x ThermoFisher 15140163 cell culture media additive
sterile gauze Fisher Scientific NC9379092 for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs
syringe (5 mL) Fisher Scientific 14-955-458 used to inflate mouse lung tissue
tail-vein restrainer Braintree Scientific, Inc. TV-150 STD used to restrain mouse for tail-vein injections
Trypan blue (0.4 %) ThermoFisher 15250061 used in cell culture to assess viability
Trypsin-EDTA 0.25 % ThermoFisher 25200-114 used in cell culture to detach tumor cells from plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews: Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  2. Steeg, P. S. Targeting metastasis. Nature Reviews: Cancer. 16 (4), 201-218 (2016).
  3. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  4. Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nature Medicine. 12 (8), 895-904 (2006).
  5. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  6. Eckhardt, B. L., Francis, P. A., Parker, B. S., Anderson, R. L. Strategies for the discovery and development of therapies for metastatic breast cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (6), 479-497 (2012).
  7. Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
  8. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
  9. Schoenenberger, C. A., et al. Targeted c-myc gene expression in mammary glands of transgenic mice induces mammary tumours with constitutive milk protein gene transcription. EMBO Journal. 7 (1), 169-175 (1988).
  10. Nusse, R., Varmus, H. E. Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell. 31 (1), 99-109 (1982).
  11. Muller, W. J., Sinn, E., Pattengale, P. K., Wallace, R., Leder, P. Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene. Cell. 54 (1), 105-115 (1988).
  12. Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. American Journal of Pathology. 163 (5), 2113-2126 (2003).
  13. Green, J. E., et al. The C3(1)/SV40 T-antigen transgenic mouse model of mammary cancer: ductal epithelial cell targeting with multistage progression to carcinoma. Oncogene. 19 (1), 1020-1027 (2000).
  14. Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PloS One. 7 (10), 47995 (2012).
  15. Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (3), 443-447 (2010).
  16. Mariotto, A. B., Etzioni, R., Hurlbert, M., Penberthy, L., Mayer, M. Estimation of the Number of Women Living with Metastatic Breast Cancer in the United States. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 26 (6), 809-815 (2017).
  17. Xiao, W., et al. Risk factors and survival outcomes in patients with breast cancer and lung metastasis: a population-based study. Cancer Medicine. 7 (3), 922-930 (2018).
  18. Smid, M., et al. Subtypes of breast cancer show preferential site of relapse. Cancer Research. 68 (9), 3108-3114 (2008).
  19. Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
  20. Soni, A., et al. Breast cancer subtypes predispose the site of distant metastases. American Journal of Clinical Pathology. 143 (4), 471-478 (2015).
  21. Leone, B. A., et al. Prognostic impact of metastatic pattern in stage IV breast cancer at initial diagnosis. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (3), 537-548 (2017).
  22. Pei, X. F., et al. Explant-cell culture of primary mammary tumors from MMTV-c-Myc transgenic mice. In Vitro Cellular and Developmental Biology: Animal. 40 (1-2), 14-21 (2004).
  23. Mathsyaraja, H., et al. CSF1-ETS2-induced microRNA in myeloid cells promote metastatic tumor growth. Oncogene. 34 (28), 3651-3661 (2015).
  24. Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
  25. La Perle, K. M. D. Comparative Pathologists: Ultimate Control Freaks Seeking Validation. Veterinary Pathology. 56 (1), 19-23 (2019).
  26. Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
  27. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes and Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
  28. Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical and Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
  29. Yang, Y., et al. Immunocompetent mouse allograft models for development of therapies to target breast cancer metastasis. Oncotarget. 8 (19), 30621-30643 (2017).
  30. Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia. Laboratory Animals. 53 (2), 190-201 (2019).
  31. Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
  32. Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 75 (4), 344-355 (2009).
  33. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  34. Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).
  35. Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
  36. Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
  37. Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
  38. Brown, D. L. Practical Stereology Applications for the Pathologist. Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).
  39. Aeffner, F., et al. Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).

Tags

Kræftforskning Udgave 159 hale-vene injektion brystkræft lungemetastase H &E-farvede sektioner kvantitativ digital patologi billedanalyse

Erratum

Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.

The author list was updated from:

Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

to:

Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

Patologisk analyse af lungemetasase Efter Lateral Hale-Vene Injektion af tumorceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh,… More

Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (159), e61270, doi:10.3791/61270 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter