Подготовка голосовой складки крысы к нервно-мышечному анализу
Summary
Этот протокол описывает методы, используемые для подготовки голосовых складок крыс к гистохимическому нервно-мышечному исследованию.
Abstract
Целью этого урока является описание подготовки голосовой складки крысы к гистохимическому нервно-мышечному исследованию. В этом протоколе описываются процедуры рассечения гортани крыс, мгновенного замораживания и криосекции голосовых складок. В этом исследовании описывается, как проводить криосекцию голосовых складок как в продольной, так и в поперечной плоскостях. Новинкой этого протокола является отслеживание гортани во время криосекции, что обеспечивает точную идентификацию внутренних мышц гортани и снижает вероятность потери тканей. Рисунки демонстрируют прогрессивную криосечение в обеих плоскостях. Двадцать девять крысиных геми-ларингов были криосекциированы и отслежены от появления щитовидного хряща до появления первой секции, которая включала полную голосовую складку. Полная голосовая складка была визуализирована для всех животных в обоих плоскостях. Отмечалась высокая вариабельность расстояния от появления щитовидного хряща до появления полной голосовой складки в обеих плоскостях. Вес не коррелировал с глубиной гортанных ориентиров, предполагая, что индивидуальная изменчивость и другие факторы, связанные с подготовкой тканей, могут быть ответственны за высокую изменчивость внешнего вида ориентиров во время секционирования. Это исследование детализирует методологию и представляет морфологические данные для подготовки голосовой складки крысы к гистохимическому нервно-мышечному исследованию. Из-за высокой индивидуальной вариабельности ориентиры гортани должны тщательно отслеживаться во время криосекции, чтобы предотвратить пересечение ткани и потерю тканей. Использование последовательной методологии, включая адекватную подготовку тканей и осведомленность о ориентирах в гортани крысы, поможет получить последовательные результаты во всех исследованиях и поможет новым исследователям, заинтересованным в использовании голосовой складки крысы в качестве модели для изучения нервно-мышечных механизмов гортани.
Introduction
Крысиная гортань является хорошо зарекомендовавшей себя моделью для исследования структурных и функциональных нервно-мышечных адаптаций гортани к развитию, старению, болезням и фармакологическим агентам1,2,3,4,5. Согласованность гистологических методов имеет решающее значение для этого направления работы, поскольку существует множество тонкостей, связанных с подготовкой и анализом мышц, а также проблемы, связанные с размером гортани, формой и топографией мышц, инкапсулированных в гортанных хрящах1,6,7,8,9,10,11 . Из-за небольшого размера внутренних мышц гортани крыс систематическое встраивание, замораживание и криосечение имеют решающее значение для достижения последовательных и точных результатов. Например, при разрезании голосовой складки крысы в корональной плоскости нервно-мышечные соединения (NMJ) четырех внутренних мышц гортани расположены в пределах менее 1,8 мм глубины ткани11. Поэтому точный мониторинг анатомии гортанных мышц во время криосекции необходим для точного определения интересующего участка (участков) и предотвращения чрезмерного разреза ткани. Чрезмерное вырезание целевой мышцы может привести к неточной идентификации числа и топографии NMJs11 или может привести к общему уменьшению размера выборки, если целевая мышца отброшена из-за путаницы ориентации ориентира12. По мере разработки новых моделей для изучения мышц гортани и их соответствующих адаптаций стандартные операционные процедуры необходимы для обеспечения точности, надежности и воспроизводимости результатов во всех исследованиях.
Целью данной статьи является детальная подготовка голосовой складки крысы к оптимальному продольному и поперечному анализу. Описаны подробные методы, регулярно используемые в нашей лаборатории для выявления целевых мышечных ориентиров во время криосекции. Хотя подобные методы используются в нескольких лабораториях, здесь приводится более подробная информация, чем в литературе, чтобы обеспечить надежную и точную репликацию при внедрении начинающими исследователями. Целью этого учебника является предоставление стандартной методологии иммуногистохимической (IHC) оценки голосовой складки крыс для улучшения согласованности в лабораториях и исследованиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Подготовка голосовых складок крыс к нервно-мышечному анализу может столкнуться с различными проблемами. Мало того, что гортанные мышцы малы и окружены хрящом, что затрудняет непосредственное извлечение мышц-мишеней, высокая изменчивость также была обнаружена между животными в глубин…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) и K23DC014517 (Johnson, PI) от Национального института глухоты и других коммуникативных расстройств Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| 2-Methylbutane Certified | Fisher Chemical | 35514 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Cryostat blades | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Disposable Base Molds 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Disposable Underpads | Medline | 23-666-062 | |
| Dissection kit | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS – Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ice Bucket | Bel-Art | 11999054 | |
| Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Needle holders | Assi | ASSI.B148 | |
| Non-Woven Sponges, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
| Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Pap pen | |||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | Fisherbrand | 5408129 | |
| Specimen Storage Bags | Fisherbrand | 19240093 | |
| Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Task wiper | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas Pattern Scissors | Assi | ASSI.SAS15RV | |
| NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods. | |||
References
- Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), 579-586 (2002).
- Suzuki, T., et al. Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).
- Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration. Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).
- Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context. Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).
- Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval. Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).
- Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats. Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).
- Ciucci, M. R., et al. Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats. Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).
- Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease. Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).
- Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats. American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).
- Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats. Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).
- Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function. Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).
- Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and don’ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).
- McMullen, C. A., et al. Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).
- Lenell, C., Johnson, A. M. Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat. Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats. Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).
