Modelado de tumores óseos primarios y metástasis óseas con implantación de injerto de tumor sólido en hueso
Summary
Los modelos de metástasis óseas no desarrollan metástasis de manera uniforme o con una incidencia del 100%. La inyección directa de células tumorales intraóseas puede resultar en la embolización del pulmón. Presentamos nuestra técnica de modelado de tumores óseos primarios y metástasis óseas utilizando la implantación de injerto de tumor sólido en el hueso, lo que lleva a un injerto y crecimiento reproducibles.
Abstract
Los tumores óseos primarios o metástasis óseas de tumores sólidos producen lesiones osteolíticas, osteoblásticas o mixtas osteolíticas/osteoblásticas. Estas lesiones comprometen la estructura ósea, aumentan el riesgo de fractura patológica y dejan a los pacientes con opciones de tratamiento limitadas. Los tumores óseos primarios hacen metástasis a órganos distantes, con algunos tipos capaces de diseminarse a otros sitios esqueléticos. Sin embargo, la evidencia reciente sugiere que con muchos tumores sólidos, las células cancerosas que se han diseminado al hueso pueden ser la fuente principal de células que finalmente hacen metástasis a otros sistemas de órganos. La mayoría de los modelos de ratón singénico o xenoinjerto de tumores óseos primarios implican la inyección intraósea (ortotópica) de suspensiones de células tumorales. Algunos modelos animales de metástasis esqueléticas de tumores sólidos también dependen de la inyección ósea directa, mientras que otros intentan recapitular pasos adicionales de la cascada metastásica ósea inyectando células por vía intravascular o en el órgano del tumor primario. Sin embargo, ninguno de estos modelos desarrolla metástasis óseas de forma fiable o con una incidencia del 100%. Además, se ha demostrado que la inyección intraósea directa de células tumorales está asociada con una posible embolización tumoral del pulmón. Estas células tumorales embólicas se injertan pero no recapitulan la cascada metastásica. Se informó un modelo de ratón de osteosarcoma en el que se implantan fragmentos tumorales frescos o criopreservados (que consisten en células tumorales más estroma) directamente en la tibia proximal mediante una técnica quirúrgica mínimamente invasiva. Estos animales desarrollaron injertos reproducibles, crecimiento y, con el tiempo, osteólisis y metástasis pulmonares. Esta técnica tiene la versatilidad de ser utilizada para modelar metástasis óseas tumorales sólidas y puede emplear fácilmente injertos que consisten en uno o múltiples tipos de células, células genéticamente modificadas, xenoinjertos derivados de pacientes y / o células marcadas que pueden rastrearse mediante imágenes ópticas o avanzadas. Aquí, demostramos esta técnica, modelando tumores óseos primarios y metástasis óseas utilizando la implantación de injerto de tumor sólido en el hueso.
Introduction
Los modelos de ratón de enfermedades humanas y animales son cada vez más populares en la investigación biomédica. La utilidad de usar ratones en este contexto es que su anatomía y fisiología son muy similares a las de los humanos. Tienen un período de gestación relativamente corto y un tiempo en la vida postnatal para alcanzar la madurez, y se asocian en gran medida con un costo relativamente bajo y facilidad de vivienda, aunque los crecientes costos de desarrollo o compra se asocian con mayores grados de modificación genética, inmunodeficiencia y / o humanización1. El uso de cepas endogámicas da como resultado una población animal en gran medida uniforme antes de la inclusión en el estudio. Un conocimiento completo de su genoma sugiere un alto grado de similitud con los humanos. Se han identificado objetivos moleculares ortólogos para muchos procesos de enfermedad en el genoma del ratón y ahora existe una extensa biblioteca de reactivos específicos para ratones que se pueden obtener fácilmente. Por lo tanto, brindan la oportunidad de un análisis de rendimiento relativamente alto de una manera más rápida y menos costosa en comparación con los modelos animales más grandes1. Además, con el advenimiento de estrategias de edición genética que permiten la sobreexpresión o eliminación de ciertos genes, ya sea globalmente o de una manera específica del tipo celular y / o constitutivamente o de manera inducible, representan un sistema modelo muy útil biológicamente para la investigación de enfermedades humanas y animales2.
El cáncer es un campo en el que los modelos de ratón tienen una gran utilidad. Los modelos genéticos de cáncer en ratones se basan en la modulación de la expresión de oncogenes o genes supresores de tumores, solos o en combinación, para que las células experimenten una transformación oncogénica. También se realiza la inyección de líneas celulares tumorales primarias o establecidas en ratones. La introducción de líneas celulares o tejidos de humanos u otras especies animales, incluidos ratones, sigue siendo el modelo de cáncer in vivo más utilizado. El uso de células y tejidos de especies disímiles (xenoinjertos) en ratones inmunocomprometidos se realiza con mayor frecuencia2. Sin embargo, el uso de células tumorales de aloinjerto o tejidos donde tanto el huésped como el receptor son de la misma especie permite la interacción con un sistema inmune intacto cuando se combina con la misma cepa de ratón huésped en sistemas singénicos3.
Los tumores óseos primarios o metástasis óseas de tumores sólidos dan lugar a lesiones osteolíticas, osteoblásticas o mixtas osteolíticas/osteoblásticas, dolorosas 3,4. Estos tumores comprometen la estructura ósea, aumentando el riesgo de fractura patológica y dejan a los pacientes con opciones de tratamiento limitadas. Los tumores óseos primarios hacen metástasis a órganos distantes, con algunos tipos capaces de diseminarse a otros sitios esqueléticos. En pacientes con cáncer de mama, el hueso es el sitio más común de la primera metástasis y el primer sitio de presentación más frecuente de la enfermedad metastásica 5,6. Además, las células tumorales diseminadas (DTC) están presentes en la médula ósea antes del diagnóstico y predicen el desarrollo de metástasis en otros órganos7. Por lo tanto, se cree que las células cancerosas presentes en el hueso son la fuente de células que finalmente hacen metástasis a otros sistemas de órganos. Existen muchos modelos de ratón de metástasis tumorales sólidas que desarrollan metástasis predominantemente en el pulmón y los ganglios linfáticos, y dependiendo del tipo de tumor y la técnica de inyección, potencialmente otros sistemas de órganos3. Sin embargo, faltan modelos de metástasis ósea en ratones que produzcan metástasis esqueléticas específicas del sitio de manera confiable y reproducible y desarrollen metástasis óseas antes de que los ratones alcancen los criterios de eliminación temprana de la carga tumoral primaria o metástasis a otros órganos. Hemos reportado un modelo del osteosarcoma tumoral óseo primario que se basa en la implantación quirúrgica de un aloinjerto tumoral sólido en la tibia proximal de ratones8. Los tumores óseos se formaron en el 100% de los ratones y el 88% desarrollaron metástasis pulmonar. Esta incidencia de metástasis excede lo que comúnmente se informa clínicamente en personas (~ 20-50%), pero es de gran interés ya que el pulmón es el sitio más común de metástasis para el osteosarcoma 9,10,11. Si bien este modelo es ventajoso para modelar tumores óseos primarios, también tiene una gran utilidad para modelar metástasis óseas de otros tumores sólidos osteotrópicos como tumores de mama, pulmón, próstata, tiroides, hígado, riñón y gastrointestinales.
La justificación para el desarrollo de este modelo fue desarrollar una alternativa a la inyección intraósea tradicional típicamente en la tibia proximal o el fémur distal para modelar tumores óseos primarios o metástasis óseas12. Nuestro objetivo principal era aliviar una limitación conocida de esta técnica, es decir, la embolización tumoral del pulmón. Esto resulta en el injerto de estas células tumorales embólicas y “metástasis artificarias” que no recapitulan la cascada metastásica completa de un tumor óseo primario establecido que hace metástasis a los pulmones 8,13. Esta también sería la situación cuando una metástasis ósea establecida se propaga a un sitio distante. Además, esta técnica también se desarrolló para producir un modelo de metástasis ósea que asegurara una mayor incidencia de injertos y crecimiento de tumores en hueso y en un sitio uniforme en comparación con las técnicas de inyección ortotópica o intravascular. Este modelo tiene claras ventajas sobre estas técnicas descritas. Este modelo implica la administración controlada y consistente de células tumorales en el hueso. También evita la metástasis pulmonar artifactual después de la embolización pulmonar y establece una población de estudio uniforme basal. Existe el beneficio de los tumores específicos del sitio con este modelo sin el riesgo de criterios de extirpación temprana resultantes de tumores primarios o metástasis a otros órganos. Por último, este modelo tiene una gran utilidad para la modificación, incluyendo el uso de xenoinjertos derivados de pacientes.
El modelo presentado tiene similitudes con la inyección directa de suspensión celular en el hueso siguiendo un enfoque quirúrgico seguido de inyección a través de la corteza o la administración en la cavidad medular después de hacer un pequeño defecto en la corteza (con o sin escariado de la cavidad medular)8,14,15,16,17 . Sin embargo, la implantación de un aloinjerto tumoral hace que esta técnica sea claramente diferente. Por lo tanto, el propósito de este informe fue demostrar este modelo de tumores óseos primarios y metástasis óseas de tumores sólidos, que supera muchas limitaciones de los modelos descritos anteriormente. Los grupos de investigación con experiencia en cultivo celular, modelos de ratón, anestesia y cirugía de ratón y anatomía de ratón están bien equipados para reproducir nuestra técnica para modelar tumores óseos primarios o metástasis óseas en ratones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este informe documenta nuestro modelo para crear tumores óseos primarios o metástasis óseas después de la implantación intratibial de un aloinjerto tumoral. Creemos que hay varios pasos críticos en este proceso. Se debe establecer un plano anestésico seguro tanto para la inyección subcutánea de la suspensión de células tumorales como para la colocación intratibial de los fragmentos tumorales resultantes. Debe haber una preparación estéril del sitio quirúrgico tanto para la extracción del aloinjerto subcut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP al desarrollo de esta técnica.
Materials
| #15 scalpel blade | Henry Schein Ltd. | 75614 | None |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture |
| Abrams osteosarcoma cell line | Not applicable | Not applicable | None |
| Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s) | VetEquip | 901805 | None |
| Animal weighing scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | None |
| BALB/c nude mouse (nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6-8 weeks of age. Male or female mice |
| Bone cement | Depuy Synthes | 160504 | Optional use instead of bone wax |
| Bone wax | Ethicon | W31G | Optional |
| Buprenorphine | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats |
| Carbon dioxide euthanasia station | N/A | N/A | Should be provided within animal facility |
| Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide | Heraeus | Various | None |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetoquinol | 411412 | None |
| Cryovials (2 ml) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| D-luciferin (Firefly), potassium salt | Perkin Elmer | 122799 | Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene |
| Digital caliper | Mitutoyo | 500-181-30 | Can be manual |
| Digital microradiography cabinet | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | Optional to evaluate bone response to tumor growth |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | None |
| Ethanol (70%) | Sigma Aldrich | 2483 | None |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | None |
| Forceps, Dumont | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | None |
| Freezer (– 80 °C) | Sanyo | MDF-794C | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | Can also use automated cell counter, if available |
| Hypodermic needles (27 gauge) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles |
| Ice | N/A | N/A | Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage |
| Iris scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Ltd. | 1182098 | None |
| IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system | Perkin Elmer | CLS136334 | Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes |
| L-glutamine | Thermofisher scientifc | 25030081 | None |
| Liquid nitrogen | British Oxygen Corporation | NA | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Liquid nitrogen dewar, 5 litres | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml | Corning Life Sciences | 356230 | Optional. Also available in 10 ml size (354230) |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes |
| Mr. Frosty freezing containiner | Fisher Scientific | 10110051 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | Can alternatively use an electric clipper with fine blade |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | None |
| Scalpel handle, #7 Short | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | User preference as long as it accepts #15 scalpel blade |
| Small animal heated pad | VetTech | HE006 | None |
| Stereomicroscope | GT Vision Ltd. | H600BV1 | None |
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine |
| Tissue adhesive (sterile) | 3M Corporation | 84-1469SB | Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size) |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | None |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | Use 0.05%-0.25% |
| Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations) | Becton Dickinson | 309659 | Slip tip preferred over Luer |
| Vented tissue culture flasks, T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | Can also use smaller or larger flasks, as needed |
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