إعداد أضعاف الصوتية الجرذ للتحليلات العصبية والعضلية
Summary
يصف هذا البروتوكول الطرق المستخدمة لإعداد طيات صوتية للفئران للدراسة العصبية العضلية الهسكيميائية.
Abstract
الغرض من هذا البرنامج التعليمي هو وصف إعداد أضعاف الصوتية الفئران لدراسة الهستوكيميائية العصبية والعضلية. يحدد هذا البروتوكول إجراءات تشريح الحنجرة للفئران وتجميد الفلاش والتبريد للطيات الصوتية. تصف هذه الدراسة كيفية طيات صوتية بالتبريد في كل من الطائرات الطولية والمقطعية. الجدة من هذا البروتوكول هو تتبع الحنجرة أثناء عملية استئصال الشعر بالتبريد التي تضمن تحديد دقيق للعضلات الحنجرة الجوهرية ويقلل من فرصة فقدان الأنسجة. وتظهر الأرقام عملية البكاء التدريجية في كلا الطائرتين. تم استئصال 29 فأرا من الهيمي-لالحنجرة وتعقبها من ظهور غضروف الغدة الدرقية إلى ظهور القسم الأول الذي تضمن الحظيرة الصوتية الكاملة. تم تصور أضعاف الصوتية الكاملة لجميع الحيوانات في كلا الطائرتين. كان هناك تباين كبير في المسافة من مظهر غضروف الغدة الدرقية إلى ظهور أضعاف الصوتية الكاملة في كلا الطائرتين. لم يكن الوزن مرتبطا بعمق معالم الحنجرة ، مما يشير إلى أن التباين الفردي والعوامل الأخرى المتعلقة بإعداد الأنسجة قد تكون مسؤولة عن التباين العالي في ظهور المعالم أثناء القسمة. هذه الدراسة تفاصيل منهجية ويقدم البيانات المورفولوجية لإعداد حظيرة الفئران الصوتية للتحقيق العصبي العضلي الهسوشية. نظرا للتغير الفردي العالي ، يجب تتبع معالم الحنجرة عن كثب أثناء عملية استئصال الشعر لمنع فقدان الأنسجة والأنسجة. وسيساعد استخدام منهجية متسقة، بما في ذلك إعداد الأنسجة الكافية والوعي بالمعالم داخل حنجرة الفئران، في تحقيق نتائج متسقة عبر الدراسات ومساعدة الباحثين الجدد المهتمين باستخدام الحظيرة الصوتية للفئران كنموذج للتحقيق في الآليات العصبية العضلية الحنجرة.
Introduction
حنجرة الفئران هو نموذج راسخ للتحقيق في التكيف الهيكلي والوظيفي للحنجرة العصبية العضلية مع التنمية والشيخوخة والمرض والعوامل الدوائية1،2،3،4،5. اتساق الأساليب النسيجية أمر بالغ الأهمية لهذا الخط من العمل، كما أن هناك تعقيدات متعددة تشارك في إعداد العضلات وتحليلها، فضلا عن التحديات المرتبطة حجم الحنجرة، والشكل، وتضاريس العضلات مغلفة داخل الغضاريف الحنجرة1،6،7،8،9،10،11 . نظرا لصغر حجم عضلات الحنجرة الجوهرية للفئران ، فإن التضمين المنهجي والتجميد والتشخيص البردي أمر بالغ الأهمية لتحقيق نتائج متسقة ودقيقة. على سبيل المثال، عند تقسيم أضعاف صوت الفئران في الطائرة التاجية، تقع التقاطعات العصبية العضلية (NMJs) لأربعة من عضلات الحنجرة الجوهرية ضمن أقل من 1.8 مم من عمق الأنسجة11. لذلك ، فإن الرصد الدقيق لتشريح العضلات الحنجرة أثناء عملية استئصال الأعصاب أمر حتمي لتحديد القسم (المقاطع) ذات الاهتمام بدقة ومنع الإفراط في استئصال الأنسجة. يمكن أن يؤدي الإفراط في استئصال العضلات المستهدفة إلى تحديد غير دقيق لعدد وتضاريس NMJs11 أو يمكن أن يؤدي إلى تخفيضات إجمالية في حجم العينة إذا تم التخلص من العضلات المستهدفة بسبب ارتباك التوجه التاريخي12. كما يتم تطوير نماذج جديدة لدراسة العضلات الحنجرة والتكيفات الخاصة بهم، إجراءات التشغيل القياسية ضرورية لضمان النتائج دقيقة وموثوق بها، وقابلة للاستنساخ عبر الدراسات.
الهدف من هذه المقالة هو إعداد مفصل للطية الصوتية الفئران للتحليل الطولي والمقطعي الأمثل. يتم وصف الطرق التفصيلية المستخدمة بانتظام في مختبرنا لتحديد معالم العضلات المستهدفة أثناء عملية استئصال التبريد. على الرغم من استخدام أساليب مماثلة في العديد من المختبرات ، يتم توفير تفاصيل أكبر هنا مما هو عليه في الأدبيات لضمان تكرار موثوق ودقيق عند تنفيذه من قبل المحققين المبتدئين. الهدف من هذا البرنامج التعليمي هو توفير منهجية قياسية لتقييم الكيمياء المناعية (IHC) للطية الصوتية الفئران لتحسين الاتساق عبر المختبرات والتحقيقات.
Protocol
Representative Results
Discussion
إعداد طيات الفئران الصوتية للتحليل العصبي العضلي يمكن أن تقدم مع تحديات مختلفة. ليس فقط عضلات الحنجرة صغيرة ومحاطة الغضاريف، مما يجعل من الصعب استخراج العضلات المستهدفة مباشرة، تم العثور على تباين كبير أيضا بين الحيوانات في عمق المعالم التشريحية الحنجرة. بالنسبة للعضلات بروتوكول مستوى ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من خلال منح F31DC017053-01A1 (Lenell، PI) وK23DC014517 (جونسون، PI) من المعهد الوطني للصمم واضطرابات الاتصال الأخرى للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| 2-Methylbutane Certified | Fisher Chemical | 35514 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Cryostat blades | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Disposable Base Molds 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Disposable Underpads | Medline | 23-666-062 | |
| Dissection kit | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS – Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ice Bucket | Bel-Art | 11999054 | |
| Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Needle holders | Assi | ASSI.B148 | |
| Non-Woven Sponges, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
| Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Pap pen | |||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | Fisherbrand | 5408129 | |
| Specimen Storage Bags | Fisherbrand | 19240093 | |
| Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Task wiper | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas Pattern Scissors | Assi | ASSI.SAS15RV | |
| NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods. | |||
References
- Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), 579-586 (2002).
- Suzuki, T., et al. Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).
- Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration. Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).
- Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context. Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).
- Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval. Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).
- Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats. Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).
- Ciucci, M. R., et al. Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats. Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).
- Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease. Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).
- Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats. American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).
- Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats. Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).
- Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function. Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).
- Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and don’ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).
- McMullen, C. A., et al. Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).
- Lenell, C., Johnson, A. M. Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat. Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats. Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).
