تصوير وتحليل آفات الشريان الأورطي الكامل الملطخة بالزيت الأحمر في نموذج فأر فرط شحميات الدم تمدد الأوعية الدموية
Summary
يوفر هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة لتحليل عبء تصلب الشرايين في الفئران. يمكن للمحققين استخدام هذا البروتوكول لمقارنة وفرة وموقع وحجم آفات تصلب الشرايين في الحيوانات المختلفة.
Abstract
الفئران المفرطة للدهون الناقصة Apolipoprotein E (Apoe) – أو مستقبلات البروتين الدهني منخفض الكثافة (Ldlr) هي النموذجان الأكثر استخداما لأبحاث تصلب الشرايين. يتم استخدامها لدراسة تأثير العوامل الوراثية المختلفة وأنواع الخلايا المختلفة على تكوين آفة تصلب الشرايين وكذلك اختبار تطوير علاجات جديدة. العزل ، واستئصال الشريان الأورطي بأكمله ، والقياس الكمي لآفات تصلب الشرايين الملطخة بالزيت الأحمر O هي طرق مورفومترية أساسية تستخدم لتقييم عبء تصلب الشرايين. الهدف من هذا البروتوكول هو وصف طريقة جراحية محسنة خطوة بخطوة لتشريح وإصلاح الثقب والعزل والبقع والصورة وتحليل آفات تصلب الشرايين في الشريان الأورطي للفئران باستخدام Oil Red O. نظرا لأن الآفات التصلب الأذيني يمكن أن تتشكل في أي مكان في شجرة الأبهر بأكملها ، فإن طريقة تلطيخ الأبهر بالزيت الأحمر O بأكملها تتمتع بميزة تقييم اللويحات المحملة بالدهون في الشريان الأورطي بأكمله وجميع الفروع في فأر واحد. بالإضافة إلى تلطيخ الزيت الأحمر O ، يمكن استخدام الأبهر الكامل المعزول الطازج لمجموعة متنوعة من التجارب في المختبر وفي الجسم الحي وعزل الخلايا.
Introduction
عادة ما يحدث مرض الشريان التاجي، وهو سبب رئيسي للوفيات في الولايات المتحدة، بسبب تصلب الشرايين، وهي عملية تؤدي إلى تراكم اللويحات داخل جدران الشرايين1. تعد الفئران المعرضة لفرط شحميات الدم المعرضة لنقص Apoe و Ldlr أساسية لتحقيقات تصلب الشرايين ومضاعفاته وتطوير العلاجات2،3،4،5. يعد التحديد الكمي لآفات تصلب الشرايين من الشريان الأورطي في الوجه تحليلا مهما لنقطة النهاية لتقييم تأثير التلاعب الجيني في أنواع الخلايا المختلفة. كما أنه يساعد على دراسة العلاجات الجديدة المصممة للتأثير على بدء مرض تصلب الشرايين وتطوره وانحداره. يمكن أن تتشكل آفات تصلب الشرايين في أي مكان في الشريان الأورطي وفروعه (أي الشرايين العضدية والسباتية وتحت الترقوة في الصدر، وكذلك الشرايين الكلوية والحرقفية والفخذية الشائعة أسفل الحجاب الحاجز)6. يتطلب التقييم الشامل لعبء تصلب الشرايين والعلاج المناسب تقييم عبء المرض في مواقع مختلفة ، وهو تحد غالبا ما يتم تجاهله.
يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء تحليل شامل لآفات تصلب الشرايين ، بدءا من الشريان الأورطي الكامل غير المفتوح والمضي قدما في إعداد الوجه ، في فأر واحد. يسمح تلطيخ الشريان الأورطي الكامل غير المفتوح بالزيت الأحمر O بإجراء تقييم سريع ونوعي للويحات المحملة بالدهون في الشريان الأورطي بأكمله وفروعه ، بينما يوفر إعداد الوجه تقييما كميا لتوزيع آفة تصلب الشرايين في الشريان الأورطي للفأر.
تستخدم هذه التقنية فئران عمرها 8 أسابيع مع حذف TGFβR2 خاص بخلايا العضلات الملساء على خلفية Apoe-/– hyperlipidemic (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; أبو–/-; يشار إليها فيما يلي باسم الفئران TGFβR2iSMC-Apoe) وعناصر التحكم في القمامة Apoe-/- (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; أبو–/-; يشار إليها فيما يلي باسم Apoe-/- الفئران). يتم الاحتفاظ بالحيوانات لمدة 16 أسبوعا على نظام غذائي عالي الكوليسترول عالي الدهون (HCHFD) كمواد دراسة7. عند إنهاء الدراسة ، يتم تلطيخ الأبهر الكامل غير المفتوح وتصويره (بما في ذلك جميع الفروع الرئيسية) باستخدام Oil Red O للتقييم النوعي للويحات المحملة بالدهون. يتم قطع الشريان الأورطي عن طريق إعداد الوجه ، ويتم تصوير جميع آفات تصلب الشرايين وتحديدها كميا. يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة تطور آفة تصلب الشرايين في نماذج الفئران Apoe-/- أو Ldlr-/- فرط شحميات الدم وتوسيعه ليشمل تطبيقات بيولوجيا الأوعية الدموية العامة المتعلقة بالشريان الأورطي.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتين الشحمي E (Apoe) ومستقبلات البروتين الدهني منخفضة الكثافة (Ldlr) الفئران الناقصة مفيدة لدراسة تطور وعلاج تصلب الشرايين. يمكن للمحققين تقييم تأثير الوراثة والتلاعب العلاجي على بدء الأمراض المرتبطة بتصلب الشرايين وتطورها وتراجعها باستخدام تلطيخ الزيت الأحمر O للشريان الأورطي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل ، جزئيا ، من خلال منحة صغيرة مشتركة لاتحاد البيولوجيا مقدمة بموجب منحة المعاهد الوطنية للصحة P30AR070253 (P.-Y.C.) ، و HL135582 (M.S). نحن ممتنون ل R. Webber و L. Coon للحفاظ على الفئران المستخدمة في هذه الدراسة.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
References
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
