Summary
פרוטוקול זה מתאר את ההכנה, בדיקות ביוטריבולוגיות, וניתוח של צילינדרים אוסטאוכונדרליים הזזה נגד חומר שתל מתכת. אמצעי התוצאה הכלולים בפרוטוקול זה הם פעילות מטבולית, ביטוי גנים והישטולוגיה.
Abstract
פגמים אוסטאוכונדריים בחולים בגיל העמידה עשויים להיות מטופלים עם שתלים מתכתיים מוקד. פותח לראשונה עבור פגמים במפרק הברך, שתלים זמינים כעת עבור הכתף, הירך, הקרסול ואת מפרק כף הרגל הראשון. בעוד מתן הפחתת כאב ושיפור קליני, שינויים ניווניות מתקדמים של הסחוס היריב נצפו בחולים רבים. המנגנונים המובילים לנזק זה אינם מובנים במלואם. פרוטוקול זה מתאר ניסוי טריבולוגי כדי לדמות זיווג מתכת על סחוס וניתוח מקיף של סחוס מתוך המוח. חומר שתל מתכת נבדק נגד צילינדרים אוסטאוכונדרליים של בקר ים ותודל לסחוס מפרקים אנושי. על ידי החלת עומסים שונים ומהירויות הזזה שונות, ניתן לחקות תנאי טעינה פיזיולוגיים. כדי לספק ניתוח מקיף של ההשפעות על סחוס מבעת המוח, הישטולוגיה, פעילות מטבולית וניתוח ביטוי גנים מתוארים בפרוטוקול זה. היתרון העיקרי של בדיקות טריבולוגיות הוא כי פרמטרים טעינה ניתן להתאים בחופשיות כדי לדמות בתנאי vivo. יתר על כן, פתרונות בדיקה שונים עשויים לשמש כדי לחקור את ההשפעה של שימון או סוכנים פרו דלקתיים. באמצעות ניתוח ביטוי גנים עבור גנים ספציפיים סחוס וגנים קטבוליים, שינויים מוקדמים בחילוף החומרים של כולתוציטים מבעבעים בתגובה לטעינה מכנית עשויים להתגלות.
Introduction
הטיפול בפגמים אוסטאוכונדרליים הוא תובעני ודורש ניתוח במקרים רבים. עבור נגעים osteochondral מוקד בחולים בגיל העמידה, שתלים מתכתיים מוקד הם אופציה בת קיימא, במיוחד לאחר כישלון של טיפול ראשוני, כמו גירוי מח עצם (BMS) או השתלת chondrocyte אוטולוגי (ACI)1. החלפת משטח חלקית יכולה להיחשב הליכי הצלה שיכולים להפחית את הכאב ולשפר את טווח התנועה2. שתלים אלה מורכבים בדרך כלל מסגסוגת CoCrMo והם זמינים בגדלים שונים ותצורות היסט כדי להתאים את האנטומיה הרגילה3. בעוד שפותחה בתחילה עבור פגמים על condyle הירך המדלה בברך, שתלים כאלה זמינים כעת בשימוש עבור הירך, הקרסול, הכתף, ואתהמרפק 4,5,6. לתוצאה משביעת רצון, חיוני להעריך את היישור המפרק המכני ואת מצב הסחוס הנגדי. יתר על כן, השתלה נכונה ללא בהלת השתל הוכח להיות בסיסי7.
מחקרים קליניים הראו תוצאות מצוינות לטווח קצר במונחים של הפחתת כאב ושיפור התפקוד בחולים בגיל העמידה במקומותשונים 5,6,8. בהשוואה להשתלת אלוגרפט, שתלי מתכת מוקד מאפשרים מיסב משקל מוקדם. עם זאת, הסחוס המנוגד לדלקת פרקים הראה בלאי מואץ במספר ניכר שלחולים 9,10. לפיכך, גם עם מיקום נכון, במקרים רבים ניוון של הסחוס היליד נראה בלתי נמנע, בעוד המנגנונים הבסיסיים נשארים לא ברורים. שינויים ניווניים דומים נצפו לאחר hemiarthroplasty דו קוטבי שלהירך 11 וגדלו עם פעילותוטעינה 12.
ניסויים טריבולוגיים מספקים את האפשרות ללמוד זיווגים כאלה במבחנה ולמדמה מצבי טעינה שונים המתרחשים בתנאים פיזיולוגיים13. השימוש סיכות אוסטאוכונדרלי מציע מודל גיאומטריה פשוט לחקור את הטריבולוגיה של סחוס מפרקים הזזה נגד סחוס מקורי או כל חומרשתל 14, עשוי לשמש עוד במודלים סימולציה משותפתשלמה 15. זיווגים מתכת על סחוס להראות בלאי סחוס מואץ, שיבוש מטריצה חוץ תאית, וכדאיות תאים מופחתת באזור שטחי לעומת סחוס על סחוסזיווג 16. נזק לסחוס נגרם בעיקר בצורת התבססות בין האזורים שטחיים ואמצעיים17. עם זאת, המנגנונים המובילים ניוון סחוס אינם מובנים במלואם. פרוטוקול זה מספק ניתוח מקיף של הפעילות הביוסינתטית של סחוס מבעית. על ידי קביעת פעילות מטבולית ורמות ביטוי גנים של גנים קטבוליים, אינדיקציות מוקדמות להתמוטטות סחוס עשוי להיות מזוהה. היתרון של ניסויים במבחנה tribological הוא כי פרמטרים טעינה ניתן להתאים לחקות תנאי טעינה שונים.
לפיכך, הפרוטוקול הבא מתאים לדמות זיווג מתכת על סחוס, המייצג מודל hemiarthroplasty ניסיוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת צילינדרים מתכתיים
- נתח מוטות קובלט-כרום-מוליבדן גלילי (CoCrMo) הממלאים את המפרטים הסטנדרטיים עבור שתלים כירורגיים עבור ההרכב הכימי שלהם באמצעות סריקת מיקרוסקופאלקטרונים (SEM) עם ספקטרוסקופיית רנטגן פיזור אנרגיה לכל פרוטוקול היצרן כדי לאשר ערכים שסופקו.
הערה: ההרכב היסודי של סגסוגת CoCrMo המשמש לניסוי זה הוא 65% Co, 28% Cr, 5% Mo ו- 2% אחרים. - לטחון את הדגימות עם נייר שחיקה קרביד סיליקון החל מגודל תבואה של 500. השתמש בנייר שחיקה בסדר הגדלת עד לגודל תבואה של 4000.
- ללטש את הצילינדר עם 3 μm ו 1 μm להדביק כדי להשיג חספוס פני השטח כי הוא בתוך רמת העמידות של דרישות גימור פני השטח עבור שתלים כירורגיים מתכתיים (ISO 5832-12:2019) ושתלים תחליף מפרקים הכולל וחלקי (ISO 21534:2007).
הערה: חספוס פני השטח הממוצע נקבע באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי. - חותכים מוטות CoCrMo (Ø של 6 מ"מ) לצילינדרים באורך של 10 מ"מ.
2. קצירת צילינדרים אוסטאוכונדרליים
- השתמשו במפרקי חנוקים מבעלי חיים בוגרים (בגילאי 18-24 חודשים בזמן ההקרבה) ולשמור אותם כלולים ומצננים עד הניתוק בתוך 24 שעות לאחר ההקרבה.
הערה: המפרקים נרכשים מהקצב המקומי. המקום נשאר סגור עד הפירוק. - כדי לקצור תקעים אוסטאוכונדריים גליליים בתנאים אפטיים, לחטא את הברך ולבצע ארתום ולחשוף את condyle הירך המדיאלי.
הערה: יש לבצע את הניתוק בזהירות כדי לא לפגוע במשטח המפרק. - בדוק אם יש נזקים מאקרוסקופיים במשטח המפתק.
הערה: בטל את הדגימה אם הסחוס חסר מראה לבנבי, חלק ומבריק או אם יש שלפוחיות, סדקים או פגמים גדולים יותר. - יישר את צינור החיתוך בניצב אל פני השטח המופרת של אזור נושא המשקל והסיע את המכשיר לתוך הסחוס והעצם התת-כלנדרית על ידי משיכות חזקות עם פטיש. בעומק חדירה של 15 מ"מ, סובבו את המכשיר בכיוון השעון בתנועה פתאומית.
- הסר את ההתקן, הכנס את הידית הלבנה ותדפוק אותו עד שהקצה התחתון של תקע האוסטיאו-כולנדרל יהיה גלוי.
- סמן את הכיוון הקדמי של הדגימות עם סמן סטרילי על מנת לסדר את הצילינדר אוסטאוכונדרל בהתאם במהלך הבדיקה.
הערה: רשת הקולגן התלת מימדית והארכיטקטורה המורכבת שלה מקלות על המאפיינים המכניים הייחודיים של סחוס מופרות ויש לקחת בחשבון בכיוון הדגימות. - לשטוף את הדגימה עם תמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) כדי לשטוף את הדם ואת רקמת שומן.
- חזור על השלבים שהוזכרו לעיל כדי לקצור את המספר הרצוי של תקעים אוסטאוכונדרליים (קוטר 8 מ"מ, 15 מ"מ).
הערה: בדרך כלל, 9 עד 12 צילינדרים אוסטאוכונדרליים ניתן לקצור מהאזור נושא משקל על condyle הירך מדיאלי. - מניחים את הדגימות במדיום של הנשר המותאם של דולבקו המכיל 10% סרום עוף עוברי, בתוספת אנטיביוטיקה (פניצילין 200 U/mL; סטרפטומיצין 0.2 מ"ג/מ"ל) ואמפוטריסין B 2.5 μg/mL ולאחסן אותם ב 4 ° C עד בדיקה כדי לשמור על הכדאיות.
- נתח תקעים אוסטאוכונדרליים של בקרה מיד לאחר הקציר כדי ליצור ערכי בסיס (ראה סעיף ניתוח).
3. בדיקות טלבולוגיות
- בצע את הניסויים באמצעות טריבומטר הדדי זמין מסחרית עם תצורת גליל על לוח. הדרישות עבור ההתקן הן טעינה אנכית ומהירות טעינה וגלישה מתכווננת. יתר על כן, תא נוזלי מאפשר לבצע את הבדיקות בתמיסת סיכוך.
- לקבוע את לחץ המגע במערכת CoCrMo-on-סחוס באמצעות סרט מדידת לחץ. מקם את סרט מדידת הלחץ בממשק ולהחיל עומס סטטי עבור 30 s כדי לקבוע לחץ מגע ראשוני, גודל וצורה של מגע. בשל הקיטוב של צילינדר המתכת וסחוס המיתק, לאזור המגע הראשוני יש צורה אליפטית בתצורה זו.
הערה: סרט מדידת הלחץ מגיב ללחץ המיושם המציג שינוי צבע אדום של אזורים שבהם מגיעים ללחץ הסף או חריגה מהם. עבור 1 N של עומס, לחץ הקשר נקבע סביב 2 MPa על ידי השוואה חזותית עם לחצים מגע מוגדרים. - תקן את הצילינדרים האוסטיאוכונדרליים במחזיק המדגם התחתון עם הסימון המיושר לכיוון ההזזה, והתקן את צילינדרים CoCrMo על תא העומס העליון.
- הוסף את פתרון הבדיקה (PBS עם 3 g/L חומצה היאלורונית) לתוך התא הנוזלי שתוצאות שקועות הצילינדר אוסטאוכונדרל וכיסוי ממשק הזזה מתכת-סחוס.
- הגדר את פרמטרי הבדיקה (שנקבעו כוח נורמלי, שבץ ומהירות הזזה), אשר לאחר מכן מוחלים ומתוחזקים לאורך כל הבדיקה.
הערה: יש להגדיר את אורך הקו של התנועה ההדדית בהתאם לאזור איש הקשר כדי ליצור אזור מגע נודד (MCA). עבור תקעים בקוטר 8 מ"מ, שבץ של 2 מ"מ מאפשר התייבשות נאותה של הסחוס. - התחל בהחלקה הדדית של צילינדר CoCrMo כנגד הסחוס המאופק השקוע בתמיסת הסיכה עם פרמטרי הטעינה של הסט.
- לפקח על מקדם החיכוך (COF) במהלך הניסויים.
הערה: ה-COF מוערך באופן אוטומטי אך ניתן לחשב אותו באמצעות המשוואה μ=F/W (μ - מקדם חיכוך; F - כוח חיכוך; W - עומס רגיל שהוחל על-ידי המערכת). - סיים את הניסוי לאחר תקופת הבדיקה הרצויה.
- הסר את תקע אוסטאוכונדרל ממחזיק המדגם, שטוף אותו ב-PBS ואחסן אותו במדיום עד לניתוח ביולוגי נוסף (ראה להלן).
- לשקוע דגימות בקרה בפתרון הבדיקה בטמפרטורת החדר למשך הבדיקה ולנתח יחד עם דגימות שנחשפו לטעינה מכנית.
4. ניתוח
הערה: צילינדר אוסטאוכונדרלי מנותחים עבור פעילות מטבולית וביטוי גנים כדי לחקור פעילות ביולוגית; ההיסטלולוגיה מתבצעת כדי ללמוד את שלמות פני השטח של הסחוס ואת המטריצה הבסיסית.
- היסטולוגיה
- לניתוח היסטולוגי, לטבול את תקעי osteochondral 4% פורמלדהיד אגירה פתרון בטמפרטורת החדר עד עיבוד נוסף.
- לשטוף את הדגימות עם PBS ולמקם אותם לתוך כלי פלסטיק.
- הוסף עודף של פתרון הממתן המוכן לשימוש כך שכל הדגימות יחוסו.
- החל תסיסה מתמדת במשך 4 שבועות למתן מלא.
- לאחר ההטעיה, הטביעו את הדגימות בקליקולים מסיסים במים ואסנו אותן ב-80°C.
- להשיג 6 מקטעים μm על ידי cryosectionsal לאזור הקשר.
- לאחר מכן, להכין את הדגימות עבור Sfranin O כתמים ו- Fastgreen counterstaining באמצעות פרוטוקול של היצרן.
- ללכוד תמונות היסטולוגיות באמצעות מיקרוסקופ ותהליך באמצעות תוכנת עיבוד הדמיה.
- פעילות מטבולית
הערה: הפעילות חילוף החומרים של כולדרוציטים בסחוס מופרת נחקרים עם XTT מבוססי אקס vivo טוקסיקולוגיה תסיסה.- יש לשטוף את תקע האוסטיאו-כונדרלי באמצעות PBS ולהניחת הדגימה בצלחת פטרי.
- מניחים צלחת של 24 באר בסולם ואפס את קנה המידה.
- חותכים את הסחוס מהשתל האוסטיאוכונדרלי עם אזמל בחתיכה אחת.
- לחלק את הסחוס בשתי חתיכות שוות כך אזור המגע מחולק באופן שווה על שני חתיכות סחוס ולקטן חצי אחד כדי 1 מ"מ חתיכות. המחצית השנייה משמשת לניתוח ביטוי גנים.
- מעבירים את הסחוס הטחוב לבאר אחת של הצלחת המוכנה 24 באר ולקבוע את משקל הרקמה.
- חזור על השלבים שהוזכרו לעיל עבור כל מדגם ולהוסיף 1 מ"ל של גדילה בינונית לכל באר של הצלחת.
- הוסף את פתרון XTT (490 μL של XTT תיוג רייגנט ו 10 μL של reagent ההפעלה) על פי ההוראה של היצרן לערבב.
- דגירה את הצלחת ב 37 ° C ו 5% CO2 עבור 4 שעות.
- לאחר הדגירה, הסר את הסופרנטנט והעבר אותו לצינור של 5 מ"ל.
- לחלץ את המוצר tetrazolium על ידי הוספת 0.5 מ"ל של dimethyl sulfoxide (DMSO) לרקמת הסחוס בצלחת 24-well ולהחיל תסיסה רציפה במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
- הסר את פתרון DMSO ואספו אותו בפתרון XTT שנאסף בעבר.
- להעביר 100 μL של המדגם בשלושה רישיות בצלחת 96-באר על קורא צלחת למדוד את הספיגה באורך גל של 492 000 000 00:00 ואורך גל התייחסות ב 690 000 00:00.
- נרמל את ערכי הספיגה המתווברים למשקל הרטוב של כל מדגם ובצע ניתוח באמצעות תוכנה.
- ניתוח ביטוי גנים
- בידוד RNA
הערה: בידוד RNA מתבצע באמצעות ערכה מסחרית (טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן עם תיקונים קטנים.- תקציצו את החצי השני של רקמת הסחוס שהושגה מהתקע האוסטיאו-כונדרלי לחתיכות קטנות.
- להעביר אותם לצינור המכיל חרוזי קרמיקה ו 300 μL של מאגר Lysis (המכיל 1% β-mercaptoethanol).
הערה: הדגימות ניתן להקפיא חנקן נוזלי עד עיבוד נוסף. - מפשירים את הדגימות למשך 2 דקות והשתמשו ב-lyser המסחרי להומוגניזציה של הרקמה. למרוח 6,500 סל"ד על 20 שניות (שלב הומוגניזציה) ארבע פעמים עם שלב קירור של 2 דקות אחרי כל ריצה (ב-4°C באמצעות מכשיר הקירור המסחרי) כדי לשבש את הרקמה במלואה.
- להוסיף 20 μL של חלבון K ו 580 μL של מים ללא RNase לכל צינור דגירה אותם ב 55 ° C במשך 30 דקות.
- צנטריפוגה הדגימות במשך 3 דקות ב 10,000 x g ולהעביר את supernatant לצינור 1.5 מ"ל.
- להוסיף 0.5 כרכים של 90% אתנול לכל שפופרת ולערבב.
- להעביר 700 μL של המדגם לעמודת איגוד RNA ממוקם בצינור אוסף 2 מ"ל צנטריפוגה ב 8,000 x g עבור 15 s.
- השליכו את הזרימה וחזרו על שלב הצנטריפוגציה לליסוף מלא.
- הוסף 350 μL של מאגר RW1 לעמודה, צנטריפוגה ב 8,000 x g עבור 15 s, ולבטל את הזרימה-דרך.
- לערבב 10 μL של פתרון מניות DNase ו 70 μL של מאגר RDD. מוסיפים את הפתרון לממברנה לטיהור ה-RNA ומגרדים אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- הוסף 350 μL של מאגר RW1 לעמודה וצנטריפוגה ב 8,000 x g עבור 15 s. תמחק את הזרימה.
- הוסף 500 μL של מאגר RPE וצנטריפוגה ב 8,000 x g עבור 15 s. תמחק את הזרימה.
- הוסף 500 μL של מאגר RPE לעמודת טיהור RNA וצנטריפוגה ב 8,000 x g במשך 2 דקות.
- מניחים את העמודה בצינור אוסף של 1.5 מ"ל ומוסיפים 30 μL של מים ללא RNase. צנטריפוגה ב 8,000 x g עבור 1 דקות.
- אחסן את ה-RNA המבודד ב-80°C עד לסינתזה של CDNA.
- סינתזה של cDNA
הערה: כדי לסנתז DNA משלים (cDNA) מסנג'ר RNA (mRNA) ערכה מסחרית (טבלת חומרים) שימש. RNA מ ms2 bacteriophage נוספה לייצב RNA מבודד במהלך סינתזה cDNA.- להפשיר ולערבב את הריגנטים. הקומפוזיציה עבור תגובה אחת מוצגת בטבלה 1.
- להוסיף 16 μL של מדגם RNA לנפח לתגובה אחת (14 μL).
- בצע סינתזה cDNA במחזור תרמי באמצעות הפרמטרים הבאים: 10 דקות ב 25 °C (פרימר annealing), 60 דקות ב 50 °C (סינתזת DNA), 5 דקות ב 85 °C (denaturation) ו 5 דקות ב 20 ° C (שלב קירור).
- אחסן cDNA ב- -20 °C עד לתגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (RT-qPCR).
- RT-qPCR
הערה: עבור RT-qPCR של דגימות של צב, פריימרים ובדיקות תוכננו באמצעות תוכנת qPCR מסחרית בזמן אמת (לדוגמה, IDT) עבור הגנים GAPDH (גליסרלדהיד 3-פוספט דהירוגנאז), COL2A1 (קולגן סוג 2), ACAN (אגרקן), COL1A1 (קולגן סוג 1), MMP-1 (מטריקס מטאלופרוטינז-1) ו-MMP-13 (מטריקס מטאלופרוטינס-13). פריימרים של בקרים וגששים מרווים כפולים סופקו על ידי IDT. הריאגנטים המשמשים לתגובה אחת כדי להעריך את היעילות וביטוי הגן מוצגים בטבלה 2.- לוותר על התערובת הראשית של תגובה אחת (9 μL) לכל באר של צלחת PCR 96-באר ולהוסיף 1 μL של cDNA לכל תגובה. בצע בדיקות עבור כל דגימה בטרישתיות.
- סגור את לוח ה-PCR באמצעות שמן איטום וצנטריפוגה ב-877 x g למשך 10 דקות ב-4°C.
- בצע RT-qPCR באמצעות רוכב תרמי מדויק עם הפרוטוקול הבא: 95 °C למשך 10 דקות, 45 מחזורי ההגדלה (95°C ל- 10 שניות, חיור עבור 30 שניות, סינתזה cDNA) ו- 37 °C עבור 30 שניות.
הערה: נדרשות טמפרטורות בודדות עבור כל פריימר. - השתמש GAPDH יחד עם הגנים היעד כדי לאשר יעילות.
- השתמש בתוכנה שסופקה כדי לחשב את היעילות של כל גן.
- נרמל את ערכי סף המחזור (CT) לביטוי של גן ההפניה GAPDH והשתמש בשיטת Ơ ƠCT לכמת.
- בידוד RNA
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
יש לאשר את אזור המגע ולחץ המגע באמצעות סרט מדידת לחץ(איור 1). ניתן לאשר מצב טעינה פיזיולוגי על-ידי השוואה עם הטבעות ייחוס ללחצי מגע מוגדרים. במהלך הבדיקה, מקדם החיכוך מנוטר כל הזמן. עם אזור מגע נודד, ניתן לשמור על מקדם חיכוך נמוך למשך שעה אחת לפחות(איור 2). באמצעות Safranin O הכתמת הרכב ומבנה מטריצה extracellular ניתן לקבוע(איור 3). עוצמת הכתמים של Safranin O היא פרופורציונלית לתוכן proteoglycan. Fast Green מנטרל את האתרים שאינם קולגן ומספק ניגוד ברור לכתמים של Safranin O. התוכן proteoglycan משתנה על פני פני השטח המופרקים אבל צריך להיות אחיד בכל סעיף הרקמה בדגימות בסיסיות (איור 3A). דגימות בקרה שקועות בפתרון הבדיקה להראות חילוץ של GAGs, אשר ניתן לנטרל על ידי טעינה מכנית(איור 3B, 3C). פעילות מטבולית של כולנדרוציטים מפרק שור אינה תלויה באתר הקציר, אבל מראה עלייה עם טעינה מכנית לעומת פקדים לא טעון (איור 4). רמות ביטוי הגן של גנים ספציפיים סחוס (COL2A1, ACAN) להגדיל עם תנאי טעינה פיזיולוגיים, בעוד גנים קטבוליים (COL1A1 ו MMP13) הם upregulated עם אזור מגע נייח(איור 5).
| מחזור ע.נ (μl) | |
| תעתיק או RT תגובות מאגר 5x conc. | 6 |
| מעכב RNase מגן 40U/μl | 0.75 |
| תערובת Deoxynucleotide 10 מ'- כל אחד | 3 |
| פריימר הקסאמר אקראי 600 μM | 3 |
| תעתיק או תמלול הפוך 20 U/μl | 0.75 |
| MS2 RNA (0,8 μg/μl) | 0.375 |
| מים מזוקקים ללא גרעין | 0.125 |
| נפח כולל | 14 |
טבלה 1: ריאגנטים לתגובה אחת לסינתזה של CDNA.
| מחזור ע.נ (μl) | |
| התחלה מהירה של בדיקה מאסטר 2X | 5 |
| גשושית הידרוליזה 2,5 μM | 1 |
| פריימרGAPDH שמאלי 5 μM | |
| פריימר ימין GAPDH 5 μM | |
| מים מזוקקים ללא גרעין | 3 |
| סה"כ מיקס ראשי | 9 |
טבלה 2: רייגנטים עבור המיקס הראשי עבור PCR יחיד.
איור 1: מדידתPressure של אזור המגע הראשוני בממשק סחוס המתכת לפני הבדיקה. בשל קתומת גליל המתכת ומשטח המיתק והמאפיינים האלסטיים שלו, אזור המגע הראשוני הוא אליפטי. במהלך הגלישה, אזור מגע ראשוני זה נע במשיכת 2 מ"מ, וכתוצאה מכך שטח גדול יותר החשוף לטעינה מכנית; סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: מקדם חיכוך תלוי בזמן (משך 1 שעה) עבור שבע דגימות שנבדקו במהירות הזזה של 8 מ"מ/השנייה ועומס של 1 N (לחץ מגע של 2 MPa). כל קו צבעוני מייצג את ה-COF של צילינדר אוסטאוכונדרלי אחד. השונות שנצפתה היא בגבולות של דגימות ביולוגיות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: חתךים היסטולוגיים של דגימות אוסטאוכונדרליות של בשרים מוכתמים ב-Safranin-O ובירוק מהיר. (א)דוגמאות בסיסיות מציגות תוכן GAG גבוה לאורך כל הסחוס המופרת. (ב)מדגם בקרה שקוע בתמיסת בדיקה ללא טעינה מכנית להראות פחות Safranin-O כתמים באזור האמצעי, אינדיקציה חילוץ של פרוטאוגליקנים. (ג)דגימות שנבדקו מראות תוכן GAG גבוה יותר בהשוואה לפקדים, המעידים על גירוי מכני; סרגל קנה מידה = 250 μm אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: פעילות מטבולית של כולת מטלות מברקים של בקר לאחר בדיקות טריבולוגיות עם וריאציות טעינה ופקדים שונים. הקו המקוקד האופקי מייצג רמות בסיסיות. בדיקת Kruskal-Wallis הלא-פרמטרית בוצעה להשוואה בין קבוצות בדיקה ולאחריה בדיקת הפוסט הוק של דאן במקרה של משמעות. *p < 0.05. נתון זה שונה מ- Stotter ואח '18. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: ביטוי גנים של גנים ספציפיים לסחוס לאחר בדיקות טריבולוגיות עם תנאי טעינה ובקרות שונים. COL2A1=קולגן סוג 2; ACAN = אגרקן; COL1A1= קולגן סוג 1; MMP13= מטריקס מטאלופרוטינאז 13. רמות הביטוי היו מנורמלים לגן משק הבית GAPDH (גליצרלדהיד 3-פוספט דהידג'נאז). הקווים המנוקדים האופקיים מייצגים רמות ביטוי בסיסי. בדיקת Kruskal-Wallis הלא-פרמטרית בוצעה להשוואה בין קבוצות בדיקה ולאחריה בדיקת הפוסט הוק של דאן במקרה של משמעות. *p < 0.05. נתון זה שונה מ- Stotter ואח '18. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שתלים מתכתיים מוקד מייצגים הליך הצלה עבור פגמים osteochondral, במיוחד בחולים בגיל העמידה ולאחר טיפול ראשוני נכשל. למרות מחקרים קליניים הראו תוצאות מבטיחות לטווח קצר, סיבוך שנצפה אחד הוא נזק לסחוס היריב, יליד10. מחקרים ביומכניים וגווייה מראים ראיות ברורות לכך שהשתלה נכונה עם מיקום שטוח או שקוע מעט שומרת על לחצים מגעטבעיים 19. ניסויים טריבולוגיים מספקים אפשרות לבחון זיווגים סחוס שונים במבחנה. בתנאי טעינה, שימון, זיווגים חומריים ומשך זמן עשויים להיות מותאמים כרצונך.
סחוס בקר זמין בכמות גבוהה בבית המטבחיים המקומי. התאיות והמבנה הזוני דומים מאוד לקונדילס הירך האנושי20. עם זאת, תוכן proteoglycan הוא ספציפי לאתר, ואילו רמות ביטוי גנים הוצגו להיות אחיד על פני השטח המפרקים. בפרוטוקול זה, תקעים אוסטאוכונדרליים נקטפו מהאזור הנושא את המשקל. עובי הסחוס, ארכיטקטורת הקולגן והמאפיינים התלת-תכליתיים המתוברים מראים הבדלים אזוריים על פני השטח שלהמיתב 16. המגבלה של שימוש בתקעים osteochondral בהגדרת טעינה ללא מגבלות עם רשת קולגן משובשת ולחץ נוזלים שונה לעומת דגמים משותפים שלמים צריך להיחשב.
ברוב המחקרים הטריבולוגיים, PBS לבד משמש כפתרון בדיקה כדי ליצור נתונים חזקים יותר. PBS הוא פתרון חיץ עם osmolarity איזוטוני ומסייע לשמור על pH קבוע במהלך ניסויים ביולוגיים. שימוש PBS עם חומצה היאלורונית מספק סיכה גבול חיכוך מופחת21. בהתאם לכך, נוזל synovial מפחית את מקדם החיכוך ומשפר את לחץ הנוזלים בהשוואה לתמיסת מלח22. מקדם החיכוך תלוי במאפייני מערכת שונים, שהוצגו על ידי עקומת Stribeck הקלאסית. עקומת Stribeck מתייחסת מקדם חיכוך צמיגות, מהירות ועומס ומציג את משטרי הסיכה הבסיסיים: גבול, מעורב, סיכה הידרודינמית. סיכוך גבול ניתן להשיג עם PBS לבד כמו נוזל סיכה, אבל פרמטרים טעינה היה צריך להיות מותאם בהתאם. ה-COF שנמסר מהבדיקות הוא ערכים ממוצעים לאורך הקו. לכן, ניתן להניח כי תנאי סיכוך שונים להתרחש במהלך המחזור. במהלך קיפאון בעמדת היפוך, תנאי הגבול עשויים להיות מנצחים, בעוד סיכוך מעורב עשוי להיות דומיננטי במהלך הזזה. בהתבסס על משך מוחלט במהלך מחזור ההזזה, האחרון היה השפעה רבה יותר על ערך COF ממוצע.
כדי לחקור את התנאים הפיזיולוגיים המתרחשים במפרקים במהלך פעילויות יומיומיות, ניתן להתאים את תנאי הטעינה בהתאם בתוכנה tribometer. יש להשתמש במדידות רגישות ללחץ כדי לאשר את הלחצים הרצויים במגע. דיווחים על לחצים במגע ירך לנוע בין 1 MPa במהלך עמידה ועד 10 MPa במהלך ריצה במורדהגבעה 23. עם התחדשות מוקד, לחצי שתל הם רק מעט גבוה בהשוואה מפרקים בריאים24. דיווחים על מהוות הזזה יחסית במהלך מחזור ההליכה מדווחים על עד 100 מ"מ/ת עם וריאציות גבוהות בשלבים השונים. משמעות הדבר היא כי תנועות משותפות יחסית חורגות מהמהירות שניתן להחיל בהתקנה זו tribological. כדי לחקות תנאים קינמטיים טבעיים ולחצי מגע במפרקי ברך בריאים, תנאי הטעינה נעים בין 1 ל-10 לחץ מגע MPa ומהירות הזזה של 5 עד 100 מ"מ/השנייה. עם זאת, בעוד עומסים גבוהים ניתן להחיל בהתקנה ניסיונית זו, טווח של מהובל הזזה מוגבל. תנאי טעינה פתולוגיים, הן עומס יתר והן עומסים לקויים, עשויים להיות גם מדומים. מהוזלות הזזה נמוכות או טעינה סטטית משווים את ההתדבקות, בעוד עומסים גבוהים יותר מייצגים גירוי מכני לא פיזיולוגי.
כמו עיכול אנזימטי יכול להשפיע על הביטוי של גנים ספציפיים סחוס, הומוגניזציה רקמות לאnzymatic מתואר בפרוטוקול זה. במהלך סינתזת cDNA, בנוסף להוראות, RNA מחיידק MS2 מתווסף למטרות ייצוב. רמות ביטוי גנים, אבל לא חלבונים, נותחו כדי לזהות שינויים מוקדמים בפעילות הביוסינתטית של כולתוציטים מבעבעים. בנוסף לסעיפים היסטולוגיים ופעילות מטבולית, בדיקות אלה מספקות מידע מקיף על ההשפעות של טעינה מכנית על סחוס פרות המוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי NÖ Forschungs- ו Bildungsges.m.b.H. והממשלה המחוזית של אוסטריה התחתונה באמצעות שיחות מדעי החיים (מזהה פרויקט: LSC15-019) ועל ידי תוכנית שביט האוסטרית (פרויקט K2 XTribology, גרנט מס' 849109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | A-2942-100ML | |
| buffered formaldehyde solution 4% | VWR | 97131000 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) | Roche Diagnostics | 11465015001 | XTT-based ex vivo toxicology assay |
| CoCrMo raw material | Acnis International | CoCrMo rods 6mm in diameter | |
| CryoStar NX70 Cryostat | Thermo Fischer Scientific | cryosectioning device | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sidma-Aldrich Chemie | D 2438-10ML | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | medium | |
| fetal bovine serum | Gibco | ||
| Hyaluronic acid | Anika Therapeutics Inc. | component of lubricating solution | |
| iCycler | BioRad | thermal cycler | |
| Leica microscope DM?1000 | Leica | microscope for histology | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Diagnostics | ||
| LightCycler 96 | Roche Diagnostics | thermal cycler for PCR | |
| MagNA Lyser Green Beads | Roche Diagnostics | 3358941001 | |
| Osteochondral Autograft Transfer System (OATS) | Arthrex Inc. | cutting tube for harvesting osteochondral cylinders | |
| osteosoft | Merck | 1017279010 | decalcifier-solution |
| Penicillin /Streptomycin | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ML | |
| phosphate?buffered saline | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | PBS | |
| Prescale Low Pressure | Fujifilm | pressure indicating film | |
| RNeasy Fibrous Tissue Kit | QIAGEN | 74404 | |
| Synergy 2 | BioTek Instruments | plate reader | |
| Tetra?Falex MUST | Falex Tribology | Tribometer | |
| Tissue? Tek O.C.T. | SAKURA | 4583 | embedding formulation |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche Diagnostics | 40897030001 | |
| β-mercaptoethanol | Sidma-Aldrich Chemie | M3148 |
References
- Zengerink, M., Struijs, P. A. A. A., Tol, J. L., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral lesions of the talus: a systematic review. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 18 (2), 238-246 (2009).
- Aurich, M., et al. Behandlung osteochondraler Läsionen des Sprunggelenks: Empfehlungen der Arbeitsgemeinschaft Klinische Geweberegeneration der DGOU. Zeitschrift fur Orthopadie und Unfallchirurgie. 155 (1), 92-99 (2017).
- Van Bergen, C. J. A., Zengerink, M., Blankevoort, L., Van Sterkenburg, M. N., Van Oldenrijk, J., Van Dijk, C. N. Novel metallic implantation technique for osteochondral defects of the medial talar dome. Acta Orthopaedica. 81 (4), 495-502 (2010).
- Sweet, S. J., Takara, T., Ho, L., Tibone, J. E. Primary Partial Humeral Head Resurfacing. The American Journal of Sports Medicine. 43 (3), 579-587 (2015).
- Becher, C., et al. Minimum 5-year results of focal articular prosthetic resurfacing for the treatment of full-thickness articular cartilage defects in the knee. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 131 (8), 1135-1143 (2011).
- Lea, M. A., Barkatali, B., Porter, M. L., Board, T. N. Osteochondral Lesion of the Hip Treated with Partial Femoral Head Resurfacing. Case Report and Six-Year Follow-up. HIP International. 24 (4), 417-420 (2018).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Paessler, H. H., Skrbensky, G. Effects of a contoured articular prosthetic device on tibiofemoral peak contact pressure: a biomechanical study. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 16 (1), 56-63 (2007).
- Malahias, M. -A., Chytas, D., Thorey, F. The clinical outcome of the different HemiCAP and UniCAP knee implants: A systematic and comprehensive review. Orthopedic Reviews. 10 (2), (2018).
- Dhollander, A. A. M., et al. The use of a prosthetic inlay resurfacing as a salvage procedure for a failed cartilage repair. Knee Surgery, Sports Traumatology. 23 (8), 2208-2212 (2014).
- Van Bergen, C. J. A. A., van Eekeren, I. C. M. M., Reilingh, M. L., Sierevelt, I. N., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral defects of the talus with a metal resurfacing inlay implant after failed previous surgery. Bone and Joint Journal. 95 (12), 1650-1655 (2013).
- Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Hwang, K. -T. T., Choi, I. -Y. Y. The cartilage degeneration and joint motion of bipolar hemiarthroplasty. International Orthopaedics. 36 (10), 2015-2020 (2012).
- Moon, K. H., et al. Degeneration of Acetabular Articular Cartilage to Bipolar Hemiarthroplasty. Yonsei Medical Journal. 49 (5), 716-719 (2008).
- Wimmer, M. A., Pacione, C., Laurent, M. P., Chubinskaya, S. In vitro wear testing of living cartilage articulating against alumina. Journal of Orthopaedic Research. , (2016).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Simple geometry tribological study of osteochondral graft implantation in the knee. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 232 (3), 249-256 (2018).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Development of a preclinical natural porcine knee simulation model for the tribological assessment of osteochondral grafts in vitro. Journal of Biomechanics. 77, 91-98 (2018).
- Trevino, R. L., et al. Establishing a live cartilage-on-cartilage interface for tribological testing. Biotribology. 9, 1-11 (2017).
- Oungoulian, S. R., et al. Wear and damage of articular cartilage with friction against orthopedic implant materials. Journal of Biomechanics. 48 (10), 1957-1964 (2015).
- Stotter, C., et al. Effects of Loading Conditions on Articular Cartilage in a Metal-on-Cartilage Pairing. Journal of Orthopaedic Research. 37 (12), 2531-2539 (2019).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Tibesku, C. O., von Skrbensky, G. Tibiofemoral contact mechanics with a femoral resurfacing prosthesis and a non-functional meniscus. Clinical biomechanics. 24 (8), Bristol, Avon. 648-654 (2009).
- Temple, D. K., Cederlund, A. A., Lawless, B. M., Aspden, R. M., Espino, D. M. Viscoelastic properties of human and bovine articular cartilage: a comparison of frequency-dependent trends. BMC Musculoskeletal Disorders. , 1-8 (2016).
- Caligaris, M., Ateshian, G. A. Effects of sustained interstitial fluid pressurization under migrating contact area, and boundary lubrication by synovial fluid, on cartilage friction. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (10), 1220-1227 (2008).
- Burris, D. L., Ramsey, L., Graham, B. T., Price, C., Moore, A. C. How Sliding and Hydrodynamics Contribute to Articular Cartilage Fluid and Lubrication Recovery. Tribology Letters. 67 (2), 1-10 (2019).
- Mamat, N., Nor, M. Numerical measurement of contact pressure in the tibiofemoral joint during gait. International Conference on Biomedical Engineering (ICoBE). , 27-28 (2012).
- Manda, K., Ryd, L., Eriksson, A. Finite element simulations of a focal knee resurfacing implant applied to localized cartilage defects in a sheep model. Journal of Biomechanics. 44 (5), 794-801 (2011).
