हड्डी में ठोस ट्यूमर ग्राफ्ट प्रत्यारोपण के साथ प्राथमिक हड्डी ट्यूमर और हड्डी मेटास्टेसिस मॉडलिंग
Summary
अस्थि मेटास्टेसिस मॉडल समान रूप से या 100% घटनाओं के साथ मेटास्टेसिस विकसित नहीं करते हैं। प्रत्यक्ष इंट्रा-ओसेस ट्यूमर सेल इंजेक्शन के परिणामस्वरूप फेफड़ों का एम्बोलाइजेशन हो सकता है। हम हड्डी में ठोस ट्यूमर ग्राफ्ट प्रत्यारोपण का उपयोग करके प्राथमिक हड्डी ट्यूमर और हड्डी मेटास्टेसिस मॉडलिंग की हमारी तकनीक प्रस्तुत करते हैं, जिससे प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एनग्राफमेंट और विकास होता है।
Abstract
ठोस ट्यूमर से प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर या हड्डी मेटास्टेसिस के परिणामस्वरूप दर्दनाक ओस्टियोलाइटिक, ओस्टियोब्लास्टिक या मिश्रित ओस्टियोलाइटिक / ओस्टियोब्लास्टिक घाव होते हैं। ये घाव हड्डी की संरचना से समझौता करते हैं, पैथोलॉजिकल फ्रैक्चर के जोखिम को बढ़ाते हैं, और रोगियों को सीमित उपचार विकल्पों के साथ छोड़ देते हैं। प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर दूर के अंगों में मेटास्टेसाइज करते हैं, कुछ प्रकार अन्य कंकाल साइटों में फैलने में सक्षम होते हैं। हालांकि, हाल के सबूत बताते हैं कि कई ठोस ट्यूमर के साथ, हड्डी में फैलने वाली कैंसर कोशिकाएं कोशिकाओं का प्राथमिक स्रोत हो सकती हैं जो अंततः अन्य अंग प्रणालियों में मेटास्टेसाइज करती हैं। प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर के अधिकांश सिंजेनिक या जेनोग्राफ्ट माउस मॉडल में ट्यूमर सेल निलंबन के इंट्रा-ओसेस (ऑर्थोटोपिक) इंजेक्शन शामिल हैं। ठोस ट्यूमर से कंकाल मेटास्टेसिस के कुछ पशु मॉडल भी प्रत्यक्ष हड्डी इंजेक्शन पर निर्भर करते हैं, जबकि अन्य कोशिकाओं को इंट्रावास्कुलर रूप से या प्राथमिक ट्यूमर के अंग में इंजेक्ट करके हड्डी मेटास्टैटिक कैस्केड के अतिरिक्त चरणों को पुन: उत्पन्न करने का प्रयास करते हैं। हालांकि, इनमें से कोई भी मॉडल हड्डी मेटास्टेसिस को मज़बूती से या 100% की घटना के साथ विकसित नहीं करता है। इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष इंट्रा-ओसेस इंजेक्शन को फेफड़ों के संभावित ट्यूमर एम्बोलाइजेशन से जुड़ा हुआ दिखाया गया है। ये एम्बोलिक ट्यूमर कोशिकाएं एनग्राफ्ट करती हैं लेकिन मेटास्टैटिक कैस्केड को पुन: उत्पन्न नहीं करती हैं। हमने ओस्टियोसारकोमा के एक माउस मॉडल की सूचना दी जिसमें ताजा या क्रायोसंरक्षित ट्यूमर के टुकड़े (ट्यूमर कोशिकाओं और स्ट्रोमा से मिलकर) को न्यूनतम इनवेसिव सर्जिकल तकनीक का उपयोग करके सीधे समीपस्थ टिबिया में प्रत्यारोपित किया जाता है। इन जानवरों ने प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एन्ग्राफ्टमेंट, विकास और, समय के साथ, ऑस्टियोलिसिस और फेफड़ों के मेटास्टेसिस को विकसित किया। इस तकनीक में ठोस ट्यूमर हड्डी मेटास्टेसिस को मॉडल करने के लिए उपयोग की जाने वाली बहुमुखी प्रतिभा है और आसानी से एक या कई सेल प्रकारों, आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं, रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स और / या लेबल कोशिकाओं से युक्त ग्राफ्ट को नियोजित कर सकती है जिन्हें ऑप्टिकल या उन्नत इमेजिंग द्वारा ट्रैक किया जा सकता है। यहां, हम इस तकनीक का प्रदर्शन करते हैं, हड्डी में ठोस ट्यूमर ग्राफ्ट प्रत्यारोपण का उपयोग करके प्राथमिक हड्डी ट्यूमर और हड्डी मेटास्टेसिस मॉडलिंग करते हैं।
Introduction
मानव और पशु रोग के माउस मॉडल जैव चिकित्सा अनुसंधान में तेजी से लोकप्रिय हो रहे हैं। इस संदर्भ में चूहों का उपयोग करने की उपयोगिता यह है कि उनकी शारीरिक रचना और शरीर विज्ञान मनुष्यों के समान हैं। परिपक्वता प्राप्त करने के लिए प्रसवोत्तर जीवन में उनके पास अपेक्षाकृत कम गर्भधारण अवधि और समय होता है, और बड़े पैमाने पर अपेक्षाकृत कम लागत और आवास की आसानी से जुड़े होते हैं, हालांकि विकास या खरीद की बढ़ती लागत आनुवंशिक संशोधन, इम्यूनोडेफिशिएंसी और / या मानवीकरण की अधिक डिग्री से जुड़ी होतीहै। इनब्रेड उपभेदों के उपयोग से अध्ययन समावेश से पहले बड़े पैमाने पर एक समान पशु आबादी होती है। उनके जीनोम का एक पूर्ण ज्ञान मनुष्यों के लिए समानता की एक उच्च डिग्री का सुझाव देता है। माउस जीनोम में कई रोग प्रक्रियाओं के लिए ऑर्थोलॉगस आणविक लक्ष्यों की पहचान की गई है और अब माउस-विशिष्ट अभिकर्मकों का एक व्यापक पुस्तकालय है जो आसानी से उपलब्ध हैं। इसलिए, वे बड़े पशु मॉडल1 की तुलना में अपेक्षाकृत उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए अधिक तेजी से और कम खर्चीले तरीके से अवसर प्रदान करते हैं। इसके अलावा, आनुवंशिक संपादन रणनीतियों के आगमन के साथ जो विश्व स्तर पर या सेल प्रकार विशिष्ट तरीके से और / या संवैधानिक रूप से या इंड्यूसेबल तरीके से कुछ जीनों के ओवरएक्प्रेशन या विलोपन की अनुमति देता है, वे मानव औरपशु रोगों की जांच के लिए एक बहुत ही जैविक रूप से उपयोगी मॉडल प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं।
कैंसर एक ऐसा क्षेत्र है जिसमें माउस मॉडल की बहुत उपयोगिता है। कैंसर के आनुवंशिक माउस मॉडल ऑन्कोजेनिक परिवर्तन से गुजरने के लिए कोशिकाओं के लिए अकेले या संयोजन में ऑन्कोजीन या ट्यूमर शमन जीन की अभिव्यक्ति के मॉड्यूलेशन पर निर्भर करते हैं। चूहों में प्राथमिक या स्थापित ट्यूमर सेल लाइनों का इंजेक्शन भी किया जाता है। चूहों सहित मनुष्यों या अन्य जानवरों की प्रजातियों से सेल लाइनों या ऊतकों की शुरूआत, विवो में कैंसर का सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल बना हुआ है। इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड चूहों में असमान प्रजातियों (जेनोग्राफ्ट्स) से कोशिकाओं और ऊतकों का उपयोग सबसेअधिक किया जाता है। हालांकि, एलोग्राफ्ट ट्यूमर कोशिकाओं या ऊतकों का उपयोग जहां मेजबान और प्राप्तकर्ता दोनों एक ही प्रजाति के होते हैं, सिंजेनिक सिस्टम3 में एक ही मेजबान माउस तनाव के साथ संयुक्त होने पर एक बरकरार प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ बातचीत की अनुमति देता है।
ठोस ट्यूमर से प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर या हड्डी मेटास्टेसिस के परिणामस्वरूप दर्दनाक ओस्टियोलाइटिक, ओस्टियोब्लास्टिक, या मिश्रित ओस्टियोलाइटिक / ओस्टियोब्लास्टिक घावहोते हैं। ये ट्यूमर हड्डी की संरचना से समझौता करते हैं, जिससे पैथोलॉजिकल फ्रैक्चर का खतरा बढ़ जाता है, और रोगियों को सीमित उपचार विकल्पों के साथ छोड़ दिया जाता है। प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर दूर के अंगों में मेटास्टेसाइज करते हैं, कुछ प्रकार अन्य कंकाल साइटों में फैलने में सक्षम होते हैं। स्तन कैंसर के रोगियों में, हड्डी पहले मेटास्टेसिस की सबसे आम साइट है और मेटास्टैटिक रोग 5,6 की प्रस्तुति की सबसे लगातार पहली साइट है। इसके अलावा, प्रसारित ट्यूमर कोशिकाएं (डीटीसी) अन्य अंगों में मेटास्टेसिस के निदान से पहले अस्थि मज्जा में मौजूद होती हैं, और भविष्यवाणीकरती हैं। इसलिए, यह माना जाता है कि हड्डी में मौजूद कैंसर कोशिकाएं कोशिकाओं का स्रोत हैं जो अंततः अन्य अंग प्रणालियों में मेटास्टेसाइज करती हैं। ठोस ट्यूमर मेटास्टेसिस के कई माउस मॉडल मौजूद हैं जो मुख्य रूप से फेफड़ों और लिम्फ नोड्स में मेटास्टेसिस विकसित करते हैं, और ट्यूमर प्रकार और इंजेक्शन तकनीक के आधार पर, संभावित रूप से अन्य अंग प्रणालियां3। हालांकि, हड्डी मेटास्टेसिस के माउस मॉडल की कमी है जो निर्भर रूप से, साइट विशिष्ट कंकाल मेटास्टेसिस का उत्पादन करते हैं और चूहों को प्राथमिक ट्यूमर के बोझ या मेटास्टेसिस से अन्य अंगों में प्रारंभिक हटाने के मानदंड तक पहुंचने से पहले हड्डी मेटास्टेसिस विकसित करते हैं। हमने प्राथमिक हड्डी ट्यूमर ओस्टियोसारकोमा के एक मॉडल की सूचना दी हैजो चूहों के समीपस्थ टिबिया में एक ठोस ट्यूमर के सर्जिकल आरोपण पर निर्भर करता है। 100% चूहों में हड्डी के ट्यूमर का गठन हुआ और 88% ने फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस विकसित किया। मेटास्टेसिस की यह घटना आमतौर पर लोगों (~ 20-50%) में चिकित्सकीय रूप से रिपोर्ट की जाती है, लेकिन बहुत रुचि है क्योंकि फेफड़े ओस्टियोसारकोमा 9,10,11 के लिए मेटास्टेसिस की सबसे आम साइट है। जबकि यह मॉडल प्राथमिक हड्डी ट्यूमर मॉडलिंग में फायदेमंद है, यह अन्य ऑस्टियोट्रोपिक ठोस ट्यूमर जैसे स्तन, फेफड़े, प्रोस्टेट, थायरॉयड, यकृत, गुर्दे और जठरांत्र संबंधी ट्यूमर से हड्डी मेटास्टेसिस मॉडलिंग में भी बहुत उपयोगिता है।
इस मॉडल के विकास के लिए तर्क यह था कि प्राथमिक हड्डी ट्यूमर या हड्डी मेटास्टेसिस12 को मॉडल करने के लिए आमतौर पर समीपस्थ टिबिया या डिस्टल फीमर में पारंपरिक इंट्रा-ओसेस इंजेक्शन का विकल्प विकसित किया जाए। हमारा प्राथमिक लक्ष्य इस तकनीक की एक ज्ञात सीमा को कम करना था यानी, फेफड़ों का ट्यूमर एम्बोलाइजेशन। इसके परिणामस्वरूप इन एम्बोलिक ट्यूमर कोशिकाओं और “कृत्रिम मेटास्टेसिस” का उन्मूलन होता है जो एक स्थापित प्राथमिक हड्डी ट्यूमर से पूर्ण मेटास्टैटिक कैस्केड को पुन: उत्पन्न नहीं करते हैं जो फेफड़ों में मेटास्टेसाइज करता है 8,13. यह वह स्थिति भी होगी जब एक स्थापित हड्डी मेटास्टेसिस एक दूर की साइट पर फैलता है। इसके अलावा, इस तकनीक को हड्डी मेटास्टेसिस के एक मॉडल का उत्पादन करने के लिए भी विकसित किया गया था जो ऑर्थोटोपिक या इंट्रावस्कुलर इंजेक्शन तकनीकों की तुलना में हड्डी में और एक समान साइट पर ट्यूमर के एन्ग्राफमेंट और विकास की अधिक घटना सुनिश्चित करेगा। इस मॉडल में इन वर्णित तकनीकों पर अलग-अलग फायदे हैं। इस मॉडल में हड्डी में ट्यूमर कोशिकाओं का नियंत्रित, सुसंगत वितरण शामिल है। यह, फुफ्फुसीय एम्बोलाइजेशन के बाद कृत्रिम फेफड़ों के मेटास्टेसिस से भी बचता है और एक आधारभूत समान अध्ययन आबादी स्थापित करता है। प्राथमिक ट्यूमर या मेटास्टेसिस से अन्य अंगों को होने वाले प्रारंभिक निष्कासन मानदंडों के जोखिम के बिना इस मॉडल के साथ साइट-विशिष्ट ट्यूमर का लाभ है। अंत में, इस मॉडल में संशोधन के लिए बहुत उपयोगिता है, जिसमें रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स का उपयोग भी शामिल है।
प्रस्तुत मॉडल में शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण के बाद हड्डी में सेल निलंबन इंजेक्शन को निर्देशित करने के लिए समानताएं हैं, जिसके बाद कॉर्टेक्स के माध्यम से इंजेक्शन या कॉर्टेक्स में एक छोटा दोष बनाने के बाद मज्जा गुहा में डिलीवरी (मज्जा गुहा के साथ या बिना) 8,14,15,16,17।. हालांकि, एक ट्यूमर एलोग्राफ्ट का आरोपण इस तकनीक को स्पष्ट रूप से अलग बनाता है। इसलिए, इस रिपोर्ट का उद्देश्य ठोस ट्यूमर से प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर और हड्डी मेटास्टेसिस के इस मॉडल को प्रदर्शित करना था, जो पहले वर्णित मॉडल की कई सीमाओं को दूर करता है। सेल कल्चर, माउस मॉडल, माउस एनेस्थीसिया और सर्जरी, और माउस एनाटॉमी में अनुभव के साथ अनुसंधान समूह चूहों में प्राथमिक हड्डी ट्यूमर या हड्डी मेटास्टेसिस को मॉडल करने के लिए हमारी तकनीक को पुन: पेश करने के लिए अच्छी तरह से सुसज्जित हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह रिपोर्ट एक ट्यूमर के इंट्राटिबियल आरोपण के बाद प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर या हड्डी मेटास्टेसिस बनाने के लिए हमारे मॉडल का दस्तावेजीकरण करती है। हमारा मानना है कि इस प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण कदम ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस तकनीक के विकास में डॉ बेथ चैफी, डीवीएम, पीएचडी, डीएसीवीपी के महत्वपूर्ण योगदान को स्वीकार करते हैं।
Materials
| #15 scalpel blade | Henry Schein Ltd. | 75614 | None |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture |
| Abrams osteosarcoma cell line | Not applicable | Not applicable | None |
| Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s) | VetEquip | 901805 | None |
| Animal weighing scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | None |
| BALB/c nude mouse (nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6-8 weeks of age. Male or female mice |
| Bone cement | Depuy Synthes | 160504 | Optional use instead of bone wax |
| Bone wax | Ethicon | W31G | Optional |
| Buprenorphine | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats |
| Carbon dioxide euthanasia station | N/A | N/A | Should be provided within animal facility |
| Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide | Heraeus | Various | None |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetoquinol | 411412 | None |
| Cryovials (2 ml) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| D-luciferin (Firefly), potassium salt | Perkin Elmer | 122799 | Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene |
| Digital caliper | Mitutoyo | 500-181-30 | Can be manual |
| Digital microradiography cabinet | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | Optional to evaluate bone response to tumor growth |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | None |
| Ethanol (70%) | Sigma Aldrich | 2483 | None |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | None |
| Forceps, Dumont | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | None |
| Freezer (– 80 °C) | Sanyo | MDF-794C | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | Can also use automated cell counter, if available |
| Hypodermic needles (27 gauge) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles |
| Ice | N/A | N/A | Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage |
| Iris scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Ltd. | 1182098 | None |
| IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system | Perkin Elmer | CLS136334 | Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes |
| L-glutamine | Thermofisher scientifc | 25030081 | None |
| Liquid nitrogen | British Oxygen Corporation | NA | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Liquid nitrogen dewar, 5 litres | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml | Corning Life Sciences | 356230 | Optional. Also available in 10 ml size (354230) |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes |
| Mr. Frosty freezing containiner | Fisher Scientific | 10110051 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | Can alternatively use an electric clipper with fine blade |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | None |
| Scalpel handle, #7 Short | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | User preference as long as it accepts #15 scalpel blade |
| Small animal heated pad | VetTech | HE006 | None |
| Stereomicroscope | GT Vision Ltd. | H600BV1 | None |
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine |
| Tissue adhesive (sterile) | 3M Corporation | 84-1469SB | Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size) |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | None |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | Use 0.05%-0.25% |
| Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations) | Becton Dickinson | 309659 | Slip tip preferred over Luer |
| Vented tissue culture flasks, T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | Can also use smaller or larger flasks, as needed |
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