Preparazione della piega vocale del ratto per le analisi neuromuscolari
Summary
Questo protocollo descrive i metodi utilizzati per preparare le corde vocali dei ratti per lo studio neuromuscolare istochimico.
Abstract
Lo scopo di questo tutorial è descrivere la preparazione della piega vocale del ratto per lo studio neuromuscolare istochimico. Questo protocollo delinea le procedure per la dissezione laringea del ratto, il congelamento flash e la criosezione delle corde vocali. Questo studio descrive come criosezionare le corde vocali sia sul piano longitudinale che su quello della sezione trasversale. Una novità di questo protocollo è il tracciamento laringeo durante la criosezione che garantisce un’accurata identificazione dei muscoli laringei intrinseci e riduce la possibilità di perdita di tessuto. Le cifre dimostrano la criosezione progressiva in entrambi i piani. Ventinove emi-laringi di ratto sono state criosezionate e tracciate dall’emergere della cartilagine tiroidea alla comparsa della prima sezione che includeva l’intera piega vocale. La piega vocale completa è stata visualizzata per tutti gli animali in entrambi i piani. C’era un’alta variabilità nella distanza dalla comparsa della cartilagine tiroidea alla comparsa della piega vocale completa in entrambi i piani. Il peso non era correlato alla profondità dei punti di riferimento laringei, suggerendo che la variabilità individuale e altri fattori legati alla preparazione dei tessuti possono essere responsabili dell’elevata variabilità nell’aspetto dei punti di riferimento durante il sezionamento. Questo studio descrive in dettaglio una metodologia e presenta dati morfologici per la preparazione della piega vocale del ratto per l’indagine neuromuscolare istochimica. A causa dell’elevata variabilità individuale, i punti di riferimento laringei devono essere monitorati attentamente durante la criosezione per prevenire la sovraselezione di tessuti e perdite di tessuto. L’uso di una metodologia coerente, compresa un’adeguata preparazione dei tessuti e la consapevolezza dei punti di riferimento all’interno della laringe del ratto, aiuterà con risultati coerenti in tutti gli studi e aiuterà i nuovi ricercatori interessati a utilizzare la piega vocale del ratto come modello per studiare i meccanismi neuromuscolari laringei.
Introduction
La laringe di ratto è un modello consolidato per studiare gli adattamenti laringei neuromuscolari strutturali e funzionali allo sviluppo, all’invecchiamento, alla malattia e agli agenti farmacologici1,2,3,4,5. La coerenza dei metodi istologici è fondamentale per questa linea di lavoro, in quanto vi sono molteplici complessità coinvolte nella preparazione e nell’analisi muscolare, nonché sfide associate alle dimensioni laringee, alla forma e alla topografia dei muscoli incapsulati all’interno delle cartilagini laringee1,6,7,8,9,10,11 . A causa delle piccole dimensioni dei muscoli laringei intrinseci del ratto, l’incorporamento sistematico, il congelamento e la criosezione sono fondamentali per ottenere risultati coerenti e accurati. Ad esempio, quando si seziona la piega vocale del ratto nel piano coronale, le giunzioni neuromuscolari (NMJ) di quattro dei muscoli laringei intrinseci si trovano a meno di 1,8 mm di profondità del tessuto11. Pertanto, il monitoraggio preciso dell’anatomia del muscolo laringeo durante la criosezione è indispensabile per identificare con precisione le sezioni di interesse e prevenire la sovraselezione del tessuto. La sovraselezione del muscolo bersaglio può comportare un’identificazione imprecisa del numero e della topografia di NMJs11 o può comportare riduzioni complessive delle dimensioni del campione se il muscolo bersaglio viene scartato a causa della confusione dell’orientamento del punto di riferimento12. Man mano che vengono sviluppati nuovi modelli per lo studio del muscolo laringeo e dei rispettivi adattamenti, le procedure operative standard sono essenziali per garantire che i risultati siano precisi, affidabili e riproducibili tra gli studi.
L’obiettivo di questo articolo è quello di dettagliare la preparazione della piega vocale del ratto per un’analisi longitudinale e trasversale ottimale. Vengono descritti metodi dettagliati utilizzati regolarmente nel nostro laboratorio per identificare i punti di riferimento muscolari target durante la criosezione. Sebbene metodi simili siano utilizzati in diversi laboratori, qui vengono forniti maggiori dettagli rispetto alla letteratura per garantire una replica affidabile e accurata quando implementata da sperimentatori alle prime armi. L’obiettivo di questo tutorial è quello di fornire una metodologia standard per la valutazione immunoistochimica (IHC) della piega vocale del ratto per migliorare la coerenza tra laboratori e indagini.
Protocol
Representative Results
Discussion
La preparazione delle corde vocali dei ratti per l’analisi neuromuscolare può presentare varie sfide. Non solo i muscoli laringei sono piccoli e circondati da cartilagine, rendendo così difficile estrarre direttamente il muscolo bersaglio, ma è stata trovata anche un’elevata variabilità tra gli animali nella profondità dei punti di riferimento anatomici laringei. Per il muscolo il protocollo del piano della sezione trasversale, le sezioni complete della piega vocale sono apparse tra 21-85 sezioni (10 μm per sezione…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata dalle sovvenzioni F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) e K23DC014517 (Johnson, PI) del National Institute on Deafness and other Communication Disorders del National Institutes of Health.
Materials
| 2-Methylbutane Certified | Fisher Chemical | 35514 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Cryostat blades | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Disposable Base Molds 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Disposable Underpads | Medline | 23-666-062 | |
| Dissection kit | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS – Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ice Bucket | Bel-Art | 11999054 | |
| Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Needle holders | Assi | ASSI.B148 | |
| Non-Woven Sponges, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
| Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Pap pen | |||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | Fisherbrand | 5408129 | |
| Specimen Storage Bags | Fisherbrand | 19240093 | |
| Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Task wiper | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas Pattern Scissors | Assi | ASSI.SAS15RV | |
| NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods. | |||
References
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