Beeldvorming en analyse van olierode O-gekleurde hele aortalaesies in een aneurysma hyperlipidemie muismodel
Summary
Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure om atherosclerotische belasting bij muizen te analyseren. Onderzoekers kunnen dit protocol gebruiken om de overvloed, locatie en grootte van atherosclerotische laesies bij verschillende dieren te vergelijken.
Abstract
Apolipoproteïne E (Apoe) – of low density lipoprotein receptor (Ldlr) – deficiënte hyperlipidemische muizen zijn de twee meest gebruikte modellen voor atherosclerose onderzoek. Ze worden gebruikt om de impact van verschillende genetische factoren en verschillende celtypen op de vorming van atherosclerotische laesies te bestuderen en om de ontwikkeling van nieuwe therapieën te testen. Isolatie, excisie van de hele aorta en kwantificering van olierode O-gekleurde atherosclerotische laesies zijn basale morfometrische methoden die worden gebruikt om atherosclerotische belasting te evalueren. Het doel van dit protocol is om een geoptimaliseerde, stapsgewijze chirurgische methode te beschrijven om atherosclerotische laesies in muisabortas te ontleden, perfuseren-fixeren, isoleren, kleuren, in beeld te brengen en te analyseren met aorta’s van muizen met Oil Red O. Omdat atherosclerotische laesies zich overal in de hele aortaboom kunnen vormen, heeft deze hele aorta Oil Red O-kleuringsmethode het voordeel dat lipide-beladen plaques in de hele aorta en alle takken in een enkele muis worden geëvalueerd. Naast Oil Red O-kleuring kunnen verse geïsoleerde hele aorta’s worden gebruikt voor verschillende in vitro en in vivo experimenten en celisolaties.
Introduction
Coronaire hartziekte, een belangrijke doodsoorzaak in de VS, wordt meestal veroorzaakt door atherosclerose, een proces dat leidt tot de opbouw van plaque in arteriële wanden1. Hyperlipidemie-gevoelige Apoe- en Ldlr-deficiënte muizen staan centraal in onderzoek naar atherosclerose en de complicaties ervan en de ontwikkeling van therapieën2,3,4,5. Kwantificering van atherosclerotische laesies van een en face aorta is een belangrijke eindpuntanalyse voor het evalueren van de impact van genetische manipulatie in verschillende celtypen. Het helpt ook om nieuwe therapieën te bestuderen die zijn ontworpen om de initiatie, progressie en regressie van atherosclerotische ziekten te beïnvloeden. Atherosclerotische laesies kunnen zich overal in de aorta en zijn takken vormen (d.w.z. brachiocephalische, carotis- en subclaviaslagaders in de borst, evenals renale, gemeenschappelijke iliacale en femorale slagaders onder het diafragma)6. Een uitgebreide evaluatie van atheroscleroselast en geschikte therapie vereist een beoordeling van de ziektelast op verschillende locaties, een uitdaging die vaak over het hoofd wordt gezien.
Dit protocol beschrijft hoe een uitgebreide analyse van atherosclerotische laesies kan worden uitgevoerd, te beginnen met een ongeopende hele aorta en overgaand tot en face-voorbereiding, in een enkele muis. Ongeopende hele aorta Oil Red O-kleuring maakt een snelle, kwalitatieve beoordeling van met lipiden beladen plaques in de gehele aorta en zijn takken mogelijk, terwijl en face-voorbereiding een kwantitatieve beoordeling biedt van de verdeling van atherosclerotische laesies in de aorta van de muis.
De techniek maakt gebruik van 8 weken oude muizen met een gladde spiercel-specifieke TGFβR2-deletie op de Apoe-/- hyperlipidemische achtergrond (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; hierna TGFβR2iSMC-Apoe-muizen genoemd) en nestgenoot Apoe-/- controles (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/-; hierna Apoe-/- muizen genoemd). De dieren worden 16 weken lang gehouden op een cholesterolrijk vetrijk dieet (HCHFD) als studiemateriaal7. Aan het einde van het onderzoek worden de ongeopende hele aorta’s gekleurd en afgebeeld (inclusief alle belangrijke takken) met Oil Red O voor kwalitatieve beoordeling van met lipiden beladen plaques. De aorta’s worden opengesneden via en face preparation en alle atherosclerotische laesies worden in beeld gebracht en gekwantificeerd. Dit protocol kan worden gebruikt om de ontwikkeling van atherosclerotische laesies in Apoe-/- of Ldlr-/- hyperlipidemie muizenmodellen te bestuderen en uitgebreid naar algemene aorta-gerelateerde vasculaire biologietoepassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apolipoproteïne E (Apoe) en low density lipoprotein receptor (Ldlr) deficiënte muizen zijn nuttig voor het bestuderen van de ontwikkeling en behandeling van atherosclerose. Onderzoekers kunnen de impact van genetica en therapeutische manipulaties op atherosclerose-gerelateerde ziekten initiatie, progressie en regressie evalueren met behulp van Oil Red O-kleuring van de hele aorta9. Aorta Oil Red O-kleuring en laesiekwantificering is het gouden standaardeindpunt voor atheroscler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een Joint Biology Consortium Microgrant verstrekt onder NIH-subsidie P30AR070253 (P.-Y.C.), en HL135582 (MS). We zijn R. Webber en L. Coon dankbaar voor het onderhoud van de muizen die in deze studie zijn gebruikt.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
References
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
