Preparação da Dobra Vocal do Rato para Análises Neuromusculares
Summary
Este protocolo descreve métodos usados para preparar dobras vocais de ratos para estudo neuromuscular histoquímico.
Abstract
O objetivo deste tutorial é descrever a preparação da dobra vocal de rato para o estudo neuromuscular histoquímico. Este protocolo descreve procedimentos para dissecção laríngea de ratos, congelamento de flash e criosectioning das dobras vocais. Este estudo descreve como criosecção dobras vocais em planos longitudinais e transversais. Uma novidade deste protocolo é o rastreamento laríngeo durante a criosecção que garante a identificação precisa dos músculos laríngeos intrínsecos e reduz a chance de perda de tecido. Os números demonstram a crioseção progressiva em ambos os planos. Vinte e nove hemi-laringes de ratos foram criosectionados e rastreados desde o surgimento da cartilagem tireoide até o aparecimento da primeira seção que incluía a dobra vocal completa. A dobra vocal completa foi visualizada para todos os animais em ambos os planos. Houve alta variabilidade na distância do aparecimento da cartilagem tireoide ao aparecimento da dobra vocal completa em ambos os planos. O peso não foi correlacionado à profundidade dos marcos laríngeos, sugerindo que a variabilidade individual e outros fatores relacionados à preparação tecidual podem ser responsáveis pela alta variabilidade no aparecimento de marcos durante a secção. Este estudo detalha uma metodologia e apresenta dados morfológicos para a preparação da dobra vocal de ratos para investigação neuromuscular histoquímica. Devido à alta variabilidade individual, os marcos laríngeos devem ser acompanhados de perto durante a crioseção para evitar a perda de tecido e tecido overfando. O uso de uma metodologia consistente, incluindo a preparação adequada do tecido e a conscientização de marcos dentro da laringe de ratos, auxiliará em resultados consistentes em estudos e ajudará novos pesquisadores interessados em usar a dobra vocal de ratos como modelo para investigar mecanismos neuromusculares laríngeos.
Introduction
A laringe de ratos é um modelo bem estabelecido para investigar adaptações de laringe neuromuscular estrutural e funcional para o desenvolvimento, envelhecimento, doença e agentes farmacológicos1,2,3,4,5. A consistência dos métodos histológicos é fundamental para essa linha de trabalho, pois há múltiplas complexidades envolvidas na preparação e análise muscular, bem como desafios associados ao tamanho, forma e topografia laríngeos dos músculos encapsulados dentro das cartilagens laríngeas1,6,7,8,9,10,11 . Devido ao pequeno tamanho dos músculos laríngeos intrínsecos do rato, incorporação sistemática, congelamento e criosecção são fundamentais para alcançar resultados consistentes e precisos. Por exemplo, ao seccionar a dobra vocal do rato no plano coronal, as junções neuromusculares (NMJs) de quatro dos músculos laríngeos intrínsecos estão localizadas dentro de menos de 1,8 mm de profundidade tecidual11. Portanto, o monitoramento preciso da anatomia muscular laríngea durante a criosecção é imperativo para identificar com precisão a seção de interesse e evitar o oversectioning do tecido. O oversectioning do músculo alvo pode resultar em identificação imprecisa do número e topografia de NMJs11 ou pode resultar em reduções globais no tamanho da amostra se o músculo alvo for descartado devido à confusão de orientação de marco12. À medida que novos modelos para o estudo do músculo laríngeo e suas respectivas adaptações são desenvolvidos, procedimentos operacionais padrão são essenciais para garantir que os resultados sejam precisos, confiáveis e reprodutíveis em todos os estudos.
O objetivo deste artigo é detalhar a preparação da dobra vocal de rato para uma análise longitudinal e transversal ideal. Métodos detalhados usados regularmente em nosso laboratório são descritos para identificar marcos musculares alvo durante a crioseção. Embora métodos semelhantes sejam usados em vários laboratórios, maiores detalhes são fornecidos aqui do que na literatura para garantir uma replicação confiável e precisa quando implementado por investigadores iniciantes. O objetivo deste tutorial é fornecer uma metodologia padrão para avaliação imunohistoquímica (IHC) da dobra vocal de ratos para melhorar a consistência entre laboratórios e investigações.
Protocol
Representative Results
Discussion
Preparar dobras vocais de ratos para análise neuromuscular pode apresentar vários desafios. Não só os músculos laríngeos são pequenos e cercados por cartilagem, dificultando a extração direta do músculo alvo, a alta variabilidade também foi encontrada entre os animais na profundidade de marcos anatômicos laríngeos. Para o protocolo de plano transversal, as seções completas das dobras vocais apareceram entre 21-85 seções (10 μm por seção) após o aparecimento inicial da cartilagem da tireoide ventral, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelas bolsas F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) e K23DC014517 (Johnson, PI) do Instituto Nacional de Surdez e outros Transtornos de Comunicação dos Institutos Nacionais de Saúde.
Materials
| 2-Methylbutane Certified | Fisher Chemical | 35514 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Cryostat blades | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Disposable Base Molds 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Disposable Underpads | Medline | 23-666-062 | |
| Dissection kit | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS – Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ice Bucket | Bel-Art | 11999054 | |
| Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Needle holders | Assi | ASSI.B148 | |
| Non-Woven Sponges, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
| Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Pap pen | |||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | Fisherbrand | 5408129 | |
| Specimen Storage Bags | Fisherbrand | 19240093 | |
| Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Task wiper | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas Pattern Scissors | Assi | ASSI.SAS15RV | |
| NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods. | |||
References
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