Neuromuscular विश्लेषण के लिए चूहा मुखर गुना की तैयारी
Summary
यह प्रोटोकॉल हिस्टोकेमिकल न्यूरोमस्कुलर अध्ययन के लिए चूहे के मुखर सिलवटों को तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों का वर्णन करता है।
Abstract
इस ट्यूटोरियल का उद्देश्य हिस्टोकेमिकल न्यूरोमस्कुलर अध्ययन के लिए चूहे मुखर गुना की तैयारी का वर्णन करना है। यह प्रोटोकॉल चूहे स्वरयंत्र विच्छेदन, फ्लैश-फ्रीजिंग, और मुखर सिलवटों के क्रायोसेक्शनिंग के लिए प्रक्रियाओं को रेखांकित करता है। यह अध्ययन वर्णन करता है कि अनुदैर्ध्य और क्रॉस-अनुभागीय विमानों दोनों में मुखर सिलवटों को कैसे क्रायोसेक्शन किया जाए। इस प्रोटोकॉल की एक नवीनता क्रायोसेक्शनिंग के दौरान स्वरयंत्र ट्रैकिंग है जो आंतरिक स्वरयंत्र की मांसपेशियों की सटीक पहचान सुनिश्चित करती है और ऊतक हानि की संभावना को कम करती है। आंकड़े दोनों विमानों में प्रगतिशील क्रायोसेक्शनिंग को प्रदर्शित करते हैं। उन्नीस चूहे हेमी-लैरींज को क्रायोसेक्शन किया गया था और थायरॉयड उपास्थि के उद्भव से पहले खंड की उपस्थिति तक ट्रैक किया गया था जिसमें पूर्ण मुखर गुना शामिल था। पूर्ण मुखर तह दोनों विमानों में सभी जानवरों के लिए कल्पना की गई थी। थायरॉयड उपास्थि की उपस्थिति से दूरी में दोनों विमानों में पूर्ण मुखर तह की उपस्थिति में उच्च परिवर्तनशीलता थी। वजन स्वरयंत्र स्थलों की गहराई से संबंधित नहीं था, यह सुझाव देते हुए कि व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता और ऊतक की तैयारी से संबंधित अन्य कारक सेक्शनिंग के दौरान स्थलों की उपस्थिति में उच्च परिवर्तनशीलता के लिए जिम्मेदार हो सकते हैं। यह अध्ययन एक पद्धति का विवरण देता है और हिस्टोकेमिकल न्यूरोमस्कुलर जांच के लिए चूहे के मुखर गुना को तैयार करने के लिए रूपात्मक डेटा प्रस्तुत करता है। उच्च व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता के कारण, क्रायोसेक्शनिंग के दौरान स्वरयंत्र स्थलों को बारीकी से ट्रैक किया जाना चाहिए ताकि ओवरसेक्शनिंग ऊतक और ऊतक हानि को रोका जा सके। एक सुसंगत पद्धति का उपयोग, जिसमें पर्याप्त ऊतक तैयारी और चूहे के स्वरयंत्र के भीतर स्थलों की जागरूकता शामिल है, अध्ययनों में लगातार परिणामों के साथ सहायता करेगा और स्वरयंत्र न्यूरोमस्कुलर तंत्र की जांच करने के लिए एक मॉडल के रूप में चूहे के मुखर गुना का उपयोग करने में रुचि रखने वाले नए शोधकर्ताओं की सहायता करेगा।
Introduction
चूहा स्वरयंत्र एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल है जो विकास, उम्र बढ़ने, बीमारी और औषधीय एजेंटों के लिए संरचनात्मक और कार्यात्मक न्यूरोमस्कुलर स्वरयंत्र अनुकूलन की जांच करने के लिए है1,2,3,4,5। हिस्टोलॉजिकल विधियों की स्थिरता काम की इस पंक्ति के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि मांसपेशियों की तैयारी और विश्लेषण में कई पेचीदगियां शामिल हैं, साथ ही साथ स्वरयंत्र के उपास्थि के भीतर encapsulated मांसपेशियों के स्वरयंत्र आकार, आकार और स्थलाकृति से जुड़ी चुनौतियां हैं1,6,7,8,9,10,11 . चूहे के आंतरिक स्वरयंत्र की मांसपेशियों के छोटे आकार के कारण, व्यवस्थित एम्बेडिंग, ठंड, और क्रायोसेक्शनिंग सुसंगत और सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। उदाहरण के लिए, कोरोनल विमान में चूहे के मुखर गुना को विभाजित करते समय, आंतरिक स्वरयंत्र मांसपेशियों में से चार के न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) ऊतक गहराई के 1.8 मिमी से कम के भीतर स्थित होते हैं। इसलिए, क्रायोसेक्शनिंग के दौरान स्वरयंत्र मांसपेशी शरीर रचना विज्ञान की सटीक निगरानी ब्याज के अनुभाग (ओं) की सटीक पहचान करने और ऊतक के ओवरसेक्शनिंग को रोकने के लिए आवश्यक है। लक्ष्य मांसपेशी के oversectioning संख्या और NMJs11 की स्थलाकृति की गलत पहचान में परिणाम कर सकते हैं या नमूना आकार में समग्र कटौती में परिणाम कर सकते हैं यदि लक्ष्य मांसपेशी मील का पत्थर अभिविन्यास confusion12 के कारण छोड़ दिया जाता है. जैसा कि स्वरयंत्र की मांसपेशियों के अध्ययन के लिए उपन्यास मॉडल और उनके संबंधित अनुकूलन विकसित किए जाते हैं, मानक संचालन प्रक्रियाएं यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं कि परिणाम अध्ययनों में सटीक, विश्वसनीय और पुनरुत्पादक हैं।
इस लेख का उद्देश्य इष्टतम अनुदैर्ध्य और क्रॉस-अनुभागीय विश्लेषण के लिए चूहे मुखर गुना की तैयारी का विस्तार करना है। हमारी प्रयोगशाला में नियमित रूप से उपयोग किए जाने वाले विस्तृत तरीकों को क्रायोसेक्शनिंग के दौरान लक्षित मांसपेशियों के स्थलों की पहचान करने के लिए वर्णित किया गया है। यद्यपि कई प्रयोगशालाओं में इसी तरह के तरीकों का उपयोग किया जाता है, लेकिन नौसिखिए जांचकर्ताओं द्वारा लागू किए जाने पर विश्वसनीय और सटीक प्रतिकृति सुनिश्चित करने के लिए साहित्य की तुलना में यहां अधिक विस्तार प्रदान किया जाता है। इस ट्यूटोरियल का लक्ष्य प्रयोगशालाओं और जांच में स्थिरता में सुधार करने के लिए चूहे मुखर गुना के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) मूल्यांकन के लिए एक मानक पद्धति प्रदान करना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
न्यूरोमस्कुलर विश्लेषण के लिए चूहे मुखर सिलवटों की तैयारी विभिन्न चुनौतियों के साथ पेश कर सकते हैं। न केवल स्वरयंत्र की मांसपेशियां छोटी होती हैं और उपास्थि से घिरी होती हैं, जिससे सीधे लक्ष्य मांसप?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को अनुदान F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) और K23DC014517 (जॉनसन, पीआई) द्वारा समर्थित किया गया था राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के बहरापन और अन्य संचार विकारों पर राष्ट्रीय संस्थान से।
Materials
| 2-Methylbutane Certified | Fisher Chemical | 35514 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Cryostat blades | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Disposable Base Molds 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Disposable Underpads | Medline | 23-666-062 | |
| Dissection kit | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS – Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ice Bucket | Bel-Art | 11999054 | |
| Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Needle holders | Assi | ASSI.B148 | |
| Non-Woven Sponges, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
| Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Pap pen | |||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | Fisherbrand | 5408129 | |
| Specimen Storage Bags | Fisherbrand | 19240093 | |
| Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Task wiper | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas Pattern Scissors | Assi | ASSI.SAS15RV | |
| NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods. | |||
References
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