Summary
Este protocolo descreve a preparação, testes biotribológicos e análise de cilindros osteocondrais deslizando contra material de implante metálico. As medidas de desfecho incluídas neste protocolo são atividade metabólica, expressão genética e histologia.
Abstract
Defeitos osteocondriais em pacientes de meia-idade podem ser tratados com implantes metálicos focais. Desenvolvidos pela primeira vez para defeitos na articulação do joelho, os implantes estão agora disponíveis para o ombro, quadril, tornozelo e a primeira articulação metatarsalphalangeal. Ao mesmo tempo em que proporcionam redução da dor e melhora clínica, alterações degenerativas progressivas da cartilagem oposta são observadas em muitos pacientes. Os mecanismos que levam a esse dano não são totalmente compreendidos. Este protocolo descreve um experimento tribológico para simular um emparelhamento metal-sobre-cartilagem e uma análise abrangente da cartilagem articular. O material de implante metálico é testado contra cilindros osteocondriais bovinos como modelo para cartilagem articular humana. Aplicando cargas diferentes e velocidades deslizantes, as condições de carregamento fisiológico podem ser imitadas. Para fornecer uma análise abrangente dos efeitos sobre a cartilagem articular, histologia, atividade metabólica e análise de expressão genética estão descritos neste protocolo. A principal vantagem do teste tribológico é que os parâmetros de carregamento podem ser ajustados livremente para simular condições in vivo. Além disso, diferentes soluções de teste podem ser usadas para investigar a influência de agentes de lubrificação ou pró-inflamatórios. Usando a análise de expressão genética para genes específicos da cartilagem e genes catabólicos, podem ser detectadas alterações precoces no metabolismo de condrócitos articular em resposta ao carregamento mecânico.
Introduction
O tratamento de defeitos osteocondriais é exigente e requer cirurgia em muitos casos. Para lesões osteocondriais focais em pacientes de meia-idade, implantes metálicos focais são uma opção viável, especialmente após a falha do tratamento primário, como estimulação da medula óssea (SMO) ou implantação de condrócito autólogo (ACI)1. Substituições parciais de superfície podem ser consideradas procedimentos de salvamento que podem reduzir a dor e melhorar a faixa de movimento2. Esses implantes são tipicamente compostos de uma linha de terapia CoCrMo e estão disponíveis em diferentes tamanhos e configurações offset para corresponder à anatomia normal3. Embora inicialmente desenvolvidos para defeitos no condíle femoral medial no joelho, tais implantes estão agora disponíveis e em uso para o quadril, tornozelo, ombro e cotovelo4,5,6. Para um desfecho satisfatório, é fundamental avaliar o alinhamento mecânico das articulações e a condição da cartilagem oposta. Além disso, a implantação correta sem a saliência do implante tem se mostrado fundamental7.
Estudos clínicos demonstraram excelentes resultados de curto prazo em termos de redução da dor e melhora da função em pacientes de meia-idade para diversos locais5,6,8. Comparados com a implantação de aoenxerto, os implantes metálicos focais permitem o rolamento precoce do peso. No entanto, a cartilagem articular oposta mostrou desgaste acelerado em um número considerável de pacientes9,10. Assim, mesmo com a colocação adequada, em muitos casos a degeneração da cartilagem nativa parece inevitável, enquanto os mecanismos subjacentes permanecem incertos. Alterações degenerativas semelhantes foram observadas após hemiartropa bipolar do quadril11 e são aumentadas com atividade e carregamento12.
Experimentos triológicos proporcionam a possibilidade de estudar tais pares in vitro e simular diferentes situações de carregamento ocorridas em condições fisiológicas13. O uso de pinos osteocondriais oferece um modelo de geometria simples para investigar a tribologia da cartilagem articular deslizando contra cartilagem nativa ou qualquer material de implante14 e pode ser usado ainda em modelos inteiros de simulação articular15. Os pares metálico-sobre-cartilagem mostram desgaste acelerado da cartilagem, interrupção da matriz extracelular e diminuição da viabilidade celular na zona superficial em comparação com um pareamento cartilagem-sobre-cartilagem16. Os danos na cartilagem ocorreram principalmente na forma de delaminação entre as zonas superficial e média17. No entanto, os mecanismos que levam à degeneração da cartilagem não são totalmente compreendidos. Este protocolo fornece uma análise abrangente da atividade biossintética da cartilagem articular. Pela determinação da atividade metabólica e dos níveis de expressão genética dos genes catabólicos, podem ser identificadas indicações precoces para a quebra da cartilagem. A vantagem dos experimentos triológicos in vitro é que os parâmetros de carregamento podem ser ajustados para imitar várias condições de carregamento.
Assim, o protocolo a seguir é adequado para simular um emparelhamento metal-sobre-cartilagem, representando um modelo experimental de hemiartropa.
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Protocol
1. Preparação de cilindros metálicos
- Analise as hastes cilíndricas cobalto-cromo-molbdenum (CoCrMo) que preenchem as especificações padrão para implantes cirúrgicos para sua composição química usando microscopia eletrônica de varredura (SEM) com espectroscopia de raios-X dispersiva de energia por protocolo do fabricante para confirmar valores fornecidos.
NOTA: A composição elementar da alloy CoCrMo utilizada para este experimento é de 65% Co, 28% Cr, 5% Mo e 2% outros. - Moer as amostras com papel de moagem de carboneto de silício começando com um tamanho de grão de 500. Use papel de moagem em ordem crescente até um tamanho de grão de 4000.
- Polir o cilindro com pasta de 3 μm e 1 μm para alcançar uma rugosidade superficial que esteja dentro do nível de tolerância dos requisitos de acabamento da superfície para implantes cirúrgicos metálicos (ISO 5832-12:2019) e implantes de substituição articular total e parcial (ISO 21534:2007).
NOTA: A rugosidade média da superfície é determinada usando um microscópio confocal. - Corte as hastes CoCrMo (Ø de 6 mm) para cilindros com um comprimento de 10 mm.
2. Colheita de cilindros osteocondrais
- Use juntas bovinas de animais maduros (idades entre 18 e 24 meses no momento do sacrifício) e mantenha-as contidas e resfriadas até a dissecção dentro de 24 horas após o sacrifício.
NOTA: As juntas são compradas do açougueiro local. A articulação permanece fechada até a dissecação. - Para colher os plugues osteocondriais cilíndricos em condições assépticas, desinfetar o joelho e realizar uma artrotomia e expor o condíle femoral medial.
NOTA: A dissecação deve ser realizada com cautela para não danificar a superfície articular. - Inspecione a superfície articular em busca de danos macroscópicos.
NOTA: Descarte a amostra se a cartilagem não tiver sua aparência esbranquiçada, lisa e brilhante ou se houver bolhas, fissuras ou defeitos maiores. - Alinhe o tubo de corte perpendicular à superfície articular da área de rolamento de peso e conduza o dispositivo para dentro da cartilagem e osso subcondral por golpes firmes com um martelo. A 15 mm de profundidade de penetração, torça o dispositivo no sentido horário com um movimento repentino.
- Retire o dispositivo, insira o botão branco e enrosque-o até que a extremidade inferior do plugue osteocondral esteja visível.
- Marque a orientação anteroposterior das amostras com um marcador estéril, a fim de organizar o cilindro osteocondral em conformidade durante o teste.
NOTA: A rede tridimensional de colágeno e sua arquitetura complexa facilitam as propriedades mecânicas únicas da cartilagem articular e devem ser consideradas na orientação das amostras. - Enxágüe a amostra com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) para lavar sangue e tecido adiposo.
- Repita as etapas mencionadas acima para colher o número desejado de tampões osteocondriais (diâmetro de 8 mm, 15 mm de comprimento).
NOTA: Normalmente, 9 a 12 cilindros osteocondrais podem ser colhidos da área de rolamento de peso no condíle femoral medial. - Coloque as amostras no meio modificado da Águia de Dulbecco contendo 10% de soro bovino fetal, complementado com antibióticos (penicilina 200 U/mL; estreptomicina 0,2 mg/mL) e anfotericina B 2,5 μg/mL e armazená-las a 4 °C até o teste para manter a viabilidade.
- Analise os plugues osteocondrais de controle imediatamente após a colheita para estabelecer valores de linha de base (ver seção de análise).
3. Testes triológicos
- Realize os experimentos usando um tribometer recíproco comercialmente disponível com uma configuração de cilindro na placa. Os requisitos para o dispositivo são carregamento vertical e carga ajustável e velocidade de deslizamento. Além disso, uma célula líquida permite realizar os testes em uma solução lubrificante.
- Determine a pressão de contato no sistema CoCrMo-on-cartilagem usando uma filme de medição de pressão. Coloque a película de medição de pressão na interface e aplique carga estática para 30 s para determinar a pressão de contato inicial, o tamanho do contato e a forma. Devido à convexidade do cilindro metálico e da cartilagem articular, a área de contato inicial tem uma forma elíptica nesta configuração.
NOTA: O filme de medição de pressão reage à pressão aplicada mostrando descoloração vermelha de zonas onde a pressão do limiar é atingida ou excedida. Para 1 N de carga, a pressão de contato foi determinada em torno de 2 MPa por comparação visual com pressões de contato definidas. - Fixar os cilindros osteocondrais no suporte da amostra inferior com a marcação alinhada com a direção deslizante e montar os cilindros CoCrMo na célula de carga superior.
- Adicione a solução de teste (PBS com ácido hialurônico de 3 g/L) na célula líquida que resulta em submergir o cilindro osteocondral e cobrir a interface de deslizamento metal-cartilagem.
- Defina os parâmetros de teste (força normal prescrita, curso e velocidade de deslizamento), que são então aplicados e mantidos durante todo o teste.
NOTA: O comprimento do curso do movimento recíproco deve ser definido de acordo com a área de contato para criar uma área de contato migratório (MCA). Para os plugues de 8 mm de diâmetro, um curso de 2 mm permite uma reidratação adequada da cartilagem. - Inicie o deslizamento recíproco do cilindro CoCrMo contra a cartilagem articular imersa na solução lubrificante com os parâmetros de carregamento definidos.
- Monitore o coeficiente de atrito (COF) durante os experimentos.
NOTA: O COF é avaliado automaticamente, mas pode ser calculado usando a equação μ=F/W (μ - coeficiente de atrito; F - força de fricção; W - carga normal aplicada pelo sistema). - Termine o experimento após o período de teste desejado.
- Retire o plugue osteocondral do suporte da amostra, enxágüe-o com PBS e armazene-o em meio até uma análise biológica adicional (veja abaixo).
- Submerse amostras de controle na solução de teste à temperatura ambiente durante a duração do teste e analise juntamente com amostras que foram expostas ao carregamento mecânico.
4. Análise
NOTA: O cilindro osteocondral é analisado para atividade metabólica e expressão genética para investigar a atividade biológica; a histologia é realizada para estudar a integridade da superfície da cartilagem e a matriz subjacente.
- Histologia
- Para análise histológica, mergulhe os plugues osteocondral em solução de formaldeído tamponada de 4% à temperatura ambiente até um processamento posterior.
- Enxágüe as amostras com PBS e coloque-as em um vaso plástico.
- Adicione um excesso da solução de decalcificador pronta para uso para que todas as amostras sejam cobertas.
- Aplique agitação constante por 4 semanas para descalcificação completa.
- Após a decalcificação, incorpore as amostras em glicols solúveis em água e resinas e armazene-as a −80 °C.
- Obtenha seções de 6 μm por criosectioning transversal para a área de contato.
- Posteriormente, prepare as amostras para a coloração de Safranin O e contra-retenção fastgreen usando o protocolo do fabricante.
- Capture imagens histológicas usando um microscópio e processe usando software de processamento de imagens.
- Atividade metabólica
NOTA: A atividade metabólica dos condrócitos na cartilagem articular é investigada com um ensaio toxicológico ex vivo à base de XTT.- Enxágüe o plugue osteocondral usando PBS e coloque a amostra em uma placa de Petri.
- Coloque uma placa de 24 poços em uma escala e zero a balança.
- Corte a cartilagem do enxerto osteocondral com um bisturi inteiro.
- Bissecte a cartilagem em duas partes iguais para que a área de contato seja igualmente distribuída em ambos os pedaços de cartilagem e pica-se de meia a 1 mm³. A segunda metade é usada para análise de expressão genética.
- Transfira a cartilagem picada em um poço da placa preparada de 24 poços e determine o peso do tecido.
- Repita as etapas mencionadas acima para cada amostra e adicione 1 mL de meio de crescimento a cada poço da placa.
- Adicione a solução XTT (490 μL de reagente de rotulagem XTT e 10 μL de reagente de ativação) de acordo com a instrução e mistura do fabricante.
- Incubar a placa a 37 °C e 5% de CO2 por 4h.
- Após a incubação, remova o supernasal e transfira-o para um tubo de 5 mL.
- Extrair o produto tetrazolium adicionando 0,5 mL de sulfóxido de dimetila (DMSO) ao tecido da cartilagem na placa de 24 poços e aplique agitação contínua por 1h à temperatura ambiente.
- Remova a solução DMSO e colecione-a com a solução XTT coletada anteriormente.
- Transfira 100 μL da amostra em triplicados em uma placa de 96 poços em um leitor de placa e meça a absorvância em um comprimento de onda de 492 nm e um comprimento de onda de referência a 690 nm.
- Normalize os valores de absorção resultantes para o peso úmido de cada amostra e realize a análise utilizando software.
- Análise de expressão genética
- Isolamento do RNA
NOTA: O isolamento do RNA é realizado utilizando-se um kit comercial(Tabela de Materiais) deacordo com as instruções fornecidas pelo fabricante com pequenas alterações.- Pique a segunda metade do tecido da cartilagem obtida a partir do plugue osteocondral em pequenos pedaços.
- Transfira-os para um tubo contendo contas cerâmicas e 300 μL de Tampão de Lysis (contendo 1% β-mercaptoetanol).
NOTA: As amostras podem ser congeladas em nitrogênio líquido até um processamento posterior. - Descongele as amostras por 2 minutos e utilize o lyser comercial para homogeneização do tecido. Aplique 6500 rpm para 20 s (etapa de homogeneização) quatro vezes com uma fase de resfriamento de 2 minutos após cada execução (a 4 °C usando o dispositivo de resfriamento comercial) para interromper totalmente o tecido.
- Adicione 20 μL de proteinase K e 580 μL de água sem RNase em cada tubo e incuba-os a 55 °C por 30 min.
- Centrifugar as amostras por 3 min a 10.000 x g e transferir o supernasal para um tubo de 1,5 mL.
- Adicione 0,5 volumes de 90% de etanol a cada tubo e misture.
- Transfira 700 μL da amostra para uma coluna de ligação de RNA colocada em um tubo de coleta de 2 mL e centrífuga a 8.000 x g para 15 s.
- Descarte o fluxo e repita a etapa de centrifugação para o lise completo.
- Adicione 350 μL de Buffer RW1 à coluna, centrífuga a 8.000 x g para 15 s e descarte o fluxo..
- Misture 10 μL de solução de estoque DNase e 70 μL de BUFFER RDD. Adicione a solução à membrana de purificação do RNA e incuba-a à temperatura ambiente por 15 minutos.
- Adicione 350 μL de Buffer RW1 à coluna e centrífuga a 8.000 x g para 15 s. Descarte o fluxo.
- Adicione 500 μL de Buffer RPE e centrífuga a 8.000 x g para 15 s. Descarte o fluxo.
- Adicione 500 μL de RPE tampão à coluna de purificação do RNA e centrífuga a 8.000 x g por 2 min.
- Coloque a coluna em um tubo de coleta de 1,5 mL e adicione 30 μL de água sem RNase. Centrifugar a 8.000 x g por 1 min.
- Armazene o RNA isolado a -80 °C até a síntese de cDNA.
- Síntese cDNA
NOTA: Para sintetizar o DNA complementar (cDNA) do mensageiro RNA (mRNA) foi utilizado um kit comercial (Tabela de Materiais). O RNA do bacteriófago MS2 foi adicionado para estabilizar o RNA isolado durante a síntese de CDNA.- Descongele e misture os reagentes. A composição para uma única reação é mostrada na Tabela 1.
- Adicione 16 μL de amostra de RNA ao volume para uma única reação (14 μL).
- Realize a síntese de cDNA em um cicloviário térmico utilizando os seguintes parâmetros: 10 min a 25 °C (ressarcimento de primer), 60 min a 50 °C (síntese de DNA), 5 min a 85 °C (desnaturação) e 5 min a 20 °C (fase de resfriamento).
- Armazene cDNA a -20 °C até a reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR).
- RT-qPCR
NOTA: Para RT-qPCR de amostras bovinas, primers e sondas foram projetados usando software comercial de qPCR em tempo real (por exemplo, IDT) para os genes GAPDH (Glicealdeído 3-fosfato desidrogenase), COL2A1 (Colágeno tipo 2), ACAN (Aggrecan), COL1A1 (Colágeno tipo 1), MMP-1 (Matrix Metalloproteinase-1) e MMP-13 (Matrix Metalloproteinase-13). Primers bovinos e sondas duplas saciadas foram fornecidos pelo IDT. Os reagentes utilizados para uma única reação para avaliar a eficiência e a expressão genética são exibidos na Tabela 2.- Dispense a mistura mestre de uma única reação (9 μL) a cada poço de uma placa PCR de 96 poços e adicione 1 μL de cDNA a cada reação. Realizar testes para cada amostra em triplicados.
- Feche a placa PCR usando óleo de vedação e centrífuga a 877 x g por 10 min a 4 °C.
- Execute o RT-qPCR utilizando um cicloviário térmico de precisão com o seguinte protocolo: 95 °C para 10 min, 45 ciclos de amplificação (95 °C para 10 s, ressarcendo para 30 s, síntese de cDNA) e 37 °C para 30 s.
NOTA: São necessárias temperaturas específicas de ressarcial para cada primer. - Use GAPDH junto com os genes alvo para confirmar a eficiência.
- Use o software fornecido para calcular a eficiência de cada gene.
- Normalize os valores do limiar de ciclo (TC) à expressão do gene de referência GAPDH e use o método ΔΔCT para quantificação.
- Isolamento do RNA
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Representative Results
A área de contato e a pressão de contato devem ser confirmadas por meio de um filme de medição de pressão(Figura 1). A condição de carregamento fisiológico pode ser confirmada comparando-se com impressões de referência para pressões de contato definidas. Durante o teste, o coeficiente de atrito é monitorado constantemente. Com uma área de contato migratória, um coeficiente de baixo atrito pode ser mantido por pelo menos 1 h(Figura 2). Utilizando Safranin O a coloração da matriz extracelular e estrutura podem ser determinadas(Figura 3). A intensidade da coloração de Safranin O é proporcional ao teor proteoglycan. O Fast Green contra-ataca os locais não-colágenos e fornece um claro contraste com a coloração de Safranin O. O teor proteoglícano varia sobre a superfície articular, mas deve ser uniforme em toda a seção de tecido em amostras de linha de base(Figura 3A). Amostras de controle submersas na solução de teste mostram extração de GAGs, que podem ser neutralizadas por carregamento mecânico (Figura 3B, 3C). A atividade metabólica dos condrócitos articular bovinos é independente do local de colheita, mas mostra um aumento com carga mecânica em comparação com os controles descarregados(Figura 4). Os níveis de expressão genética dos genes específicos da cartilagem (COL2A1, ACAN) aumentam com as condições de carregamento fisiológico, enquanto os genes catabólicos (COL1A1 e MMP13) são regulados com área de contato estacionária(Figura 5).
| Volume (μl) | |
| Transcriptor RT Reactions Buffer 5x conc. | 6 |
| Inibidor de protetor RNase 40U/μl | 0.75 |
| Mistura deoxinucleotídeo 10 mM cada | 3 |
| Primer Hexamer aleatório 600 μM | 3 |
| Transcrição reversa do transcritor 20 U/μl | 0.75 |
| RNA MS2 (0,8 μg/μl) | 0.375 |
| Água destilada livre de nuclease | 0.125 |
| Volume total | 14 |
Tabela 1: Reagentes para uma única reação para síntese de CDNA.
| Volume (μl) | |
| FastStart Sonda Master 2X | 5 |
| Sonda de hidrolise 2,5 μM | 1 |
| PrimerGAPDH esquerda 5 μM | |
| Primer direito GAPDH 5 μM | |
| Água destilada livre de nuclease | 3 |
| Total Master Mix | 9 |
Tabela 2: Reagentes para o Mix Master para um único PCR.
Figura 1: Pressura medição da área de contato inicial na interface metal-cartilagem antes do teste. Devido à convexidade do cilindro metálico e da superfície articular e suas propriedades elásticas, a área de contato inicial é elíptica. Durante o deslizamento, esta área de contato inicial se move com um curso de 2 mm, resultando em uma área maior que está exposta ao carregamento mecânico; barra de escala = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Coeficiente de atrito dependente do tempo (duração de 1 hora) para sete amostras testadas a velocidade de deslizamento de 8 mm/s e carga de 1 N (pressão de contato de 2 MPa). Cada linha colorida representa o COF de um cilindro osteocondral. A variabilidade observada está dentro dos limites para amostras biológicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Seções histológicas de amostras osteocondrais bovinas manchadas com Safranin-O e Fast Green. (A) As amostras de linha de base mostram alto teor de GAG em toda a cartilagem articular. (B) A amostra de controle submersa em solução de teste sem carregamento mecânico mostra menos coloração safranin-O na zona média, indicando uma extração de proteoglícis. (C) As amostras testadas apresentam maior teor de GAG em comparação com os controles, indicando estimulação mecânica; barra de escala = 250 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Atividade metabólica de condrócitos articular bovinos após testes triológicos com diferentes variações e controles de carga. A linha pontilhada horizontal representa os níveis de linha de base. O teste não paramétrico de Kruskal-Wallis foi realizado para comparação entre os grupos de teste seguidos pelo teste pós-hoc de Dunn em caso de significância. *p < 0,05. Este número foi modificado a partir de Stotter et al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Expressão genética de genes específicos da cartilagem após testes triológicos com diferentes condições de carregamento e controles. COL2A1=colágeno tipo 2; ACAN=aggrecan; COL1A1= colágeno tipo 1; MMP13= matriz metaloproteinase 13. Os níveis de expressão foram normalizados para o gene de limpeza GAPDH (gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase). As linhas pontilhadas horizontais representam níveis de expressão da linha de base. O teste não paramétrico de Kruskal-Wallis foi realizado para comparação entre os grupos de teste seguidos pelo teste pós-hoc de Dunn em caso de significância. *p < 0,05. Este número foi modificado a partir de Stotter et al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Implantes metálicos focais representam um procedimento de salvamento para defeitos osteocondriais, especialmente em pacientes de meia-idade e após o tratamento primário falho. Embora estudos clínicos demonstrassem resultados promissores a curto prazo, uma complicação observada é danos à cartilagem nativaoposta 10. Estudos de cadáveres e biomecânicos mostram evidências claras de que a implantação adequada com posicionamento plano ou ligeiramente recesso mantém pressões naturais de contato19. Experimentos triológicos fornecem a possibilidade de testar vários pares de cartilagem in vitro. Em tais condições de carregamento, lubrificação, pares de materiais e duração podem ser ajustados conforme desejado.
A cartilagem bovina está disponível em alta quantidade no matadouro local. A celularidade e a estrutura zonal são muito semelhantes aos condyles femorais humanos20. No entanto, o conteúdo proteoglycan é específico do site, enquanto os níveis de expressão genética têm se mostrado uniformes sobre a superfície articular. Neste protocolo, os plugues osteocondrais foram colhidos da área de rolamento de peso. Espessura da cartilagem, arquitetura de colágeno e propriedades triológicas resultantes mostram diferenças regionais sobre a superfície articular16. A limitação do uso de plugues osteocondrais em uma configuração de carregamento não sincronizada com uma rede de colágeno interrompida e a pressurização de fluidos alterada em comparação com modelos articulares inteiros precisam ser consideradas.
Na maioria dos estudos tribológicos, somente a PBS é usada como solução de teste para gerar dados mais robustos. O PBS é uma solução tampão com osmolaridade isotônica e ajuda a manter um pH constante durante experimentos biológicos. O uso de PBS com ácido hialurônico fornece lubrificação de limites e redução do atrito21. Assim, o fluido sinovial reduz o coeficiente de atrito e melhora a pressurização do fluido em comparação com a solução salina22. O coeficiente de atrito depende de várias propriedades do sistema, demonstradas pela clássica Curva de Stribeck. A Curva de Stribeck relaciona o coeficiente de atrito e a viscosidade, velocidade e carga e apresenta os regimes básicos de lubrificação: limitação, lubrificação mista e hidrodinâmica. A lubrificação de limites pode ser obtida apenas com PBS como fluido lubrificante, mas os parâmetros de carregamento precisariam ser ajustados em conformidade. O COF entregue a partir dos testes são valores médios sobre o curso. Assim, pode-se supor que diferentes condições de lubrificação ocorrem durante o ciclo. Durante a paralisação na posição de reversão, as condições de fronteira podem estar prevalecendo, enquanto a lubrificação mista pode ser predominante durante o deslizamento. Com base na duração absoluta durante o ciclo de deslizamento, este último teria tido mais influência sobre o valor médio do COF.
Para investigar as condições fisiológicas que ocorrem nas articulações durante as atividades diárias, as condições de carregamento podem ser ajustadas de acordo com o software tribometer. Medidas sensíveis à pressão devem ser usadas para confirmar as pressões de contato desejadas. As pressões de contato femorotibiais relatadas variam entre 1 MPa durante a posição e até 10 MPa durante a descida de23. Com um ressurgimento focal, as pressões do implante são ligeiramente elevadas em comparação com as articulações saudáveis24. As velocidades de deslizamento relativas relatadas durante o ciclo de marcha são relatadas até 100 mm/s com altas variações durante as diferentes fases. Isso significa que os movimentos relativos das articulações excedem as velocidades que podem ser aplicadas nesta configuração tribológica. Para imitar condições cinéticas naturais e pressões de contato em articulações saudáveis do joelho, as condições de carregamento variam de 1 a 10 MPa de pressão de contato e velocidade de deslizamento de 5 a 100 mm/s. No entanto, enquanto altas cargas podem ser aplicadas nesta configuração experimental, a gama de velocidades deslizantes é limitada. Condições de carregamento patológico, tanto sobrecarga quanto cargas inadequadas, também podem ser simuladas. Baixas velocidades de deslizamento ou carregamento estático equivalem à imobilização, enquanto cargas mais altas representam estimulação mecânica não fisiológica.
Como a digestão enzimática pode afetar a expressão de genes específicos da cartilagem, uma homogeneização de tecido nãozymatic é descrita neste protocolo. Durante a síntese de CDNA, além das instruções, o RNA do bacteriófago MS2 é adicionado para fins de estabilização. Níveis de expressão genética, mas não proteínas, foram analisados para detectar alterações precoces na atividade biossintética dos condrócitos articulares. Além de seções histológicas e atividade metabólica, esses ensaios fornecem informações abrangentes sobre os efeitos do carregamento mecânico na cartilagem articular.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada por NÖ Forschungs- und Bildungsges.m.b.H. e o governo provincial da Baixa Áustria através das Chamadas de Ciência da Vida (Project ID: LSC15-019) e pelo Programa Austríaco DE COMETA (Projeto K2 XTribology, Grant No. 849109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | A-2942-100ML | |
| buffered formaldehyde solution 4% | VWR | 97131000 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) | Roche Diagnostics | 11465015001 | XTT-based ex vivo toxicology assay |
| CoCrMo raw material | Acnis International | CoCrMo rods 6mm in diameter | |
| CryoStar NX70 Cryostat | Thermo Fischer Scientific | cryosectioning device | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sidma-Aldrich Chemie | D 2438-10ML | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | medium | |
| fetal bovine serum | Gibco | ||
| Hyaluronic acid | Anika Therapeutics Inc. | component of lubricating solution | |
| iCycler | BioRad | thermal cycler | |
| Leica microscope DM?1000 | Leica | microscope for histology | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Diagnostics | ||
| LightCycler 96 | Roche Diagnostics | thermal cycler for PCR | |
| MagNA Lyser Green Beads | Roche Diagnostics | 3358941001 | |
| Osteochondral Autograft Transfer System (OATS) | Arthrex Inc. | cutting tube for harvesting osteochondral cylinders | |
| osteosoft | Merck | 1017279010 | decalcifier-solution |
| Penicillin /Streptomycin | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ML | |
| phosphate?buffered saline | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | PBS | |
| Prescale Low Pressure | Fujifilm | pressure indicating film | |
| RNeasy Fibrous Tissue Kit | QIAGEN | 74404 | |
| Synergy 2 | BioTek Instruments | plate reader | |
| Tetra?Falex MUST | Falex Tribology | Tribometer | |
| Tissue? Tek O.C.T. | SAKURA | 4583 | embedding formulation |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche Diagnostics | 40897030001 | |
| β-mercaptoethanol | Sidma-Aldrich Chemie | M3148 |
References
- Zengerink, M., Struijs, P. A. A. A., Tol, J. L., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral lesions of the talus: a systematic review. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 18 (2), 238-246 (2009).
- Aurich, M., et al. Behandlung osteochondraler Läsionen des Sprunggelenks: Empfehlungen der Arbeitsgemeinschaft Klinische Geweberegeneration der DGOU. Zeitschrift fur Orthopadie und Unfallchirurgie. 155 (1), 92-99 (2017).
- Van Bergen, C. J. A., Zengerink, M., Blankevoort, L., Van Sterkenburg, M. N., Van Oldenrijk, J., Van Dijk, C. N. Novel metallic implantation technique for osteochondral defects of the medial talar dome. Acta Orthopaedica. 81 (4), 495-502 (2010).
- Sweet, S. J., Takara, T., Ho, L., Tibone, J. E. Primary Partial Humeral Head Resurfacing. The American Journal of Sports Medicine. 43 (3), 579-587 (2015).
- Becher, C., et al. Minimum 5-year results of focal articular prosthetic resurfacing for the treatment of full-thickness articular cartilage defects in the knee. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 131 (8), 1135-1143 (2011).
- Lea, M. A., Barkatali, B., Porter, M. L., Board, T. N. Osteochondral Lesion of the Hip Treated with Partial Femoral Head Resurfacing. Case Report and Six-Year Follow-up. HIP International. 24 (4), 417-420 (2018).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Paessler, H. H., Skrbensky, G. Effects of a contoured articular prosthetic device on tibiofemoral peak contact pressure: a biomechanical study. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 16 (1), 56-63 (2007).
- Malahias, M. -A., Chytas, D., Thorey, F. The clinical outcome of the different HemiCAP and UniCAP knee implants: A systematic and comprehensive review. Orthopedic Reviews. 10 (2), (2018).
- Dhollander, A. A. M., et al. The use of a prosthetic inlay resurfacing as a salvage procedure for a failed cartilage repair. Knee Surgery, Sports Traumatology. 23 (8), 2208-2212 (2014).
- Van Bergen, C. J. A. A., van Eekeren, I. C. M. M., Reilingh, M. L., Sierevelt, I. N., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral defects of the talus with a metal resurfacing inlay implant after failed previous surgery. Bone and Joint Journal. 95 (12), 1650-1655 (2013).
- Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Hwang, K. -T. T., Choi, I. -Y. Y. The cartilage degeneration and joint motion of bipolar hemiarthroplasty. International Orthopaedics. 36 (10), 2015-2020 (2012).
- Moon, K. H., et al. Degeneration of Acetabular Articular Cartilage to Bipolar Hemiarthroplasty. Yonsei Medical Journal. 49 (5), 716-719 (2008).
- Wimmer, M. A., Pacione, C., Laurent, M. P., Chubinskaya, S. In vitro wear testing of living cartilage articulating against alumina. Journal of Orthopaedic Research. , (2016).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Simple geometry tribological study of osteochondral graft implantation in the knee. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 232 (3), 249-256 (2018).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Development of a preclinical natural porcine knee simulation model for the tribological assessment of osteochondral grafts in vitro. Journal of Biomechanics. 77, 91-98 (2018).
- Trevino, R. L., et al. Establishing a live cartilage-on-cartilage interface for tribological testing. Biotribology. 9, 1-11 (2017).
- Oungoulian, S. R., et al. Wear and damage of articular cartilage with friction against orthopedic implant materials. Journal of Biomechanics. 48 (10), 1957-1964 (2015).
- Stotter, C., et al. Effects of Loading Conditions on Articular Cartilage in a Metal-on-Cartilage Pairing. Journal of Orthopaedic Research. 37 (12), 2531-2539 (2019).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Tibesku, C. O., von Skrbensky, G. Tibiofemoral contact mechanics with a femoral resurfacing prosthesis and a non-functional meniscus. Clinical biomechanics. 24 (8), Bristol, Avon. 648-654 (2009).
- Temple, D. K., Cederlund, A. A., Lawless, B. M., Aspden, R. M., Espino, D. M. Viscoelastic properties of human and bovine articular cartilage: a comparison of frequency-dependent trends. BMC Musculoskeletal Disorders. , 1-8 (2016).
- Caligaris, M., Ateshian, G. A. Effects of sustained interstitial fluid pressurization under migrating contact area, and boundary lubrication by synovial fluid, on cartilage friction. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (10), 1220-1227 (2008).
- Burris, D. L., Ramsey, L., Graham, B. T., Price, C., Moore, A. C. How Sliding and Hydrodynamics Contribute to Articular Cartilage Fluid and Lubrication Recovery. Tribology Letters. 67 (2), 1-10 (2019).
- Mamat, N., Nor, M. Numerical measurement of contact pressure in the tibiofemoral joint during gait. International Conference on Biomedical Engineering (ICoBE). , 27-28 (2012).
- Manda, K., Ryd, L., Eriksson, A. Finite element simulations of a focal knee resurfacing implant applied to localized cartilage defects in a sheep model. Journal of Biomechanics. 44 (5), 794-801 (2011).
