Modellering van primaire bottumoren en botmetastase met implantatie van solide tumortransplantaten in bot

Summary

Botmetastasemodellen ontwikkelen metastase niet uniform of met een 100% incidentie. Directe intra-osseuze tumorcelinjectie kan leiden tot embolisatie van de long. We presenteren onze techniek voor het modelleren van primaire bottumoren en botmetastase met behulp van solide tumortransplantaatimplantatie in bot, wat leidt tot reproduceerbare transplantatie en groei.

Abstract

Primaire bottumoren of botmetastasen van solide tumoren resulteren in pijnlijke osteolytische, osteoblastische of gemengde osteolytische / osteoblastische laesies. Deze laesies brengen de botstructuur in gevaar, verhogen het risico op pathologische fracturen en laten patiënten achter met beperkte behandelingsopties. Primaire bottumoren metastaseren naar verre organen, waarbij sommige typen zich kunnen verspreiden naar andere skeletlocaties. Recent bewijs suggereert echter dat met veel solide tumoren, kankercellen die zich naar het bot hebben verspreid, de primaire bron kunnen zijn van cellen die uiteindelijk uitzaaien naar andere orgaansystemen. De meeste syngenetische of xenograft-muismodellen van primaire bottumoren omvatten intra-osseuze (orthotopische) injectie van tumorcelsuspensies. Sommige diermodellen van skeletmetastase van solide tumoren zijn ook afhankelijk van directe botinjectie, terwijl anderen proberen extra stappen van de botmetastatische cascade samen te vatten door cellen intravasculair of in het orgaan van de primaire tumor te injecteren. Geen van deze modellen ontwikkelt echter botmetastase op betrouwbare wijze of met een incidentie van 100%. Bovendien is aangetoond dat directe intra-osseuze injectie van tumorcellen geassocieerd is met potentiële tumorembolisatie van de long. Deze embolische tumorcellen engraferen maar recapituleren de gemetastaseerde cascade niet. We rapporteerden een muismodel van osteosarcoom waarbij verse of gecryopreserveerde tumorfragmenten (bestaande uit tumorcellen plus stroma) rechtstreeks in het proximale scheenbeen worden geïmplanteerd met behulp van een minimaal invasieve chirurgische techniek. Deze dieren ontwikkelden reproduceerbare transplantatie, groei en, na verloop van tijd, osteolyse en longmetastase. Deze techniek heeft de veelzijdigheid om te worden gebruikt om solide tumorbotmetastase te modelleren en kan gemakkelijk grafts gebruiken die bestaan uit een of meerdere celtypen, genetisch gemodificeerde cellen, van de patiënt afgeleide xenografts en / of gelabelde cellen die kunnen worden gevolgd door optische of geavanceerde beeldvorming. Hier demonstreren we deze techniek, waarbij we primaire bottumoren en botmetastasen modelleren met behulp van implantatie van solide tumortransplantaat in bot.

Introduction

Muismodellen van ziekten bij mens en dier worden steeds populairder in biomedisch onderzoek. Het nut van het gebruik van muizen in deze context is dat hun anatomie en fysiologie erg lijken op mensen. Ze hebben een relatief korte draagtijd en tijd in het postnatale leven om volwassen te worden, en worden grotendeels geassocieerd met relatief lage kosten en gemak van huisvesting, hoewel toenemende kosten van ontwikkeling of aankoop geassocieerd zijn met grotere graden van genetische modificatie, immunodeficiëntie en / of humanisatie¹. Het gebruik van inteeltstammen resulteert in een grotendeels uniforme dierpopulatie voorafgaand aan de opname in het onderzoek. Een volledige kennis van hun genoom suggereert een hoge mate van gelijkenis met mensen. Orthologe moleculaire doelwitten voor veel ziekteprocessen zijn geïdentificeerd in het muizengenoom en er is nu een uitgebreide bibliotheek van muisspecifieke reagentia die gemakkelijk verkrijgbaar zijn. Daarom bieden ze de mogelijkheid voor een relatief hoge doorvoeranalyse op een snellere en goedkopere manier in vergelijking met grotere diermodellen¹. Bovendien, met de komst van genetische bewerkingsstrategieën die de overexpressie of deletie van bepaalde genen mogelijk maken, hetzij globaal, hetzij op een celtypespecifieke manier en / of constitutief of op een induceerbare manier, vertegenwoordigen ze een zeer biologisch nuttig modelsysteem voor het onderzoek van ziekten bij mens en dier².

Kanker is een gebied waarin muismodellen een groot nut hebben. Genetische muismodellen van kanker vertrouwen op modulatie van de expressie van oncogenen of tumorsuppressorgenen, alleen of in combinatie, voor cellen om oncogene transformatie te ondergaan. De injectie van primaire of gevestigde tumorcellijnen in muizen wordt ook uitgevoerd. De introductie van cellijnen of weefsels van mensen of andere diersoorten, waaronder muizen, blijft het meest gebruikte model van kanker in vivo. Het gebruik van cellen en weefsels van verschillende soorten (xenografts) bij immuungecompromitteerde muizen wordt het meest uitgevoerd². Het gebruik van allograft tumorcellen of weefsels waarbij zowel de gastheer als de ontvanger van dezelfde soort zijn, maakt echter de interactie met een intact immuunsysteem mogelijk in combinatie met dezelfde gastheermuizenstam in syngenetische systemen³.

Primaire bottumoren of botmetastasen van solide tumoren resulteren in pijnlijke osteolytische, osteoblastische of gemengde osteolytische/osteoblastische laesies ^3,4. Deze tumoren brengen de botstructuur in gevaar, waardoor het risico op pathologische fracturen toeneemt en patiënten beperkte behandelingsopties hebben. Primaire bottumoren metastaseren naar verre organen, waarbij sommige typen zich kunnen verspreiden naar andere skeletlocaties. Bij borstkankerpatiënten is bot de meest voorkomende plaats van eerste metastase en de meest voorkomende eerste plaats van presentatie van gemetastaseerde ziekte ^5,6. Bovendien zijn gedissemineerde tumorcellen (DTC’s) aanwezig in het beenmerg voorafgaand aan de diagnose van en voorspellen ze de ontwikkeling van metastase in andere organen⁷. Daarom wordt aangenomen dat kankercellen in het bot de bron zijn van cellen die uiteindelijk uitzaaien naar andere orgaansystemen. Er bestaan veel muismodellen van solide tumormetastase die metastase ontwikkelen, voornamelijk in de long- en lymfeklieren, en afhankelijk van het tumortype en de injectietechniek, mogelijk andere orgaansystemen³. Muismodellen van botmetastasen ontbreken echter die betrouwbaar, reproduceerbaar plaatsspecifieke skeletmetastase produceren en botmetastase ontwikkelen voordat muizen vroege verwijderingscriteria bereiken van primaire tumorbelasting of metastase naar andere organen. We hebben een model van het primaire bottumorosteosarcoom gerapporteerd dat afhankelijk is van de chirurgische implantatie van een solide tumorallograft in het proximale scheenbeen van muizen⁸. Bottumoren gevormd in 100% van de muizen en 88% ontwikkelde longmetastase. Deze incidentie van metastase overtreft wat gewoonlijk klinisch wordt gemeld bij mensen (~ 20-50%), maar is van groot belang omdat de long de meest voorkomende plaats van metastase is voor osteosarcoom 9,10,11. Hoewel dit model voordelig is bij het modelleren van primaire bottumoren, heeft het ook een groot nut bij het modelleren van botmetastasen van andere osteotrope solide tumoren zoals borst-, long-, prostaat-, schildklier-, lever-, nier- en gastro-intestinale tumoren.

De reden voor de ontwikkeling van dit model was om een alternatief te ontwikkelen voor de traditionele intra-botinjectie, meestal in het proximale scheenbeen of distale dijbeen om primaire bottumoren of botmetastase te modelleren¹². Ons primaire doel was om een bekende beperking van deze techniek te verlichten, d.w.z. tumorembolisatie van de long. Dit resulteert in de engraftment van deze embolische tumorcellen en “artefactuele metastase” die niet de volledige metastatische cascade van een gevestigde primaire bottumor die uitzaait naar de longen^{samenvatten 8,13}. Dit zou ook de situatie zijn wanneer een gevestigde botmetastase zich verspreidt naar een verre locatie. Bovendien werd deze techniek ook ontwikkeld om een model van botmetastase te produceren dat een grotere incidentie van engraftment en groei van tumoren in bot en op een uniforme plaats zou garanderen in vergelijking met orthotopische of intravasculaire injectietechnieken. Dit model heeft duidelijke voordelen ten opzichte van deze beschreven technieken. Dit model omvat gecontroleerde, consistente afgifte van tumorcellen in het bot. Het vermijdt ook artefactuele longmetastase na longembolisatie en stelt een uniforme basislijnstudiepopulatie vast. Er is het voordeel van locatiespecifieke tumoren met dit model zonder het risico van vroege verwijderingscriteria als gevolg van primaire tumoren of metastase naar andere organen. Ten slotte heeft dit model een groot nut voor modificatie, inclusief het gebruik van van de patiënt afgeleide xenografts.

Het gepresenteerde model heeft overeenkomsten met directe celsuspensie-injectie in bot na een chirurgische aanpak gevolgd door injectie door de cortex of afgifte in de mergholte na het maken van een klein defect in de cortex (met of zonder ruiming uit de medullaire holte)8,14,15,16,17. De implantatie van een tumor allograft maakt deze techniek echter duidelijk anders. Daarom was het doel van dit rapport om dit model van primaire bottumoren en botmetastase van solide tumoren aan te tonen, dat veel beperkingen van eerder beschreven modellen overwint. Onderzoeksgroepen met ervaring in celkweek, muismodellen, muisanesthesie en chirurgie en muisanatomie zijn goed uitgerust om onze techniek te reproduceren om primaire bottumoren of botmetastasen bij muizen te modelleren.

Protocol

Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door de institutionele dierverzorgings- en gebruikscommissie van de Universiteit van Cambridge, Cambridge, VK. 1. Bereiding van cellijnen Kweek cellijnen in overeenstemming met de standaard celkweekprotocollen van het laboratorium voor traditionele celkweek of injectie in muizen. Standaardprotocollen die hier worden gebruikt, zijn groei in Dulbecco’s gemodificeerde Eagle’s medium met 10% foetaal runderserum (FBS), L-glutamine en penicill…

Representative Results

Een positief resultaat zou geassocieerd zijn met tumortransplantatie en progressieve tumorgroei in de loop van de tijd. Afhankelijk van het tumortype kan intraossale tumorgroei worden geassocieerd met progressieve kreupelheid van de achterpoten, maar veel tumoren veroorzaken geen kreupelheid ondanks tekenen van bijbehorende botziekte. Succesvolle transplantatie werd gedocumenteerd met geavanceerde beeldvorming, waarbij er progressieve radiografische, μCT- of μMRI-veranderingen in het proximale scheenbeen zouden optrede…

Discussion

Dit rapport documenteert ons model om primaire bottumoren of botmetastase te creëren na de intratibiale implantatie van een tumor allograft. Wij zijn van mening dat er verschillende cruciale stappen in dit proces zijn. Een veilig anesthetisch vlak moet worden vastgesteld voor zowel subcutane injectie van de tumorcelsuspensie als intratibiale plaatsing van de resulterende tumorfragmenten. Er moet een steriele voorbereiding van de operatieplaats zijn voor zowel verwijdering van het subcutane allograft als intratibiale pla…

Materials

#15 scalpel blade	Henry Schein Ltd.	75614	None
6-well tissue culture plates	Thermo Fisher Scientific	10578911	Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture
Abrams osteosarcoma cell line	Not applicable	Not applicable	None
Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s)	VetEquip	901805	None
Animal weighing scale	Kent Scientific	SCL- 1015	None
BALB/c nude mouse (nu/nu)	Charles River Ltd.	NA	6-8 weeks of age. Male or female mice
Bone cement	Depuy Synthes	160504	Optional use instead of bone wax
Bone wax	Ethicon	W31G	Optional
Buprenorphine	Animalcare Ltd.	N/A	Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats
Carbon dioxide euthanasia station	N/A	N/A	Should be provided within animal facility
Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide	Heraeus	Various	None
Chlorhexidine surgical scrub	Vetoquinol	411412	None
Cryovials (2 ml)	Thermo Scientific Nalgene	5000-0020	Optional if cryopreserving tumor fragments
D-luciferin (Firefly), potassium salt	Perkin Elmer	122799	Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene
Digital caliper	Mitutoyo	500-181-30	Can be manual
Digital microradiography cabinet	Faxitron Bioptics, LLC	MX-20	Optional to evaluate bone response to tumor growth
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	1371171000	Optional if cryopreserving tumor fragments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	None
Ethanol (70%)	Sigma Aldrich	2483	None
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	26140079	None
Forceps, Dumont	Fine Science Tools, Inc.	11200-33	None
Freezer (– 80 °C)	Sanyo	MDF-794C	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Hemocytometer	Thermo Fisher Scientific	11704939	Can also use automated cell counter, if available
Hypodermic needles (27 gauge)	Henry Schein Ltd.	DIS55510	May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles
Ice	N/A	N/A	Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage
Iris scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	None
Isoflurane	Henry Schein Ltd.	1182098	None
IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system	Perkin Elmer	CLS136334	Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes
L-glutamine	Thermofisher scientifc	25030081	None
Liquid nitrogen	British Oxygen Corporation	NA	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Liquid nitrogen dewar, 5 litres	Thermo Fisher Scientific	TY509X1	Optional if cryopreserving tumor fragments
Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml	Corning Life Sciences	356230	Optional. Also available in 10 ml size (354230)
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002549	Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes
Mr. Frosty freezing containiner	Fisher Scientific	10110051	Optional if cryopreserving tumor fragments
NAIR Hair remover lotion/oil	Thermo Fisher Scientific	NC0132811	Can alternatively use an electric clipper with fine blade
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	None
Scalpel handle, #7 Short	Fine Science Tools, Inc.	10007-12	User preference as long as it accepts #15 scalpel blade
Small animal heated pad	VetTech	HE006	None
Stereomicroscope	GT Vision Ltd.	H600BV1	None
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023	Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine
Tissue adhesive (sterile)	3M Corporation	84-1469SB	Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size)
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	5250061	None
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	Use 0.05%-0.25%
Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations)	Becton Dickinson	309659	Slip tip preferred over Luer
Vented tissue culture flasks, T-75	Corning Life Sciences	CLS3290	Can also use smaller or larger flasks, as needed