Summary
Dit protocol beschrijft de voorbereiding, biotribologische testen en analyse van osteochondrale cilinders glijden tegen metalen implantaat materiaal. Uitkomst maatregelen opgenomen in dit protocol zijn metabole activiteit, genexpressie en histologie.
Abstract
Osteochondrale defecten bij patiënten van middelbare leeftijd kunnen worden behandeld met focale metalen implantaten. Eerst ontwikkeld voor defecten in het kniegewricht, implantaten zijn nu beschikbaar voor de schouder, heup, enkel en de eerste middenvoetsbeentjephalangeal gewricht. Terwijl het verstrekken van pijnvermindering en klinische verbetering, progressieve degeneratieve veranderingen van het tegengestelde kraakbeen worden waargenomen bij veel patiënten. De mechanismen die tot deze schade leiden, worden niet volledig begrepen. Dit protocol beschrijft een tribologisch experiment om een metaal-op-kraakbeenkoppeling en uitgebreide analyse van het gewrichtskraakbeen te simuleren. Metalen implantaat materiaal wordt getest tegen runderokondaire cilinders als een model voor menselijk gewrichtskraakbeen. Door verschillende belastingen en schuifsnelheden toe te passen, kunnen fysiologische laadomstandigheden worden nagebootst. Om een uitgebreide analyse van de effecten op het gewrichtskraakbeen te bieden, worden histologie, metabolische activiteit en genexpressieanalyse beschreven in dit protocol. Het belangrijkste voordeel van tribologische testen is dat laadparameters vrij kunnen worden aangepast om in vivo omstandigheden te simuleren. Bovendien kunnen verschillende testoplossingen worden gebruikt om de invloed van smering of ontstekingsmiddelen te onderzoeken. Door het gebruik van genexpressieanalyse voor kraakbeenspecifieke genen en katabole genen, kunnen vroege veranderingen in het metabolisme van articulaire chondrocyten in reactie op mechanische belasting worden gedetecteerd.
Introduction
De behandeling van osteochondrale defecten is veeleisend en vereist in veel gevallen een operatie. Voor focale osteochondrale laesies bij patiënten van middelbare leeftijd zijn focale metalen implantaten een haalbare optie, vooral na het falen van de primaire behandeling, zoals beenmergstimulatie (BMS) of autologe chondrocyteimplantatie (ACI)1. Gedeeltelijke oppervlaktevervangingen kunnen worden beschouwd als bergingsprocedures die pijn kunnen verminderen en het bereik van beweging2kunnen verbeteren. Deze implantaten zijn meestal samengesteld uit een CoCrMo legering en zijn verkrijgbaar in verschillende maten en offset configuraties aan de normale anatomie3wedstrijd. Terwijl in eerste instantie ontwikkeld voor defecten op de mediale femorale condyle in de knie, dergelijke implantaten zijn nu beschikbaar en in gebruik voor de heup, enkel, schouder en elleboog4,5,6. Voor een bevredigend resultaat is het van cruciaal belang om de mechanische gewrichtsuitlijning en conditie van het tegengestelde kraakbeen te beoordelen. Bovendien is aangetoond dat de juiste implantatie zonder uitsteeksel van het implantaat fundamenteel is7.
Klinische studies toonden uitstekende resultaten op korte termijn aan in termen van pijnvermindering en verbetering van de functie bij patiënten van middelbare leeftijd voor verschillende locaties5,6,8. In vergelijking met allograftimplantatie, focale metalen implantaten toestaan vroeg gewicht lager. Het tegengestelde gewrichtskraakbeen vertoonde echter versnelde slijtage bij een aanzienlijk aantal patiëntenvan 9,10. Vandaar, zelfs met de juiste plaatsing, in veel gevallen degeneratie van het inheemse kraakbeen lijkt onvermijdelijk, terwijl de onderliggende mechanismen onduidelijk blijven. Vergelijkbare degeneratieve veranderingen zijn waargenomen na bipolaire hemiarthroplastie van de heup11 en worden verhoogd met activiteit en belasting12.
Tribologische experimenten bieden de mogelijkheid om dergelijke combinaties in vitro te bestuderen en verschillende laadsituaties te simuleren die zich voordoen onder fysiologische omstandigheden13. Het gebruik van osteochondrale pinnen biedt een eenvoudig geometriemodel om de tribologie van gewrichtskraakbeen glijden tegen inheemse kraakbeen of een implantaat materiaal14 te onderzoeken en kan verder worden gebruikt in hele gezamenlijke simulatie modellen15. Metaal-op-kraakbeen combinaties tonen versnelde kraakbeen slijtage, extracellulaire matrix verstoring, en verminderde levensvatbaarheid van de cel in de oppervlakkige zone in vergelijking met een kraakbeen-op-kraakbeen koppeling16. Schade aan het kraakbeen deed zich voornamelijk voor in de vorm van delaminatie tussen de oppervlakkige en middelste zones17. De mechanismen die leiden tot kraakbeendegeneratie zijn echter niet volledig begrepen. Dit protocol biedt een uitgebreide analyse van de biosynthetische activiteit van gewrichtskraakbeen. Door de bepaling van metabole activiteit en genexpressieniveaus van katabole genen, kunnen vroege indicaties voor kraakbeenafbraak worden geïdentificeerd. Het voordeel van in vitro tribologische experimenten is dat laadparameters kunnen worden aangepast om verschillende laadomstandigheden na te bootsen.
Daarom is het volgende protocol geschikt om een metaal-op-kraakbeenkoppeling te simuleren, wat een experimenteel hemiarthroplastiemodel vertegenwoordigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van metalen cilinders
- Analyseer cilindrische kobalt-chroom-molybdeen (CoCrMo) staven voldoen aan de standaard specificaties voor chirurgische implantaten voor hun chemische samenstelling met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM) met energiedispersieve x-ray spectroscopie per protocol van de fabrikant om de opgegeven waarden te bevestigen.
OPMERKING: De elementaire samenstelling van de CoCrMo legering die voor dit experiment wordt gebruikt is 65% Co, 28% Cr, 5% Mo en 2% anderen. - Nat malen van de monsters met silicium carbide slijppapier te beginnen met een korrelgrootte van 500. Gebruik slijppapier in toenemende orde tot een korrelgrootte van 4000.
- Polijst de cilinder met 3 μm en 1 μm pasta om een oppervlakteruwheid te bereiken die binnen het tolerantieniveau van oppervlakteafwerkingsvereisten voor metaalchirurgische implantaten (ISO 5832-12:2019) en totale en gedeeltelijke gewrichtsvervangende implantaten (ISO 21534:2007) ligt.
OPMERKING: De gemiddelde oppervlakteruwheid wordt bepaald met behulp van een confocale microscoop. - Snijd CoCrMo-staven (Ø van 6 mm) door aan cilinders met een lengte van 10 mm.
2. Oogsten van osteochondrale cilinders
- Gebruik runderverstikkende gewrichten van skeletrijpe dieren (18-24 maanden op het moment van het offer) en houd ze in en koel tot ontleding binnen 24 uur na het offer.
LET OP: Joints worden gekocht bij de plaatselijke slager. Het gewricht blijft gesloten tot dissectie. - Om cilindrische osteochondrale pluggen te oogsten onder aseptische omstandigheden, desinfecteren de knie en het uitvoeren van een artrose en bloot de mediale femorale condyle.
OPMERKING: De dissectie moet met de nodige voorzichtigheid worden uitgevoerd om het gewrichtsoppervlak niet te beschadigen. - Inspecteer het gewrichtsoppervlak op macroscopische beschadigingen.
OPMERKING: Gooi het monster weg als het kraakbeen zijn witachtige, gladde en glanzende uiterlijk mist of als er blaren, scheuren of grotere gebreken zijn. - Lijn de snijbuis loodrecht uit op het gewrichtsoppervlak van het gewichtsdragende gebied en drijf het apparaat in het kraakbeen en subchondrale bot door stevige slagen met een hamer. Draai het apparaat met een plotselinge beweging met de klok mee op een penetratiediepte van 15 mm.
- Verwijder het apparaat, steek de witte knop in en schroef het erin totdat de onderkant van de osteochondrale stekker zichtbaar is.
- Markeer de anteroposterior oriëntatie van de monsters met een steriele marker om de osteochondrale cilinder dienovereenkomstig te regelen tijdens het testen.
OPMERKING: Het driedimensionale collageennetwerk en de complexe architectuur vergemakkelijken de unieke mechanische eigenschappen van gewrichtskraakbeen en moeten worden overwogen in de oriëntatie van de monsters. - Spoel het monster af met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om bloed en vetweefsel af te wassen.
- Herhaal de hierboven genoemde stappen om het gewenste aantal osteochondrale pluggen (8 mm diameter, 15 mm lengte) te oogsten.
OPMERKING: Typisch, 9 tot 12 osteochondrale cilinders kunnen worden geoogst uit het gewicht lager gebied op de mediale femorale condyle. - Plaats de monsters in dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium met 10% foetale runderserum, aangevuld met antibiotica (penicilline 200 U/mL; streptomycine 0,2 mg/mL) en amphotericine B 2,5 μg/mL en bewaar ze bij 4 °C tot het testen om de levensvatbaarheid te behouden.
- Analyseer de controle osteochondrale pluggen direct na het oogsten om basiswaarden vast te stellen (zie analyse sectie).
3. Tribologische tests
- Voer de experimenten uit met behulp van een commercieel verkrijgbaar reciprocating tribometer met een cilinder-op-plaat configuratie. Eisen voor het apparaat zijn verticaal laden en instelbare laad- en schuifsnelheid. Bovendien maakt een vloeibare cel het mogelijk om de tests in een smeeroplossing uit te voeren.
- Bepaal de contactdruk in het CoCrMo-on-kraakbeensysteem met behulp van een drukmeetfilm. Plaats de drukmeetfolie op de interface en pas statische belasting toe voor 30 s om de initiële contactdruk, contactgrootte en vorm te bepalen. Door de convexiteit van de metalen cilinder en het gewrichtskraakbeen heeft het eerste contactgebied een elliptische vorm in deze configuratie.
OPMERKING: De drukmeetfilm reageert op de toegepaste druk met rode verkleuring van zones waar de drempeldruk wordt bereikt of overschreden. Voor 1 N van de belasting werd de contactdruk rond 2 MPa bepaald door visuele vergelijking met gedefinieerde contactdruk. - Bevestig de osteochondrale cilinders op de onderste monsterhouder met de markering uitgelijnd met de schuifrichting en monteer de CoCrMo-cilinders op de bovenste belastingscel.
- Voeg de testoplossing (PBS met 3 g/L hyaluronzuur) toe aan de vloeibare cel die resulteert in het onderdompelen van de osteochondrale cilinder en het bedekken van de metaalkraakbeen schuifinterface.
- Stel de testparameters in (voorgeschreven normale kracht, slag en glijdende snelheid), die vervolgens tijdens de test worden toegepast en gehandhaafd.
OPMERKING: De lijnlengte van de reciprocating motion moet worden ingesteld op basis van het contactgebied om een migratiecontactgebied (MCA) te maken. Voor pluggen met een diameter van 8 mm zorgt een slag van 2 mm voor een adequate rehydratie van het kraakbeen. - Begin met het wederkerig glijden van de CoCrMo cilinder tegen het gewrichtskraakbeen ondergedompeld in de smeeroplossing met de ingestelde laadparameters.
- Controleer de wrijvingscoëfficiënt (COF) tijdens de experimenten.
OPMERKING: Het COF wordt automatisch beoordeeld, maar kan worden berekend aan de hand van de vergelijking μ=F/W (μ - wrijvingscoëfficiënt; F - wrijvingskracht; W - normale belasting die door het systeem wordt toegepast). - Beëindig het experiment na de gewenste testperiode.
- Verwijder de osteochondrale plug uit de monsterhouder, spoel deze af met PBS en bewaar deze op medium tot verdere biologische analyse (zie hieronder).
- Dompel controlemonsters in de testoplossing onder bij kamertemperatuur voor de duur van de test en analyseer samen met monsters die zijn blootgesteld aan mechanische belasting.
4. Analyse
OPMERKING: Osteochondrale cilinder worden geanalyseerd op metabole activiteit en genexpressie om biologische activiteit te onderzoeken; histologie wordt uitgevoerd om de integriteit van het kraakbeenoppervlak en de onderliggende matrix te bestuderen.
- Histologie
- Voor histologische analyse, dompel de osteochondrale pluggen in 4% gebufferde formaldehyde oplossing bij kamertemperatuur tot verdere verwerking.
- Spoel de monsters met PBS en plaats ze in een plastic vat.
- Voeg een overmaat van de kant-en-klare sticker-oplossing, zodat alle monsters zijn gedekt.
- Breng constante agitatie gedurende 4 weken aan voor volledige ontkalking.
- Na ontkalking de monsters in op water oplosbare glycolen en harsen insluiten en opslaan op −80 °C.
- Verkrijg 6 μm secties door te cryosectioning transversal naar het contactgebied.
- Bereid vervolgens de monsters voor Safranin O-kleuring en Fastgreen-tegensmeting met behulp van het protocol van een fabrikant.
- Leg histologische beelden vast met behulp van een microscoop en verwerk imaging processing software.
- Metabolische activiteit
OPMERKING: De metabolische activiteit van chondrocyten in het gewrichtskraakbeen wordt onderzocht met een XTT-gebaseerde ex vivo toxicologietest.- Spoel de osteochondrale plug met PBS en plaats het monster in een petrischaaltje.
- Plaats een 24-well plaat op een weegschaal en nul de schaal.
- Snijd het kraakbeen van de osteochondrale graft met een scalpel in een stuk.
- Doorsnijd het kraakbeen in twee gelijke stukken, zodat het contactgebied gelijkmatig over beide kraakbeenstukken wordt verdeeld en de helft tot 1 mm³ stukken gehakt. De tweede helft wordt gebruikt voor genexpressieanalyse.
- Breng het gehakt kraakbeen in een put van de voorbereide 24-put plaat en bepaal het weefsel gewicht.
- Herhaal de hierboven genoemde stappen voor elk monster en voeg 1 mL groeimedium toe aan elke put van de plaat.
- Voeg de XTT-oplossing (490 μL XTT-etiketteringsreagens en 10 μL activeringsreagens) toe volgens de instructies en mix van de fabrikant.
- Broed de plaat in bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 4 uur.
- Verwijder na incubatie de supernatant en breng deze over naar een buis van 5 mL.
- Haal het tetrazoliumproduct eruit door 0,5 mL dimethylsulfoxide (DMSO) toe te voegen aan het kraakbeenweefsel in de 24-putplaat en breng continue agitatie gedurende 1 uur aan bij kamertemperatuur.
- Verwijder de DMSO-oplossing en bundel deze met de eerder verzamelde XTT-oplossing.
- Breng 100 μL van het monster in drievouden over in een 96-putplaat op een plaatlezer en meet de absorptie op een golflengte van 492 nm en een referentiegolflengte bij 690 nm.
- Normaliseer de resulterende absorptiewaarden tot het natte gewicht van elk monster en voer analyse uit met behulp van software.
- Genexpressie analyse
- RNA-isolatie
OPMERKING: RNA isolatie wordt uitgevoerd met behulp van een commerciële kit(Tabel van materialen) volgens de instructies die door de fabrikant met kleine wijzigingen.- Mince de tweede helft van het kraakbeen weefsel verkregen uit de osteochondrale plug in kleine stukjes.
- Breng ze over op een buis met keramische kralen en 300 μL Lysis Buffer (met 1% β-mercaptoethanol).
LET OP: De monsters kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof tot verdere verwerking. - Ontdooi de monsters gedurende 2 minuten en gebruik de commerciële lyser voor homogenisatie van het weefsel. Breng 6500 rpm voor 20 s (homogenisatie stap) vier keer met een 2 min koeling fase na elke run (bij 4 °C met behulp van de commerciële lyser koelapparaat) om volledig te verstoren het weefsel.
- Voeg 20 μL proteinase K en 580 μL RNase-vrij water toe aan elke buis en broed ze 30 minuten bij 55 °C uit.
- Centrifugeer de monsters gedurende 3 minuten op 10.000 x g en breng de supernatant over op een buis van 1,5 mL.
- Voeg 0,5 volume van 90% ethanol toe aan elke buis en meng.
- Breng 700 μL van het monster over naar een RNA-bindingskolom die in een 2 mL-opvangbuis is geplaatst en centrifuge bij 8.000 x g voor 15 s.
- Gooi de doorstroom weg en herhaal de centrifugatiestap voor het volledige lysaat.
- Voeg 350 μL Buffer RW1 toe aan de kolom, centrifuge bij 8.000 x g voor 15 s en gooi de doorloop weg.
- Meng 10 μL DNase stock oplossing en 70 μL buffer RDD. Voeg de oplossing toe aan het RNA-zuiveringsmembraan en broed deze 15 minuten op kamertemperatuur.
- Voeg 350 μL Buffer RW1 toe aan de kolom en centrifuge bij 8.000 x g voor 15 s. Gooi de doorstroom weg.
- Voeg 500 μL Buffer RPE en centrifuge toe bij 8.000 x g voor 15 s. Gooi de doorstroom weg.
- Voeg 500 μL Buffer RPE toe aan de RNA-zuiveringskolom en centrifuge op 8.000 x g gedurende 2 minuten.
- Plaats de kolom in een opvangbuis van 1,5 mL en voeg 30 μL RNase-vrij water toe. Centrifuge op 8.000 x g gedurende 1 min.
- Bewaar het geïsoleerde RNA op -80 °C tot cDNA synthese.
- cDNA synthese
OPMERKING: Om aanvullend DNA (cDNA) uit messenger RNA (mRNA) te synthetiseren werd een commerciële kit (Table of Materials) gebruikt. RNA van bacteriofaag MS2 werd toegevoegd om geïsoleerd RNA te stabiliseren tijdens de cDNA-synthese.- Ontdooi en meng de reagentia. De samenstelling voor één enkele reactie is te zien in tabel 1.
- Voeg 16 μL RNA-monster toe aan het volume voor een enkele reactie (14 μL).
- Voer cDNA-synthese uit in een thermische cycler met behulp van de volgende parameters: 10 min bij 25 °C (primer annealing), 60 min bij 50 °C (DNA-synthese), 5 min bij 85 °C (denaturatie) en 5 min bij 20 °C (koelfase).
- Bewaar cDNA bij -20 °C tot real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie (RT-qPCR).
- RT-qPCR
OPMERKING: Voor RT-qPCR van rundermonsters zijn primers en sondes ontworpen met behulp van commerciële Real-Time qPCR-software (bijv. IDT) voor de genen GAPDH (Glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase), COL2A1 (Collagen type 2), ACAN (Aggrecan), COL1A1 (Collagen type 1), MMP-1 (Matrix Metalloproteinase-1) en MMP-13 (Matrix Metalloproteinase-13). Runderprimers en dubbel gebluste sondes werden geleverd door IDT. De reagentia die worden gebruikt voor één reactie om de efficiëntie en genexpressie te evalueren, worden weergegeven in tabel 2.- Doseer de mastermix van een enkele reactie (9 μL) op elke put van een 96-put PCR-plaat en voeg 1 μL cDNA toe aan elke reactie. Voer tests uit voor elk monster in drieduenkelingen.
- Sluit de PCR-plaat met afdichtingsolie en centrifuge op 877 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Voer RT-qPCR uit met behulp van een precisiethermische cycler met het volgende protocol: 95 °C voor 10 minuten, 45 cycli van versterking (95 °C voor 10 s, annealing voor 30 s, cDNA synthese) en 37 °C voor 30 s.
LET OP: Voor elke primer zijn specifieke temperaturen vereist. - Gebruik GAPDH samen met de doelgenen om de efficiëntie te bevestigen.
- Gebruik de meegeleverde software om de efficiëntie van elk gen te berekenen.
- Normaliseer de cyclusdrempelwaarden (CT) naar de expressie van het referentiegen GAPDH en gebruik de ΔCT-methode voor kwantificering.
- RNA-isolatie
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het contactgebied en de contactdruk moeten worden bevestigd met behulp van een drukmeetfilm (figuur 1). Fysiologische belastingstoestand kan worden bevestigd door te vergelijken met referentieafdrukken voor gedefinieerde contactdruk. Tijdens het testen wordt de wrijvingscoëfficiënt voortdurend gemonitord. Bij een migratiecontactgebied kan een lage wrijvingscoëfficiënt ten minste 1 uur(figuur 2)worden gehandhaafd. Met behulp van Safranin O kleuring van de extracellulaire matrix samenstelling en structuur kan worden bepaald (Figuur 3). De intensiteit van Safranin O kleuring is evenredig aan het proteoglycangehalte. Fast Green counterstains de niet-collageen sites en biedt een duidelijk contrast met de Safranin O kleuring. Het proteoglycangehalte varieert over het gewrichtsoppervlak, maar moet gedurende de gehele weefselsectie in basislijnmonsters uniform zijn(figuur 3A). Controlemonsters ondergedompeld in de testoplossing tonen extractie van GAG's, die kan worden tegengegaan door mechanische belasting (Figuur 3B, 3C). De metabolische activiteit van de runderische gewrichtschondrocyten is onafhankelijk van de oogstplaats, maar vertoont een toename met mechanische belasting ten opzichte van ongeladen regelaars (figuur 4). De genexpressieniveaus van kraakbeenspecifieke genen (COL2A1, ACAN) nemen toe met fysiologische belastingsomstandigheden, terwijl katabole genen (COL1A1 en MMP13) zijn upgereguleerd met stationair contactgebied(figuur 5).
| Volume (μl) | |
| Transcriptor RT Reacties Buffer 5x conc. | 6 |
| Protector RNase Inhibitor 40U/μl | 0.75 |
| Deoxynucleotide Mix 10 mM per stuk | 3 |
| Willekeurige Hexamer Primer 600 μM | 3 |
| Transcriptor Reverse Transcriptase 20 U/μl | 0.75 |
| MS2 RNA (0,8 μg/μl) | 0.375 |
| Nuclease gratis gedestilleerd water | 0.125 |
| Totaal volume | 14 |
Tabel 1: Reagentia voor één reactie voor cDNA-synthese.
| Volume (μl) | |
| FastStart Probe Master 2X | 5 |
| Hydrolyse sonde 2,5 μM | 1 |
| Links PrimerGAPDH 5 μM | |
| Juiste Primer GAPDH 5 μM | |
| Nuclease gratis gedestilleerd water | 3 |
| Totale mastermix | 9 |
Tabel 2: Reagentia voor de Master Mix voor één PCR.
Figuur 1: Pressure meting van het oorspronkelijke contactgebied op de metaalkraakbeeninterface voordat u test. Door de convexiteit van de metalen cilinder en het gewrichtsoppervlak en de elastische eigenschappen is het eerste contactgebied elliptisch. Tijdens het glijden beweegt dit eerste contactgebied met een slag van 2 mm, wat resulteert in een groter gebied dat wordt blootgesteld aan mechanische belasting; schaalbalk = 2 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Tijdafhankelijke wrijvingscoëfficiënt (duur 1 uur) voor zeven monsters getest bij een schuifsnelheid van 8 mm/s en 1 N-belasting (2 MPa-contactdruk). Elke gekleurde lijn vertegenwoordigt de COF van een osteochondrale cilinder. De waargenomen variabiliteit is binnen de grenzen voor biologische monsters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Histologische dwarsdoorsnedes van runderokondische monsters bevlekt met Safranin-O en Fast Green. (A) Basismonsters vertonen een hoog GAG-gehalte in het gehele gewrichtskraakbeen. (B) Controle monster ondergedompeld in testoplossing zonder mechanische belasting tonen minder Safranin-O vlekken in de middelste zone, indicatie van een extractie van proteoglycanen. (C) Geteste monsters vertonen een hoger GAG-gehalte in vergelijking met de bedieningsorganen, wat duidt op mechanische stimulatie; schaalbalk = 250 μm Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Metabolische activiteit van runderarticulaire chondrocyten na tribologische tests met verschillende ladingsvariaties en -controles. De horizontale stippellijn vertegenwoordigt basislijnniveaus. De niet-parametrische Kruskal-Wallis-test werd uitgevoerd ter vergelijking tussen testgroepen, gevolgd door dunn's post hoc-test in geval van betekenis. *p < 0,05. Dit cijfer is gewijzigd van Stotter et al.18. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Genexpressie van kraakbeenspecifieke genen na tribologische testen met verschillende laadomstandigheden en controles. COL2A1=collageen type 2; ACAN=aggrecan; COL1A1= collageen type 1; MMP13= matrixmetalloproteinase 13. De expressieniveaus werden genormaliseerd naar het huishoudgen GAPDH (glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase). De horizontale stippellijnen vertegenwoordigen basisexpressieniveaus. De niet-parametrische Kruskal-Wallis-test werd uitgevoerd ter vergelijking tussen testgroepen, gevolgd door dunn's post hoc-test in geval van betekenis. *p < 0,05. Dit cijfer is gewijzigd van Stotter et al.18. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Focale metalen implantaten vormen een bergingsprocedure voor osteochondrale defecten, vooral bij patiënten van middelbare leeftijd en na een mislukte primaire behandeling. Hoewel klinische studies veelbelovende resultaten op korte termijn aantoonden, is een waargenomen complicatie schade aan het tegengestelde, inheemsekraakbeen 10. Kadaver en biomechanische studies tonen duidelijk bewijs dat een goede implantatie met vlakke of licht verzonken positionering natuurlijke contactdrukbehoudt 19. Tribologische experimenten bieden de mogelijkheid om verschillende kraakbeenkoppelingen in vitro te testen. In dergelijke omstandigheden kunnen laadomstandigheden, smering, materiaalkoppelingen en duur naar wens worden aangepast.
Runderkraakbeen is in grote hoeveelheden verkrijgbaar in het plaatselijke slachthuis. De cellaliteit en de zonale structuur zijn zeer vergelijkbaar met de menselijke femorale condyles20. Echter, proteoglycan inhoud is site-specifiek, terwijl genexpressie niveaus zijn aangetoond dat uniform over het gewrichtsoppervlak. In dit protocol werden osteochondrale pluggen geoogst uit het gewicht lager gebied. Kraakbeendikte, collageenarchitectuur en resulterende tribologische eigenschappen tonen regionale verschillen over het gewrichtsoppervlak16. De beperking van het gebruik van osteochondrale stekkers in een ongeconcofinede laadopstelling met een verstoord collageennetwerk en veranderde vloeistofdruk in vergelijking met hele gezamenlijke modellen moeten worden overwogen.
In de meeste tribologische studies wordt PBS alleen gebruikt als testoplossing om robuustere gegevens te genereren. PBS is een bufferoplossing met isotone osmolariteit en helpt bij het handhaven van een constante pH tijdens biologische experimenten. Het gebruik van PBS met hyaluronzuur zorgt voor grenssmering en minder wrijving21. Synoviale vloeistof vermindert dan ook de wrijvingscoëfficiënt en verbetert de vloeistofdruk in vergelijking met zoutlijn22. De wrijvingscoëfficiënt is afhankelijk van verschillende systeemeigenschappen, blijkt uit de klassieke Stribeck Curve. De Stribeck Curve heeft betrekking op de wrijvingscoëfficiënt en viscositeit, snelheid en belasting en presenteert de basissmeringregimes: grens,gemengde en hydrodynamische smering. Grenssmering kan worden verkregen met PBS alleen als smeervloeistof, maar de laadparameters zouden dienovereenkomstig moeten worden aangepast. De COF geleverd uit de tests zijn gemiddelde waarden over de slag. Er kan dus van worden uitgegaan dat er tijdens de cyclus verschillende smeringomstandigheden optreden. Tijdens stilstand bij omkeringspositie kunnen randvoorwaarden heersen, terwijl gemengde smering tijdens het glijden overheersend kan zijn. Op basis van de absolute duur tijdens de glijdende cyclus zou deze meer invloed hebben gehad op de gemiddelde COF-waarde.
Om fysiologische omstandigheden in gewrichten tijdens dagelijkse activiteiten te onderzoeken, kunnen de laadomstandigheden dienovereenkomstig worden aangepast in de tribometersoftware. Drukgevoelige metingen moeten worden gebruikt om de gewenste contactdruk te bevestigen. Gemelde femorotibial contactdruk variëren tussen 1 MPa tijdens het staan en tot 10 MPa tijdens downhill running23. Met een focal resurfacing, implantaat druk zijn net iets verhoogd in vergelijking met gezonde gewrichten24. Gemelde relatieve glijdende snelheden tijdens de loopcyclus worden gemeld tot 100 mm/s met hoge variaties tijdens de verschillende fasen. Dit betekent dat relatieve gewrichtsbewegingen de snelheden overschrijden die in deze tribologische opstelling kunnen worden toegepast. Om natuurlijke kinematische omstandigheden en contactdruk in gezonde kniegewrichten na te bootsen, variëren de laadomstandigheden van 1 tot 10 MPa contactdruk en 5 tot 100 mm/s schuifsnelheid. Hoewel hoge belastingen in deze experimentele opstelling kunnen worden toegepast, is het bereik van de glijdende snelheden beperkt. Pathologische belastingsomstandigheden, zowel overbelasting als onvoldoende belastingen, kunnen ook worden gesimuleerd. Lage glijdende snelheden of statische belasting stellen immobilisatie gelijk, terwijl hogere belastingen niet-fysiologische mechanische stimulatie vertegenwoordigen.
Aangezien enzymatische spijsvertering de expressie van kraakbeenspecifieke genen kan beïnvloeden, wordt een niet-enzymatische weefselhomogenisatie beschreven in dit protocol. Tijdens de cDNA synthese wordt naast de instructies ook RNA van bacteriofaag MS2 toegevoegd voor stabilisatiedoeleinden. Genexpressieniveaus, maar niet eiwitten, werden geanalyseerd om vroege veranderingen in de biosynthetische activiteit van articulaire chondrocyten te detecteren. Naast histologische secties en metabole activiteit, deze tests bieden uitgebreide informatie over de effecten van mechanische belasting op gewrichtskraakbeen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door NÖ Forschungs- und Bildungsges.m.b.H. en de provinciale overheid van Neder-Oostenrijk via de Life Science Calls (Project ID: LSC15-019) en door het Oostenrijkse COMET Program (Project K2 XTribology, Grant No. 849109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | A-2942-100ML | |
| buffered formaldehyde solution 4% | VWR | 97131000 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) | Roche Diagnostics | 11465015001 | XTT-based ex vivo toxicology assay |
| CoCrMo raw material | Acnis International | CoCrMo rods 6mm in diameter | |
| CryoStar NX70 Cryostat | Thermo Fischer Scientific | cryosectioning device | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sidma-Aldrich Chemie | D 2438-10ML | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | medium | |
| fetal bovine serum | Gibco | ||
| Hyaluronic acid | Anika Therapeutics Inc. | component of lubricating solution | |
| iCycler | BioRad | thermal cycler | |
| Leica microscope DM?1000 | Leica | microscope for histology | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Diagnostics | ||
| LightCycler 96 | Roche Diagnostics | thermal cycler for PCR | |
| MagNA Lyser Green Beads | Roche Diagnostics | 3358941001 | |
| Osteochondral Autograft Transfer System (OATS) | Arthrex Inc. | cutting tube for harvesting osteochondral cylinders | |
| osteosoft | Merck | 1017279010 | decalcifier-solution |
| Penicillin /Streptomycin | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ML | |
| phosphate?buffered saline | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | PBS | |
| Prescale Low Pressure | Fujifilm | pressure indicating film | |
| RNeasy Fibrous Tissue Kit | QIAGEN | 74404 | |
| Synergy 2 | BioTek Instruments | plate reader | |
| Tetra?Falex MUST | Falex Tribology | Tribometer | |
| Tissue? Tek O.C.T. | SAKURA | 4583 | embedding formulation |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche Diagnostics | 40897030001 | |
| β-mercaptoethanol | Sidma-Aldrich Chemie | M3148 |
References
- Zengerink, M., Struijs, P. A. A. A., Tol, J. L., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral lesions of the talus: a systematic review. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 18 (2), 238-246 (2009).
- Aurich, M., et al. Behandlung osteochondraler Läsionen des Sprunggelenks: Empfehlungen der Arbeitsgemeinschaft Klinische Geweberegeneration der DGOU. Zeitschrift fur Orthopadie und Unfallchirurgie. 155 (1), 92-99 (2017).
- Van Bergen, C. J. A., Zengerink, M., Blankevoort, L., Van Sterkenburg, M. N., Van Oldenrijk, J., Van Dijk, C. N. Novel metallic implantation technique for osteochondral defects of the medial talar dome. Acta Orthopaedica. 81 (4), 495-502 (2010).
- Sweet, S. J., Takara, T., Ho, L., Tibone, J. E. Primary Partial Humeral Head Resurfacing. The American Journal of Sports Medicine. 43 (3), 579-587 (2015).
- Becher, C., et al. Minimum 5-year results of focal articular prosthetic resurfacing for the treatment of full-thickness articular cartilage defects in the knee. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 131 (8), 1135-1143 (2011).
- Lea, M. A., Barkatali, B., Porter, M. L., Board, T. N. Osteochondral Lesion of the Hip Treated with Partial Femoral Head Resurfacing. Case Report and Six-Year Follow-up. HIP International. 24 (4), 417-420 (2018).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Paessler, H. H., Skrbensky, G. Effects of a contoured articular prosthetic device on tibiofemoral peak contact pressure: a biomechanical study. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 16 (1), 56-63 (2007).
- Malahias, M. -A., Chytas, D., Thorey, F. The clinical outcome of the different HemiCAP and UniCAP knee implants: A systematic and comprehensive review. Orthopedic Reviews. 10 (2), (2018).
- Dhollander, A. A. M., et al. The use of a prosthetic inlay resurfacing as a salvage procedure for a failed cartilage repair. Knee Surgery, Sports Traumatology. 23 (8), 2208-2212 (2014).
- Van Bergen, C. J. A. A., van Eekeren, I. C. M. M., Reilingh, M. L., Sierevelt, I. N., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral defects of the talus with a metal resurfacing inlay implant after failed previous surgery. Bone and Joint Journal. 95 (12), 1650-1655 (2013).
- Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Hwang, K. -T. T., Choi, I. -Y. Y. The cartilage degeneration and joint motion of bipolar hemiarthroplasty. International Orthopaedics. 36 (10), 2015-2020 (2012).
- Moon, K. H., et al. Degeneration of Acetabular Articular Cartilage to Bipolar Hemiarthroplasty. Yonsei Medical Journal. 49 (5), 716-719 (2008).
- Wimmer, M. A., Pacione, C., Laurent, M. P., Chubinskaya, S. In vitro wear testing of living cartilage articulating against alumina. Journal of Orthopaedic Research. , (2016).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Simple geometry tribological study of osteochondral graft implantation in the knee. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 232 (3), 249-256 (2018).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Development of a preclinical natural porcine knee simulation model for the tribological assessment of osteochondral grafts in vitro. Journal of Biomechanics. 77, 91-98 (2018).
- Trevino, R. L., et al. Establishing a live cartilage-on-cartilage interface for tribological testing. Biotribology. 9, 1-11 (2017).
- Oungoulian, S. R., et al. Wear and damage of articular cartilage with friction against orthopedic implant materials. Journal of Biomechanics. 48 (10), 1957-1964 (2015).
- Stotter, C., et al. Effects of Loading Conditions on Articular Cartilage in a Metal-on-Cartilage Pairing. Journal of Orthopaedic Research. 37 (12), 2531-2539 (2019).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Tibesku, C. O., von Skrbensky, G. Tibiofemoral contact mechanics with a femoral resurfacing prosthesis and a non-functional meniscus. Clinical biomechanics. 24 (8), Bristol, Avon. 648-654 (2009).
- Temple, D. K., Cederlund, A. A., Lawless, B. M., Aspden, R. M., Espino, D. M. Viscoelastic properties of human and bovine articular cartilage: a comparison of frequency-dependent trends. BMC Musculoskeletal Disorders. , 1-8 (2016).
- Caligaris, M., Ateshian, G. A. Effects of sustained interstitial fluid pressurization under migrating contact area, and boundary lubrication by synovial fluid, on cartilage friction. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (10), 1220-1227 (2008).
- Burris, D. L., Ramsey, L., Graham, B. T., Price, C., Moore, A. C. How Sliding and Hydrodynamics Contribute to Articular Cartilage Fluid and Lubrication Recovery. Tribology Letters. 67 (2), 1-10 (2019).
- Mamat, N., Nor, M. Numerical measurement of contact pressure in the tibiofemoral joint during gait. International Conference on Biomedical Engineering (ICoBE). , 27-28 (2012).
- Manda, K., Ryd, L., Eriksson, A. Finite element simulations of a focal knee resurfacing implant applied to localized cartilage defects in a sheep model. Journal of Biomechanics. 44 (5), 794-801 (2011).
