Denne protokol beskriver metoder, der anvendes til at forberede rotte vokal folder til histokemisk neuromuskulær undersøgelse.
Formålet med denne tutorial er at beskrive forberedelsen af rotte vokal fold for histokemisk neuromuskulær undersøgelse. Denne protokol skitserer procedurer for rotte larynx dissektion, flash-frysning, og cryosectioning af vokal folder. Denne undersøgelse beskriver, hvordan man cryosection vokal folder i både langsgående og tværsnit fly. En nyhed i denne protokol er larynx tracking under cryosectioning, der sikrer præcis identifikation af de iboende larynx muskler og reducerer risikoen for vævstab. Tal viser den progressive kryosectioning i begge fly. 29 rotte hemi-larynges blev cryosectioned og spores fra fremkomsten af skjoldbruskkirtlen brusk til udseendet af det første afsnit, der omfattede den fulde vokal fold. Den fulde vokalfold blev visualiseret for alle dyr i begge planer. Der var høj variation i afstanden fra udseendet af skjoldbruskkirtlen brusk til udseendet af den fulde vokal fold i begge fly. Vægten var ikke korreleret til dybden af larynx landemærker, hvilket tyder på individuelle variabilitet og andre faktorer i forbindelse med vævspræparat kan være ansvarlig for den høje variation i udseendet af landemærker under afsnit. Denne undersøgelse beskriver en metode og præsenterer morfologiske data til forberedelse af rotte vokal fold til histokemisk neuromuskulær undersøgelse. På grund af høj individuel variation bør larynx landemærker spores nøje under kryosektion for at forhindre tilsyn med væv og vævstab. Brugen af en konsekvent metode, herunder tilstrækkelig vævsforberedelse og bevidsthed om landemærker inden for rottestrubehovedet, vil hjælpe med ensartede resultater på tværs af undersøgelser og hjælpe nye forskere, der er interesseret i at bruge rottevokalfolden som model til at undersøge larynx neuromuskulære mekanismer.
Rottestrubehovedet er en veletableret model til at undersøge strukturelle og funktionelle neuromuskulære larynx tilpasninger til udvikling, aldring, sygdom og farmakologiske agenser1,2,3,4,5. Konsistensen af histologiske metoder er afgørende for denne branche, da der er flere snørklede involveret i muskelforberedelse og -analyse samt udfordringer forbundet med larynx størrelse, form og topografi af musklerne indkapslet i larynx brusk1,6,7,8,9,10,11 . På grund af den lille størrelse af rotten iboende larynx muskler, systematisk indlejring, frysning, og cryosectioning er afgørende for at opnå konsekvente og præcise resultater. For eksempel, når du sektionerer rottevokalfolden i koronarplanet, er de neuromuskulære knudepunkter (NMJs) af fire af de iboende larynxmuskler placeret inden for mindre end 1,8 mm vævsdybde11. Derfor er præcis overvågning af larynx muskel anatomi under cryosectioning er afgørende for præcist at identificere de afsnit (r) af interesse og forhindre tilsyn med væv. Tilsyn med målet muskel kan resultere i unøjagtig identifikation af antal og topografi af NMJs11 eller kan resultere i samlede reduktioner i stikprøvestørrelsen, hvis målet muskel kasseres på grund af skelsættende orientering forvirring12. Som nye modeller for studiet af larynx muskel og deres respektive tilpasninger er udviklet, standard driftsprocedurer er afgørende for at sikre resultaterne er præcise, pålidelige og reproducerbare på tværs af undersøgelser.
Formålet med denne artikel er at detaljeret forberedelse af rotte vokal fold for optimal langsgående og tværsnit analyse. Detaljerede metoder, der anvendes regelmæssigt i vores laboratorium er beskrevet til at identificere mål muskel vartegn under cryosectioning. Selvom lignende metoder anvendes i flere laboratorier, gives der større detaljer her end i litteraturen for at sikre pålidelig og præcis replikation, når de implementeres af nybegyndere. Målet med denne tutorial er at give en standard metode til immunohistokemisk (IHC) evaluering af rotte vokal fold for at forbedre konsistensen på tværs af laboratorier og undersøgelser.
Forberedelse rotte vokal folder til neuromuskulær analyse kan præsentere med forskellige udfordringer. Ikke alene er larynx muskler små og omgivet af brusk, hvilket gør det vanskeligt at direkte udtrække målmuskel, høj variation blev også fundet mellem dyr i dybden af larynx anatomiske vartegn. For muskel tværsnit plan protokol, komplet vokal fold sektioner dukkede op mellem 21−85 sektioner (10 μm per sektion) efter den første forekomst af den ventrale skjoldbruskkirtlen brusk, som er en hel del færre end d…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af tilskud F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) og K23DC014517 (Johnson, PI) fra National Institute on Døvhed og andre kommunikationsforstyrrelser fra National Institutes of Health.
2-Methylbutane Certified | Fisher Chemical | 35514 | |
Aluminum Foil | Fisherbrand | 1213101 | |
Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
Cryostat blades | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
Disposable Base Molds 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
Disposable Underpads | Medline | 23-666-062 | |
Dissection kit | Thermo Scientific | 9996969 | |
DPBS – Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
Ice Bucket | Bel-Art | 11999054 | |
Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
Needle holders | Assi | ASSI.B148 | |
Non-Woven Sponges, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
Pap pen | |||
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
Premium Microcentrifuge Tubes | Fisherbrand | 5408129 | |
Specimen Storage Bags | Fisherbrand | 19240093 | |
Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
Task wiper | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
Vannas Pattern Scissors | Assi | ASSI.SAS15RV | |
NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods. |