Nöromüsküler Analizler için Sıçan Vokal Kıvrımının Hazırlanması
Summary
Bu protokol, histokimyasal nöromüsküler çalışma için sıçan vokal kıvrımları hazırlamak için kullanılan yöntemleri açıklar.
Abstract
Bu öğreticinin amacı histokimyasal nöromüsküler çalışma için sıçan vokal kıvrımının hazırlanmasını tanımlamaktır. Bu protokol, sıçan gırtlağım diseksiyonu, flaş dondurma ve ses kıvrımlarının kriyoseksiyonu için prosedürleri özetlemektedir. Bu çalışmada hem boyuna hem de kesitsel düzlemlerde kriyoseksiyon vokal kıvrımlarının nasıl ağlaşılacağı açıklanmaktadır. Bu protokolün bir yeniliği, kriyoseksiyon sırasında içsel gırtlağın doğru tanımlanmasını sağlayan ve doku kaybı olasılığını azaltan gırtlağı takibidir. Rakamlar her iki düzlemde de ilerleyici kriyoseksiyon olduğunu gösteriyor. Tiroid kıkırdılmasının ortaya çıkışından tam vokal kıvrımını içeren ilk bölümün görünümüne kadar yirmi dokuz sıçan hemi-larynges kriyoseksiyon ve izlendi. Tam vokal kıvrımı her iki düzlemdeki tüm hayvanlar için görselleştirildi. Tiroid kıkırdajının görünümünden her iki düzlemde de tam ses kıvrımının görünümüne kadar olan mesafede yüksek değişkenlik vardı. Ağırlık, laringeal yer işaretlerinin derinliği ile ilişkili değildi, bu da bireysel değişkenlik ve doku hazırlığı ile ilgili diğer faktörlerin, bölümleme sırasında yer işaretlerinin görünümündeki yüksek değişkenliklerden sorumlu olabileceğini düşündürdü. Bu çalışma bir metodolojiyi detaylandırıyor ve sıçan vokal kıvrımını histokimyasal nöromüsküler araştırma için hazırlamak için morfolojik veriler sunuyor. Yüksek bireysel değişkenlik nedeniyle, aşırı doku ve doku kaybını önlemek için kriyoseksiyon sırasında gırtlağı yer işaretleri yakından takip edilmelidir. Yeterli doku hazırlama ve sıçan larinks içindeki yer işaretlerinin farkındalığı da dahil olmak üzere tutarlı bir metodolojinin kullanılması, çalışmalar genelinde tutarlı sonuçlara yardımcı olacak ve laringeal nöromüsküler mekanizmaları araştırmak için sıçan vokal kıvrımını bir model olarak kullanmakla ilgilenen yeni araştırmacılara yardımcı olacaktır.
Introduction
Sıçan larinksi, gelişim, yaşlanma, hastalık ve farmakolojik ajanlara yapısal ve fonksiyonel nöromüsküler laringeal adaptasyonları araştırmak için iyi kurulmuş bir modeldir1,2,3,4,5. Histolojik yöntemlerin tutarlılığı, kas hazırlama ve analizinde birden fazla incelik olduğu gibi gırtlağı kıkırdaklar içinde kapsüllenen kasların gırtlağı boyutu, şekli ve topografyası ile ilgili zorluklar olduğu için bu iş kolu için kritik öneme sahiptir1,6,7,8,9,10,11 . Sıçan içsel gırtlağım kaslarının küçük boyutu nedeniyle, tutarlı ve doğru sonuçlar elde etmek için sistematik gömme, dondurma ve kriyoseksiyon kritik öneme sahiptir. Örneğin, sıçan ses kıvrımını koronal düzlemde bölümlerken, içsel gırtlağı kaslarının dördünün nöromüsküler kavşakları (NMJs) doku derinliğinin 1,8 mm’den daha az içinde bulunur11. Bu nedenle, kriyoseksiyon sırasında gırtlaj kas anatomisinin hassas bir şekilde izlenmesi, ilgi alanlarını doğru bir şekilde tanımlamak ve dokunun aşırı bölümünü önlemek için zorunludur. Hedef kasın aşırı gözden belirlenmesi, NMJs11’in sayısının ve topografyasının yanlış tanımlanmasına neden olabilir veya hedef kas dönüm noktası oryantasyon karışıklığı nedeniyle atılırsa örnek boyutunda genel azalmalara neden olabilir12. Laringeal kasların ve ilgili adaptasyonlarının incelenmesi için yeni modeller geliştirildiği için, sonuçların kesin, güvenilir ve çalışmalar arasında tekrarlanabilir olmasını sağlamak için standart çalışma prosedürleri gereklidir.
Bu makalenin amacı, sıçan vokal kıvrımının optimal boyuna ve kesitsel analiz için hazırlanmasını detaylandırmaktır. Kriyoseksiyon sırasında hedef kas yer işaretlerini belirlemek için laboratuvarımızda düzenli olarak kullanılan ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. Benzer yöntemler birkaç laboratuvarda kullanılsa da, acemi araştırmacılar tarafından uygulandığında güvenilir ve doğru replikasyon sağlamak için burada literatüre göre daha fazla ayrıntı sağlanmaktadır. Bu öğreticinin amacı, laboratuvarlar ve araştırmalar arasında tutarlılığı artırmak için sıçan vokal kıvrımının immünohistokimyasal (IHC) değerlendirilmesi için standart bir metodoloji sağlamaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nöromüsküler analiz için sıçan vokal kıvrımlarının hazırlanması çeşitli zorluklarla karşı karşıya olabilir. Gırtlağı kasları sadece küçük ve kıkırdakla çevrili değildir, böylece doğrudan hedef kasın çıkarılmasını zorlaştırır, ayrıca gırtlağı anatomik yer işaretlerinin derinliğinde hayvanlar arasında yüksek değişkenlik bulunmuştur. Kesit düzlem protokolünü kaslamak için, ventral tiroid kıkırdajının ilk görünümünden sonra 21−85 bölüm (bölüm başına 10 μ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü’nden F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) ve K23DC014517 (Johnson, PI) hibeleri ile desteklendi.
Materials
| 2-Methylbutane Certified | Fisher Chemical | 35514 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Cryostat blades | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Disposable Base Molds 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Disposable Underpads | Medline | 23-666-062 | |
| Dissection kit | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS – Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ice Bucket | Bel-Art | 11999054 | |
| Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Needle holders | Assi | ASSI.B148 | |
| Non-Woven Sponges, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
| Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Pap pen | |||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | Fisherbrand | 5408129 | |
| Specimen Storage Bags | Fisherbrand | 19240093 | |
| Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Task wiper | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas Pattern Scissors | Assi | ASSI.SAS15RV | |
| NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods. | |||
References
- Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), 579-586 (2002).
- Suzuki, T., et al. Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).
- Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration. Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).
- Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context. Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).
- Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval. Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).
- Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats. Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).
- Ciucci, M. R., et al. Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats. Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).
- Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease. Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).
- Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats. American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).
- Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats. Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).
- Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function. Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).
- Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and don’ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).
- McMullen, C. A., et al. Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).
- Lenell, C., Johnson, A. M. Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat. Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats. Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).
