نمذجة أورام العظام الأولية وورم خبيث في العظام مع زرع طعم الورم الصلب في العظام
Summary
لا تتطور نماذج ورم خبيث في العظام إلى ورم خبيث بشكل موحد أو بنسبة 100٪. يمكن أن يؤدي الحقن المباشر داخل الخلايا السرطانية العظمية إلى انصمام الرئة. نقدم تقنيتنا لنمذجة أورام العظام الأولية وورم خبيث في العظام باستخدام زرع طعم الورم الصلب في العظام ، مما يؤدي إلى النقش والنمو القابل للتكرار.
Abstract
تؤدي أورام العظام الأولية أو النقائل العظمية الناتجة عن الأورام الصلبة إلى آفات مؤلمة في حالة العظم أو عظمية الأرومات أو مختلطة من العظم / العظم. هذه الآفات تضر بنية العظام ، وتزيد من خطر الكسر المرضي ، وتترك للمرضى خيارات علاج محدودة. تنتقل أورام العظام الأولية إلى أعضاء بعيدة، مع بعض الأنواع القادرة على الانتشار إلى مواقع الهيكل العظمي الأخرى. ومع ذلك ، تشير الأدلة الحديثة إلى أنه مع وجود العديد من الأورام الصلبة ، قد تكون الخلايا السرطانية التي انتشرت إلى العظام هي المصدر الرئيسي للخلايا التي تنتقل في النهاية إلى أنظمة الأعضاء الأخرى. تتضمن معظم نماذج الفئران الجينية أو xenograft لأورام العظام الأولية الحقن داخل العظم (تقويم العظام) لمعلقات الخلايا السرطانية. تعتمد بعض النماذج الحيوانية للورم الخبيث الهيكلي من الأورام الصلبة أيضا على الحقن المباشر للعظام ، بينما يحاول البعض الآخر تلخيص خطوات إضافية من سلسلة النقيلي العظمي عن طريق حقن الخلايا داخل الأوعية الدموية أو في عضو الورم الرئيسي. ومع ذلك ، لا يصاب أي من هذه النماذج بورم خبيث في العظام بشكل موثوق أو بنسبة 100٪. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن الحقن المباشر داخل العظم للخلايا السرطانية يرتبط بانصمام الورم المحتمل في الرئة. هذه الخلايا السرطانية الصمية تنقش ولكنها لا تلخص الشلال النقيلي. أبلغنا عن نموذج فأر للساركوما العظمية حيث يتم زرع شظايا الورم الطازجة أو المحفوظة بالتبريد (تتكون من الخلايا السرطانية بالإضافة إلى السدى) مباشرة في الساق القريبة باستخدام تقنية جراحية طفيفة التوغل. طورت هذه الحيوانات نقشا قابلا للتكرار ، ونموا ، وبمرور الوقت ، انحلال العظام وورم خبيث في الرئة. تتمتع هذه التقنية بتعدد الاستخدامات لاستخدامها في نمذجة ورم خبيث في عظم الورم الصلب ويمكنها بسهولة استخدام الطعوم التي تتكون من نوع واحد أو عدة أنواع من الخلايا ، والخلايا المعدلة وراثيا ، والطعوم الخارجية المشتقة من المريض ، و / أو الخلايا المصنفة التي يمكن تتبعها عن طريق التصوير البصري أو المتقدم. هنا ، نوضح هذه التقنية ، ونمذجة أورام العظام الأولية وورم خبيث في العظام باستخدام زرع طعم الورم الصلب في العظام.
Introduction
أصبحت نماذج الفئران للأمراض البشرية والحيوانية شائعة بشكل متزايد في البحوث الطبية الحيوية. فائدة استخدام الفئران في هذا السياق هي أن تشريحها وعلم وظائف الأعضاء متشابهان جدا مع البشر. لديهم فترة حمل قصيرة نسبيا ووقت في حياة ما بعد الولادة لتحقيق النضج ، ويرتبطون إلى حد كبير بتكلفة منخفضة نسبيا وسهولة السكن ، وإن كانت تكاليف التطوير أو الشراء المتزايدة مرتبطة بدرجات أكبر من التعديل الوراثي و / أو نقص المناعة و / أو إضفاء الطابع الإنساني1. يؤدي استخدام السلالات الفطرية إلى وجود مجموعة موحدة إلى حد كبير قبل إدراج الدراسة. تشير المعرفة الكاملة للجينوم الخاص بهم إلى درجة عالية من التشابه مع البشر. تم تحديد الأهداف الجزيئية المتعامدة للعديد من عمليات المرض في جينوم الفئران وهناك الآن مكتبة واسعة من الكواشف الخاصة بالفئران التي يمكن الحصول عليها بسهولة. لذلك ، فإنها توفر الفرصة للتحليل عالي الإنتاجية نسبيا بطريقة أسرع وأقل تكلفة عند مقارنتها بالنماذج الحيوانية الأكبر1. بالإضافة إلى ذلك ، مع ظهور استراتيجيات التحرير الجيني التي تسمح بالإفراط في التعبير أو حذف جينات معينة إما على مستوى العالم أو بطريقة محددة لنوع الخلية و / أو بشكل تأسيسي أو بطريقة مستحثة ، فإنها تمثل نظاما نموذجيا مفيدا بيولوجيا للغاية للتحقيق في الأمراض البشرية والحيوانية2.
السرطان هو أحد المجالات التي تتمتع فيها نماذج الفئران بفائدة كبيرة. تعتمد نماذج الفئران الجينية للسرطان على تعديل التعبير عن الجينات المسرطنة أو الجينات المثبطة للورم ، بمفردها أو مجتمعة ، حتى تخضع الخلايا للتحول السرطاني. كما يتم حقن خطوط الخلايا السرطانية الأولية أو الثابتة في الفئران. لا يزال إدخال خطوط الخلايا أو الأنسجة من البشر أو الأنواع الحيوانية الأخرى ، بما في ذلك الفئران ، هو النموذج الأكثر استخداما للسرطان في الجسم الحي. يتم استخدام الخلايا والأنسجة من الأنواع غير المتشابهة (الطعوم الخارجية) في الفئران التي تعاني من نقص المناعةبشكل شائع 2. ومع ذلك ، فإن استخدام خلايا أو أنسجة ورم الطعم الخيفي حيث يكون كل من المضيف والمتلقي من نفس النوع يسمح بالتفاعل مع جهاز مناعي سليم عند دمجه مع نفس سلالة الفأر المضيف في الأنظمة الجينية3.
تؤدي أورام العظام الأولية أو ورم خبيث في العظام من الأورام الصلبة إلى آفات مؤلمة تنحلالية للعظم أو عظمية أو مختلطة / تنحلية عظمية 3,4. هذه الأورام تضر بنية العظام ، وتزيد من خطر الكسر المرضي ، وتترك للمرضى خيارات علاج محدودة. تنتقل أورام العظام الأولية إلى أعضاء بعيدة، مع بعض الأنواع القادرة على الانتشار إلى مواقع الهيكل العظمي الأخرى. في مرضى سرطان الثدي ، العظام هي الموقع الأكثر شيوعا للورم الخبيث الأول والموقع الأول الأكثر شيوعا لعرض المرضالنقيلي 5,6. بالإضافة إلى ذلك ، توجد الخلايا السرطانية المنتشرة (DTCs) في نخاع العظم قبل تشخيص ورم خبيث في الأعضاء الأخرى وتتنبأ بتطوره7. لذلك ، يعتقد أن الخلايا السرطانية الموجودة في العظام هي مصدر الخلايا التي تنتقل في النهاية إلى أنظمة الأعضاء الأخرى. توجد العديد من نماذج الفئران من ورم خبيث الورم الصلب التي تطور ورم خبيث في الغالب في الرئة والغدد الليمفاوية ، واعتمادا على نوع الورم وتقنية الحقن ، من المحتمل أن تكون أنظمة الأعضاء الأخرى3. ومع ذلك ، فإن نماذج الفئران من ورم خبيث العظام تفتقر إلى ذلك بشكل موثوق ، وتنتج بشكل متكرر ورم خبيث هيكلي خاص بالموقع وتطور ورم خبيث في العظام قبل أن تصل الفئران إلى معايير الإزالة المبكرة من عبء الورم الأولي أو ورم خبيث إلى أعضاء أخرى. لقد أبلغنا عن نموذج للساركوما العظمية لورم العظم الأساسي الذي يعتمد على الزرع الجراحي للطعم الخيفي للورم الصلب في الساق القريبة من الفئران8. تشكلت أورام العظام في 100 ٪ من الفئران و 88 ٪ وضعت ورم خبيث رئوي. يتجاوز حدوث ورم خبيث هذا ما يتم الإبلاغ عنه سريريا بشكل شائع في الأشخاص (~ 20-50٪) ، ولكنه ذو أهمية كبيرة لأن الرئة هي الموقع الأكثر شيوعا للورم الخبيث للساركوما العظمية9،10،11. في حين أن هذا النموذج مفيد في نمذجة أورام العظام الأولية ، إلا أنه يتمتع أيضا بفائدة كبيرة في نمذجة ورم خبيث في العظام من أورام صلبة أخرى مثل أورام الثدي والرئة والبروستاتا والغدة الدرقية والكبد والكلى والجهاز الهضمي.
كان الأساس المنطقي لتطوير هذا النموذج هو تطوير بديل للحقن التقليدي داخل العظم عادة في عظم الساق القريب أو عظم الفخذ البعيد لنمذجة أورام العظام الأولية أو ورم خبيثفي العظام 12. كان هدفنا الأساسي هو التخفيف من القيود المعروفة لهذه التقنية ، أي انصمام الورم في الرئة. ينتج عن هذا تطعيم هذه الخلايا السرطانية الصمية و “ورم خبيث اصطناعي” لا يلخص الشلال النقيلي الكامل من ورم عظمي أولي راسخ ينتقل إلى الرئتين 8,13. سيكون هذا هو الوضع أيضا عندما ينتشر ورم خبيث عظمي ثابت إلى موقع بعيد. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير هذه التقنية أيضا لإنتاج نموذج لورم خبيث في العظام من شأنه أن يضمن زيادة حدوث التطعيمات ونمو الأورام في العظام وفي موقع موحد عند مقارنتها بتقنيات الحقن التقويمي أو داخل الأوعية. هذا النموذج له مزايا مميزة على هذه التقنيات الموصوفة. يتضمن هذا النموذج التوصيل المتحكم فيه والمتسق للخلايا السرطانية إلى العظام. كما أنه يتجنب ورم خبيث في الرئة بعد الانصمام الرئوي ويؤسس مجموعة دراسة موحدة أساسية. هناك فائدة من الأورام الخاصة بالموقع مع هذا النموذج دون التعرض لخطر معايير الإزالة المبكرة الناتجة عن الأورام الأولية أو ورم خبيث إلى الأعضاء الأخرى. أخيرا ، هذا النموذج له فائدة كبيرة للتعديل ، بما في ذلك استخدام الطعوم الخارجية المشتقة من المريض.
النموذج المقدم له أوجه تشابه مع الحقن المباشر لتعليق الخلية في العظام باتباع نهج جراحي متبوعا إما بالحقن عبر القشرة أو التسليم في تجويف النخاع بعد إحداث عيب صغير في القشرة (مع أو بدون توسيع تجويف النخاع)8،14،15،16،17. ومع ذلك ، فإن زرع طعم خيفي للورم يجعل هذه التقنية مختلفة بشكل واضح. لذلك ، كان الغرض من هذا التقرير هو إظهار هذا النموذج لأورام العظام الأولية وورم خبيث في العظام من الأورام الصلبة ، والذي يتغلب على العديد من قيود النماذج الموصوفة سابقا. المجموعات البحثية ذات الخبرة في زراعة الخلايا ، ونماذج الفئران ، وتخدير الفئران وجراحتها ، وتشريح الفئران مجهزة تجهيزا جيدا لإعادة إنتاج تقنيتنا لنمذجة أورام العظام الأولية أو ورم خبيث في الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوثق هذا التقرير نموذجنا لإنشاء أورام العظام الأولية أو ورم خبيث في العظام بعد زرع الطعم الخيفي داخل الظنبوب للورم. ونعتقد أن هناك عدة خطوات حاسمة في هذه العملية. يجب إنشاء مستوى مخدر آمن لكل من الحقن تحت الجلد لتعليق الخلايا السرطانية ووضع شظايا الورم الناتجة داخل الظنبوب. يجب أن يكون هنا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون بالمساهمة الحاسمة للدكتورة بيث تشافي ، DVM ، دكتوراه ، DACVP في تطوير هذه التقنية.
Materials
| #15 scalpel blade | Henry Schein Ltd. | 75614 | None |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture |
| Abrams osteosarcoma cell line | Not applicable | Not applicable | None |
| Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s) | VetEquip | 901805 | None |
| Animal weighing scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | None |
| BALB/c nude mouse (nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6-8 weeks of age. Male or female mice |
| Bone cement | Depuy Synthes | 160504 | Optional use instead of bone wax |
| Bone wax | Ethicon | W31G | Optional |
| Buprenorphine | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats |
| Carbon dioxide euthanasia station | N/A | N/A | Should be provided within animal facility |
| Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide | Heraeus | Various | None |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetoquinol | 411412 | None |
| Cryovials (2 ml) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| D-luciferin (Firefly), potassium salt | Perkin Elmer | 122799 | Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene |
| Digital caliper | Mitutoyo | 500-181-30 | Can be manual |
| Digital microradiography cabinet | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | Optional to evaluate bone response to tumor growth |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | None |
| Ethanol (70%) | Sigma Aldrich | 2483 | None |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | None |
| Forceps, Dumont | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | None |
| Freezer (– 80 °C) | Sanyo | MDF-794C | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | Can also use automated cell counter, if available |
| Hypodermic needles (27 gauge) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles |
| Ice | N/A | N/A | Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage |
| Iris scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Ltd. | 1182098 | None |
| IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system | Perkin Elmer | CLS136334 | Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes |
| L-glutamine | Thermofisher scientifc | 25030081 | None |
| Liquid nitrogen | British Oxygen Corporation | NA | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Liquid nitrogen dewar, 5 litres | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml | Corning Life Sciences | 356230 | Optional. Also available in 10 ml size (354230) |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes |
| Mr. Frosty freezing containiner | Fisher Scientific | 10110051 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | Can alternatively use an electric clipper with fine blade |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | None |
| Scalpel handle, #7 Short | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | User preference as long as it accepts #15 scalpel blade |
| Small animal heated pad | VetTech | HE006 | None |
| Stereomicroscope | GT Vision Ltd. | H600BV1 | None |
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine |
| Tissue adhesive (sterile) | 3M Corporation | 84-1469SB | Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size) |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | None |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | Use 0.05%-0.25% |
| Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations) | Becton Dickinson | 309659 | Slip tip preferred over Luer |
| Vented tissue culture flasks, T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | Can also use smaller or larger flasks, as needed |
References
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Wolfe, T. D., et al. Effect of zoledronic acid and amputation on bone invasion and lung metastasis of canine osteosarcoma in nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 28 (4), 377-389 (2011).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- James, J. J., et al. metastases from breast carcinoma: histopathological – radiological correlations and prognostic features. British Journal of Cancer. 89 (4), 660-665 (2003).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
- Chaffee, B. K., Allen, M. J. A clinically relevant mouse model of canine osteosarcoma with spontaneous metastasis. In Vivo. 27 (5), 599-603 (2013).
- Munajat, I., Zulmi, W., Norazman, M. Z., Wan Faisham, W. I. Tumour volume and lung metastasis in patients with osteosarcoma. Journal of Orthopaedic Surgery (Hong Kong). 16 (2), 182-185 (2008).
- Huang, X., et al. Risk and clinicopathological features of osteosarcoma metastasis to the lung: A population-based study. Journal of Bone Oncology. 16, 100230 (2019).
- Li, W., Zhang, S. Survival of patients with primary osteosarcoma and lung metastases. Journal of BUON. 23 (5), 1500-1504 (2018).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. Journal of Visualized Experiments. (67), e4260 (2012).
- Maloney, C., et al. Intratibial Injection Causes Direct Pulmonary Seeding of Osteosarcoma Cells and Is Not a Spontaneous Model of Metastasis: A Mouse Osteosarcoma Model. Clinical Orthopedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
- Dai, J., Hensel, J., Wang, N., Kruithof-de Julio, M., Shiozawa, Y. Mouse models for studying prostate cancer bone metastasis. BoneKey Reports. 5, 777 (2016).
- Marques da Costa, M. E., et al. Establishment and characterization of in vivo orthotopic bioluminescent xenograft models from human osteosarcoma cell lines in Swiss nude and NSG mice. Cancer Medicine. 7 (3), 665-676 (2018).
- Raheem, O., et al. A novel patient-derived intra-femoral xenograft model of bone metastatic prostate cancer that recapitulates mixed osteolytic and osteoblastic lesions. Journal of Translational Medicine. 9, 185 (2011).
- Sasaki, H., Iyer, S. V., Sasaki, K., Tawfik, O. W., Iwakuma, T. An improved intrafemoral injection with minimized leakage as an orthotopic mouse model of osteosarcoma. Analytical Biochemistry. 486, 70-74 (2015).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Yu, C., et al. Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (115), e53982 (2016).
- Kuchimaru, T., et al. A reliable murine model of bone metastasis by injecting cancer cells through caudal arteries. Nature Communications. 9 (1), 2981 (2018).
- Haley, H. R., et al. Enhanced Bone Metastases in Skeletally Immature Mice. Tomography. 4 (2), 84-93 (2018).
- Lei, Z. G., Ren, X. H., Wang, S. S., Liang, X. H., Tang, Y. L. Immunocompromised and immunocompetent mouse models for head and neck squamous cell carcinoma. Onco Targets and Therapy. 9, 545-555 (2016).
- Lefley, D., et al. Development of clinically relevant in vivo metastasis models using human bone discs and breast cancer patient-derived xenografts. Breast Cancer Research. 21 (1), 130 (2019).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
