इमेजिंग और एक एन्यूरिज्म हाइपरलिपिडिमिया माउस मॉडल में तेल लाल ओ-सना हुआ पूरे महाधमनी घावों का विश्लेषण
Summary
यह प्रोटोकॉल चूहों में एथेरोस्क्लेरोटिक बोझ का विश्लेषण करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया प्रदान करता है। जांचकर्ता इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न जानवरों में एथेरोस्क्लेरोटिक घावों की बहुतायत, स्थान और आकार की तुलना करने के लिए कर सकते हैं।
Abstract
एपोलिपोप्रोटीन ई (Apoe) – या कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन रिसेप्टर (Ldlr) की कमी वाले हाइपरलिपिडेमिक चूहे एथेरोस्क्लेरोसिस अनुसंधान के लिए दो सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले मॉडल हैं। उनका उपयोग एथेरोस्क्लेरोटिक घाव के गठन पर विभिन्न आनुवंशिक कारकों और विभिन्न सेल प्रकारों के प्रभाव का अध्ययन करने और साथ ही साथ नए उपचारों के विकास का परीक्षण करने के लिए किया जाता है। अलगाव, पूरे महाधमनी का उच्छेदन, और तेल लाल ओ-दाग एथेरोस्क्लेरोटिक घावों का परिमाणीकरण एथेरोस्क्लेरोटिक बोझ का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले बुनियादी मोर्फोमेट्रिक तरीके हैं । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक अनुकूलित, चरण-दर-चरण सर्जिकल विधि का वर्णन करना है, जो तेल रेड ओ के साथ माउस महाधमनी में एथेरोस्क्लेरोटिक घावों को विच्छेदित करने, परफ्यूज-फिक्स, अलग, दाग, छवि और विश्लेषण करने के लिए है। क्योंकि एथेरोस्क्लेरोटिक घाव पूरे महाधमनी के पेड़ में कहीं भी बन सकते हैं, इस पूरे महाधमनी तेल रेड ओ स्टेनिंग विधि में पूरे महाधमनी और एक ही माउस में सभी शाखाओं में लिपिड-लदी सजीले टुकड़े का मूल्यांकन करने का लाभ है। तेल रेड ओ धुंधला करने के अलावा, ताजा अलग-थलग पूरे महाधमनी का उपयोग इन विट्रो और विवो प्रयोगों और सेल अलगाव में विविधता के लिए किया जा सकता है।
Introduction
कोरोनरी धमनी रोग, अमेरिका में मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण, आमतौर पर एथेरोस्क्लेरोसिस के कारण होता है, एक प्रक्रिया जो धमनी दीवारों के अंदर पट्टिका के निर्माण की ओर ले जाती है1। हाइपरलिपिडिमिया-प्रवण Apoe- और Ldlr-कमी वाले चूहे एथेरोस्क्लेरोसिस की जांच और इसकी जटिलताओं और उपचारों के विकास के लिए केंद्रीय हैं2,3,4,5। एन फेस महाधमनी से एथेरोस्क्लेरोटिक घावों का परिमाणीकरण विभिन्न सेल प्रकारों में आनुवंशिक हेरफेर के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण समापन बिंदु विश्लेषण है। यह एथेरोस्क्लेरोटिक रोग दीक्षा, प्रगति और प्रतिगमन को प्रभावित करने के लिए डिज़ाइन किए गए उपन्यास उपचारों का अध्ययन करने में भी मदद करता है। एथेरोस्क्लेरोटिक घाव महाधमनी और इसकी शाखाओं में कहीं भी बन सकते हैं (यानी, छाती में ब्रैकियोसेफेलिक, कैरोटिड और सबक्लेवियन धमनियों के साथ-साथ डायाफ्राम के नीचे गुर्दे, सामान्य इलियाक और ऊरु धमनियों)6। एथेरोस्क्लेरोसिस बोझ और उचित चिकित्सा के व्यापक मूल्यांकन के लिए विभिन्न स्थानों में रोग के बोझ के मूल्यांकन की आवश्यकता होती है, एक चुनौती जिसे अक्सर अनदेखा किया जाता है।
यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि एथेरोस्क्लेरोटिक घावों का एक व्यापक विश्लेषण कैसे किया जाए, जो एक खुला हुआ पूरा महाधमनी के साथ शुरू होता है और एक माउस में चेहरे की तैयारी के लिए आगे बढ़ता है। खुला हुआ पूरा महाधमनी तेल रेड ओ धुंधला पूरे महाधमनी और इसकी शाखाओं में लिपिड-लदी सजीले टुकड़े के तेजी से, गुणात्मक मूल्यांकन की अनुमति देता है, जबकि एन फेस तैयारी माउस महाधमनी में एथेरोस्क्लेरोटिक घाव वितरण का मात्रात्मक मूल्यांकन प्रदान करती है।
तकनीक एक चिकनी मांसपेशी सेल के साथ 8 सप्ताह पुराने चूहों का उपयोग करता है-विशिष्ट TGFπR2 Apoe-/- हाइपरलिपिडेमिक पृष्ठभूमि (MYH11-CreERT2) पर विलोपन; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; इसके बाद TGFπR2iSMC-Apoe चूहों) और littermate Apoe-/- नियंत्रण (MYH11-CreERT2; mT/mGf/f) के रूप में जाना जाता है; Apoe-/-; इसके बाद Apoe-/- चूहों के रूप में संदर्भित किया जाता है)। जानवरों को अध्ययन सामग्री के रूप में उच्च कोलेस्ट्रॉल उच्च वसा वाले आहार (HCHFD) पर 16 सप्ताह के लिए रखा जाता है। अध्ययन समाप्ति पर, अप्रकाशित पूरे महाधमनी दाग और छवि (सभी प्रमुख शाखाओं सहित) लिपिड से भरे सजीले टुकड़े के गुणात्मक मूल्यांकन के लिए तेल लाल ओ के साथ कर रहे हैं। महाधमनी को एन फेस तैयारी के माध्यम से काटा जाता है, और सभी एथेरोस्क्लेरोटिक घावों को चित्रित और परिमाणित किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग Apoe-/- या Ldlr-/- हाइपरलिपिडिमिया चूहों के मॉडल में एथेरोस्क्लेरोटिक घाव विकास का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है और सामान्य महाधमनी से संबंधित संवहनी जीव विज्ञान अनुप्रयोगों तक बढ़ाया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एपोलिपोप्रोटीन ई (एपोई) और कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन रिसेप्टर (एलडीएलआर) की कमी वाले चूहे एथेरोस्क्लेरोसिस के विकास और उपचार का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हैं। जांचकर्ता एथेरोस्क्लेरोसिस से सं?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को भाग में, एनआईएच अनुदान P30AR070253 (P.-Y.C.), और HL135582 (एमएस) के तहत प्रदान किए गए एक संयुक्त जीव विज्ञान कंसोर्टियम माइक्रोग्रांट द्वारा समर्थित किया गया था। हम इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले चूहों को बनाए रखने के लिए आर वेबर और एल कून के आभारी हैं।
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
References
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