Imágenes y análisis de lesiones de aorta entera teñidas de O de color rojo aceite en un modelo de ratón con hiperlipidemia por aneurisma
Summary
Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para analizar la carga aterosclerótica en ratones. Los investigadores pueden usar este protocolo para comparar la abundancia, la ubicación y el tamaño de las lesiones ateroscleróticas en diferentes animales.
Abstract
Los ratones hiperlipidémicos deficientes en apolipoproteína E (Apoe) o receptores de lipoproteínas de baja densidad (Ldlr) son los dos modelos más utilizados para la investigación de la aterosclerosis. Se utilizan para estudiar el impacto de varios factores genéticos y diferentes tipos de células en la formación de lesiones ateroscleróticas y también para probar el desarrollo de nuevas terapias. El aislamiento, la escisión de toda la aorta y la cuantificación de las lesiones ateroscleróticas teñidas de O rojo aceite son métodos morfométricos básicos utilizados para evaluar la carga aterosclerótica. El objetivo de este protocolo es describir un método quirúrgico optimizado y paso a paso para diseccionar, perfusar-fijar, aislar, teñir, visualizar y analizar lesiones ateroscleróticas en aortas de ratón con Oil Red O. Debido a que las lesiones ateroscleróticas pueden formarse en cualquier parte de todo el árbol aórtico, este método de tinción de aceite de aorta roja O tiene la ventaja de evaluar las placas cargadas de lípidos en toda la aorta y todas las ramas en un solo ratón. Además de la tinción Oil Red O, se pueden utilizar aortas enteras frescas aisladas para una variedad de experimentos in vitro e in vivo y aislamientos celulares.
Introduction
La enfermedad de las arterias coronarias, una de las principales causas de mortalidad en los Estados Unidos, generalmente es causada por la aterosclerosis, un proceso que conduce a la acumulación de placa dentro de las paredes arteriales1. Los ratones con deficiencia de Apoe y Ldlr propensos a la hiperlipidemia son fundamentales para las investigaciones de la aterosclerosis y sus complicaciones y el desarrollo de terapias2,3,4,5. La cuantificación de las lesiones ateroscleróticas de una aorta en la cara es un análisis de punto final importante para evaluar el impacto de la manipulación genética en diferentes tipos de células. También ayuda a estudiar nuevas terapias diseñadas para afectar el inicio, la progresión y la regresión de la enfermedad aterosclerótica. Las lesiones ateroscleróticas pueden formarse en cualquier parte de la aorta y sus ramas (es decir, arterias braquiocefálicas, carótidas y subclavias en el tórax, así como arterias renales, ilíacas comunes y femorales debajo del diafragma)6. Una evaluación integral de la carga de aterosclerosis y la terapia adecuada requieren una evaluación de la carga de enfermedad en diferentes lugares, un desafío que a menudo se pasa por alto.
Este protocolo describe cómo realizar un análisis exhaustivo de las lesiones ateroscleróticas, comenzando con una aorta entera sin abrir y procediendo a la preparación de la cara, en un solo ratón. La tinción de aceite de aorta entera sin abrir Red O permite una evaluación rápida y cualitativa de las placas cargadas de lípidos en toda la aorta y sus ramas, mientras que la preparación facial proporciona una evaluación cuantitativa de la distribución de la lesión aterosclerótica en la aorta de ratón.
La técnica utiliza ratones de 8 semanas de edad con una deleción TGFβR2 específica de células musculares lisas en el fondo hiperlipidémico Apoe-/- (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; en lo sucesivo denominados ratones TGFβR2iSMC-Apoe) y controles Apoe-/- de camada (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/-; en lo sucesivo denominados ratones Apoe-/-). Los animales se mantienen durante 16 semanas en una dieta alta en colesterol y alta en grasas (HCHFD) como materiales de estudio7. Al finalizar el estudio, las aortas enteras no abiertas se tiñen y se toman imágenes (incluidas todas las ramas principales) con Oil Red O para la evaluación cualitativa de las placas cargadas de lípidos. Las aortas se abren a través de la preparación facial, y todas las lesiones ateroscleróticas se visualizan y cuantifican. Este protocolo se puede utilizar para estudiar el desarrollo de lesiones ateroscleróticas en modelos de ratones con hiperlipidemia Apoe-/– o Ldlr-/- y extenderse a aplicaciones generales de biología vascular relacionada con la aorta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los ratones deficientes en apolipoproteína E (Apoe) y receptor de lipoproteínas de baja densidad (Ldlr) son útiles para estudiar el desarrollo y el tratamiento de la aterosclerosis. Los investigadores pueden evaluar el impacto de las manipulaciones genéticas y terapéuticas en la iniciación, progresión y regresión de enfermedades relacionadas con la aterosclerosis utilizando la tinción Oil Red O de toda la aorta9. La tinción y cuantificación de lesiones con aceite de ao…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado, en parte, por una microsubvención del Consorcio Conjunto de Biología proporcionada bajo la subvención P30AR070253 de los NIH (P.-Y.C.) y HL135582 (MS). Estamos agradecidos a R. Webber y L. Coon por mantener los ratones utilizados en este estudio.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
References
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
