قياس امتصاص الجلوكوز المحفز بالأنسولين والانكماش في العضلات الهيكلية الناضجة المعزولة والمحتضنة من الفئران
Summary
التنظيم السليم لامتصاص الجلوكوز في العضلات مهم للحفاظ على توازن الجلوكوز في الجسم كله. يقدم هذا البروتوكول تقييما لامتصاص الجلوكوز المحفز بالأنسولين والانكماش في العضلات الهيكلية الناضجة المعزولة والمحتضنة عند تحديد تأثير التدخلات الفسيولوجية المختلفة على استقلاب الجلوكوز في الجسم كله.
Abstract
العضلات الهيكلية هي نسيج مستجيب للأنسولين وعادة ما تستهلك معظم الجلوكوز الذي يدخل الدم بعد الوجبة. علاوة على ذلك ، فقد أفيد أن العضلات الهيكلية قد تزيد من استخراج الجلوكوز من الدم بنسبة تصل إلى 50 ضعفا أثناء التمرين مقارنة بظروف الراحة. تعتمد الزيادة في امتصاص الجلوكوز في العضلات أثناء التمرين وتحفيز الأنسولين على نقل ناقل الجلوكوز 4 (GLUT4) من المقصورات داخل الخلايا إلى غشاء سطح الخلية العضلية ، وكذلك فسفرة الجلوكوز إلى الجلوكوز 6-فوسفات بواسطة هيكسوكيناز II. عزل وحضانة عضلات الفئران مثل m. soleus و m . extensor digitorum longus (EDL) هو نموذج مناسب خارج الجسم الحي لدراسة آثار الأنسولين والانكماش الناجم عن الكهرباء (نموذج للممارسة) على امتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية الناضجة. وبالتالي ، فإن نموذج خارج الجسم الحي يسمح بتقييم حساسية الأنسولين العضلية ويجعل من الممكن مطابقة إنتاج قوة العضلات أثناء الانقباض مما يضمن التوظيف الموحد لألياف العضلات أثناء قياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات. علاوة على ذلك ، فإن النموذج الموصوف مناسب لاختبار المركبات الدوائية التي قد يكون لها تأثير على حساسية الأنسولين في العضلات أو قد تكون مفيدة عند محاولة تحديد التعقيد التنظيمي لامتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية.
هنا نصف ونقدم بروتوكولا مفصلا حول كيفية قياس امتصاص الجلوكوز المحفز بالأنسولين والانكماش في المستحضرات المعزولة والمحتضنة للعضلات EDL من الفئران باستخدام الملصقات الإشعاعية [3H] 2-deoxy-D-glucose و [14C] مانيتول كعلامة خارج الخلية. هذا يسمح بإجراء تقييم دقيق لامتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية الناضجة في غياب العوامل المربكة التي قد تتداخل مع النموذج الحيواني السليم. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم معلومات حول الجدوى الأيضية للعضلات الهيكلية للفئران المحتضنة مما يشير إلى أن الطريقة المطبقة تمتلك بعض المحاذير في ظل ظروف معينة عند دراسة استقلاب طاقة العضلات.
Introduction
تمتلك العضلات الهيكلية القدرة على استخراج كميات كبيرة من الجلوكوز من الفضاء خارج الخلية استجابة للأنسولين وممارسة الرياضة. هذا يساعد على الحفاظ على توازن الجلوكوز في الجسم كله ويؤمن إمدادات الجلوكوز خلال أوقات ارتفاع الطلب على الطاقة. نظرا لأن التنظيم السليم لامتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية قد ثبت أنه مهم للصحة العامة والأداء البدني 1,2 ، فقد حظيت قياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات خلال ظروف مختلفة بالكثير من الاهتمام. في البشر والحيوانات ، تم استخدام المشبك مفرط الأنسولين وسكر الدم كتقنية قياسية ذهبية لتقييم حساسية الأنسولين في الجسم الحي 3,4. على النقيض من النتائج التي تم الحصول عليها من اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم ، فإن تقنية المشبك المفرط في الأنسولين وسكر الدم لا تتطلب وظيفة الجهاز الهضمي سليمة أو إفراز الأنسولين من البنكرياس ، وبالتالي تسمح بمقارنة استجابات الأنسولين بين الأشخاص الذين يظهرون اختلافات في وظيفة المعدة والأمعاء و / أو البنكرياس. تم إجراء قياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات في الجسم الحي أثناء التمرين في البشر بشكل متكرر منذ 1960s5. أولا باستخدام تقنيات التوازن الشرياني الوريدي6 وبعد ذلك باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) بالاشتراك مع البوزيترون الذي ينبعث منه الجلوكوز التناظري على سبيل المثال 18F-Fluoro-deoxy-glucose7. في القوارض ، عادة ما يتم امتصاص الجلوكوز في العضلات المحفزة للتمرين في الجسم الحي عن طريق استخدام نظائرها المشعة أو المستقرة من الجلوكوز المسمى بالنظائر8،9،10.
طريقة مكملة لقياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات في الجسم الحي ، هي عزل واحتضان العضلات الصغيرة من القوارض وبالتالي قياس امتصاص الجلوكوز باستخدام نظائرها المشعة أو المستقرة من نظائر الجلوكوز11،12،13. تسمح هذه الطريقة بتحديد كمي دقيق وموثوق به لمعدلات امتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية الناضجة ويمكن إجراؤها في وجود تركيزات الأنسولين المختلفة وأثناء الانقباض الناجم عن التحفيز الكهربائي. الأهم من ذلك ، أن قياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية المعزولة والمحتضنة ذات أهمية عند التحقيق في النمط الظاهري الأيضي للعضلات للفئران التي خضعت لتدخلات مختلفة (مثل التغذية والنشاط البدني والعدوى والعلاجات). نموذج العضلات الهيكلية المعزولة هو أيضا أداة مناسبة لاختبار المركبات الدوائية التي قد تؤثر على امتصاص الجلوكوز في حد ذاته و / أو تعديل حساسية الأنسولين12,14. وبهذه الطريقة ، يمكن اختبار وتقييم فعالية المركبات المصممة لتنظيم استقلاب الجلوكوز في العضلات في بيئة عالية التحكم قبل الاختبار اللاحق في الجسم الحي في النماذج الحيوانية قبل السريرية.
في ظل بعض الظروف ، قد تشكل الجدوى الأيضية تحديا في نظام نموذج العضلات الهيكلية المعزولة والمحتضنة. في الواقع ، فإن عدم وجود نظام الدورة الدموية في العضلات المحتضنة يستلزم أن تسليم الركائز (مثل الأكسجين والمواد المغذية) يعتمد بشكل كامل على الانتشار البسيط بين ألياف العضلات والبيئة المحيطة. فيما يتعلق بذلك ، من المهم أن تكون العضلات المحتضنة صغيرة ورقيقة ، وبالتالي ، تمثل حاجزا أقل أمام انتشار الأكسجين أثناء الحضانة15. خاصة أثناء الحضانة المطولة لعدة ساعات ، قد تتطور حالات نقص الأكسجين بسبب عدم كفاية إمدادات الأكسجين مما يؤدي إلى استنفاد طاقة العضلات15. على الرغم من أنه تم الإبلاغ سابقا عن علامات مختلفة للصلاحية الأيضية في عضلات الفئران المحتضنة إلى جانب تحديد المتغيرات المهمة التي تساعد على الحفاظ على صلاحية عضلات الفئران15 ، إلا أنه لا يزال هناك ما يبرر إجراء تقييم شامل للصلاحية الأيضية في عضلات الفئران الصغيرة المحتضنة. وبالتالي ، في الوقت الحاضر ، تم استخدام محتوى الجليكوجين بشكل رئيسي كعلامة على الجدوى الأيضية في العضلات الهيكلية للفأر المحتضن16,17.
هنا نصف بروتوكولا مفصلا لقياس امتصاص الجلوكوز القاعدي والأنسولين والانكماش في النعل المعزول والمحتضن وعضلات EDL من الفئران باستخدام [3H] 2-deoxy-D-glucose و [14C] مانيتول كعلامة خارج الخلية. في هذه الدراسة ، تم قياس امتصاص الجلوكوز خلال فترة 10 دقائق ويتم تقديم الطريقة باستخدام تركيزات الأنسولين دون الحد الأقصى والحد الأقصى من الفعالية بالإضافة إلى بروتوكول انكماش واحد. ومع ذلك ، يمكن بسهولة تعديل البروتوكولات الموضحة هنا فيما يتعلق بوقت الحضانة وجرعة الأنسولين وبروتوكول التحفيز الكهربائي. علاوة على ذلك ، نقدم توصيفا شاملا لعلامات مختلفة من الجدوى الأيضية في النعل المحتضن وعضلة الفأر EDL. تشير النتائج إلى أن مكملات الجلوكوز في مخزن الحضانة العازل ضرورية للحفاظ على الجدوى الأيضية للعضلات المحتضنة لمدة 1 ساعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
التنظيم السليم لامتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية مهم للحفاظ على الصحة العامة1. وبالتالي ، فإن التحقيق في امتصاص الجلوكوز في العضلات غالبا ما يكون بمثابة قراءة أولية عند تقييم مختلف التدخلات التي تغير الصحة. هنا نصف طريقة خارج الجسم الحي لقياس امتصاص الجلوكوز في النعل المع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح من المجلس الدنماركي للبحوث المستقلة – العلوم الطبية (FSS8020-00288B) ومؤسسة نوفو نورديسك (NNF160C0023046). تم دعم هذا العمل أيضا من خلال منحة بحثية إلى راسموس كيوبستيد من الأكاديمية الدنماركية للسكري ، والتي تمولها مؤسسة نوفو نورديسك ، رقم المنحة NNF17SA0031406. يود المؤلفون أن يشكروا كارينا أولسن وبيتينا بولمغرين وإيرين بيش نيلسن (قسم التغذية والتمارين الرياضية والرياضة ، كلية العلوم ، جامعة كوبنهاغن) على مساعدتهم التقنية الماهرة.
Materials
| [14C]D-mannitol | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0127 | |
| [3H]2-deoxy-D-glucose | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ART 0103A | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375 | |
| 4-0 USP non-sterile surgical nylon suture | Harvard Apparatus | 51-7698 | |
| Streptavidin/HRP (Conjugate) | DAKO | P0397 | Used to detect ACC protein |
| Akt2 antibody | Cell Signaling | 3063 | |
| AMPKα2 antibody | Santa Cruz | SC-19131 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6505 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| CaCl2 | Merck | 1020831000 | |
| Calibration kit (force) | Danish Myo Technology A/S | 300041 | |
| Chemiluminescence | Millipore | WBLUF0500 | |
| D-Glucose | Merck | 1084180100 | |
| D-Mannitol | Sigma | M4125 | |
| Data collection program | National Instruments | LabVIEW software version 7.1 | |
| Dialysis tubing | Visking | DTV.12000.09 Size No.9 | |
| Digital imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | |
| EDTA | Sigma EDS | E9884 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Electrical Pulse Stimulator | Digitimer | D330 MultiStim System | |
| Glycerol | Sigma | G7757 | |
| HEPES | Sigma | H7637 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| Insulin | Novo Nordisk | Actrapid, 100 IE/mL | |
| KCl | Merck | 1049361000 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873025 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| MgSO4 | Merck | 1058860500 | |
| Muscle Strip Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 820MS | |
| Na-Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Na-Pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Na-Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| NaCl | Merck | 106041000 | |
| NaF | Sigma | S1504 | |
| NaHCO3 | VWR | 27778260 | |
| pACC Ser212 antibody | Cell Signaling | 3661 | |
| pAkt Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | |
| pAMPK Thr172 antibody | Cell Signaling | 2531 | |
| phenylmethylsulfonylfluoride | Sigma | P7626 | |
| Platinum electrodes | Danish Myo Technology A/S | 300145 | |
| pTBC1D4 Ser588 antibody | Cell Signaling | 8730 | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb-2910TR | |
| Scintillation fluid | Perkin Elmer | 6013329 | |
| Statistical analyses software | Systat | SigmaPlot version 14 | |
| TBC1D4 antibody | Abcam | ab189890 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Ultrapure water | Merck | Milli-Q Reference A+ System | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
References
- DeFronzo, R., Tripathy, D. Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes. Diabetes Care. 32, 157-163 (2009).
- Coyle, E. F., et al. Carbohydrate feeding during prolonged strenuous exercise can delay fatigue. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 55 (1), 230-235 (1983).
- Kim, J. K. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp to assess insulin sensitivity in vivo. Methods in Molecular Biology. 560, 221-238 (2009).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
- Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiological Reviews. 93 (3), 993-1017 (2013).
- Sanders, C. A., Levinson, G. E., Abelmann, W. H., Freinkel, N. Effect of exercise on the peripheral utilization of glucose in man. The New England Journal of Medicine. 271, 220-225 (1964).
- Barrington, S. F., Maisey, M. N. Skeletal muscle uptake of fluorine-18-FDG: effect of oral diazepam. Journal of Nuclear Medicine Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 37 (7), 1127-1129 (1996).
- Fentz, J., et al. AMPKα is critical for enhancing skeletal muscle fatty acid utilization during in vivo exercise in mice. FASEB Journal. 29 (5), 1725-1738 (2015).
- Maarbjerg, S. J., et al. Genetic impairment of AMPKalpha2 signaling does not reduce muscle glucose uptake during treadmill exercise in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 924-934 (2009).
- Stöckli, J., et al. The RabGAP TBC1D1 plays a central role in exercise-regulated glucose metabolism in skeletal muscle. Diabetes. 64 (6), 1914-1922 (2015).
- Jørgensen, S. B., et al. Knockout of the alpha2 but not alpha1 5′-AMP-activated protein kinase isoform abolishes 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranosidebut not contraction-induced glucose uptake in skeletal muscle. The Journal of Biological Chemistry. 279 (2), (2004).
- Kjøbsted, R., et al. Prior AICAR stimulation increases insulin sensitivity in mouse skeletal muscle in an AMPK-dependent manner. Diabetes. 64 (6), 2042-2055 (2015).
- Lantier, L., et al. AMPK controls exercise endurance, mitochondrial oxidative capacity, and skeletal muscle integrity. FASEB Journal. 28 (7), 3211-3224 (2014).
- Cokorinos, E. C., et al. Activation of skeletal muscle AMPK promotes glucose disposal and glucose lowering in non-human primates and mice. Cell Metabolism. 25 (5), 1147-1159 (2017).
- Bonen, A., Clark, M. G., Henriksen, E. J. Experimental approaches in muscle metabolism: hindlimb perfusion and isolated muscle incubations. The American Journal of Physiology. 266, 1-16 (1994).
- van Breda, E., Keizer, H. A., Glatz, J. F., Geurten, P. Use of the intact mouse skeletal-muscle preparation for metabolic studies. Evaluation of the model. The Biochemical Journal. 267 (1), 257-260 (1990).
- Sogaard, P., et al. Effects of fibre type and diffusion distance on mouse skeletal muscle glycogen content in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (6), 1189-1197 (2009).
- Lowry, O. H., Passonneau, J. V. Typical fluorometric procedures for metabolite assays. A Flexible System of Enzymatic Analysis. , 68-92 (1972).
- Jensen, T. E., et al. Contraction-stimulated glucose transport in muscle is controlled by AMPK and mechanical stress but not sarcoplasmatic reticulum Ca(2+) release. Molecular Metabolism. 3 (7), 742-753 (2014).
- Kristensen, J. M., Treebak, J. T., Schjerling, P., Goodyear, L., Wojtaszewski, J. F. P. Two weeks of metformin treatment induces AMPK-dependent enhancement of insulin-stimulated glucose uptake in mouse soleus muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (10), 1099-1109 (2014).
- Szekeres, F., et al. The Rab-GTPase-activating protein TBC1D1 regulates skeletal muscle glucose metabolism. AJP: Endocrinology and Metabolism. 303 (4), 524-533 (2012).
- Pehmøller, C., et al. Genetic disruption of AMPK signaling abolishes both contraction- and insulin-stimulated TBC1D1 phosphorylation and 14-3-3 binding in mouse skeletal muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297 (3), 665-675 (2009).
- Ryder, J. W., Bassel-Duby, R., Olson, E. N., Zierath, J. R. Skeletal muscle reprogramming by activation of calcineurin improves insulin action on metabolic pathways. The Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44298-44304 (2003).
- Long, Y. C., Glund, S., Garcia-Roves, P. M., Zierath, J. R. Calcineurin regulates skeletal muscle metabolism via coordinated changes in gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 282 (3), 1607-1614 (2007).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PloS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
- Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198 (2012).
- Tullson, P. C., Terjung, R. L. Adenine nucleotide metabolism in contracting skeletal muscle. Exercise and Sport Sciences Reviews. 19, 507-537 (1991).
- Wojtaszewski, J. F., Jakobsen, A. B., Ploug, T., Richter, E. A. Perfused rat hindlimb is suitable for skeletal muscle glucose transport measurements. The American Journal of Physiology. 274 (1), 184-191 (1998).
- Hansen, P. A., Gulve, E. A., Holloszy, J. O. Suitability of 2-deoxyglucose for in vitro measurement of glucose transport activity in skeletal muscle. Journal of AppliedPhysiology. 76 (2), 979-985 (1994).
- Watson-Wright, W. M., Tan, M. H., Bonen, A. Insulin binding and 2-deoxy-D-glucose uptake in fast- and slow-twitch mouse skeletal muscle at 18 and 37 degrees C. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 62 (12), 1460-1465 (1984).
- Hansen, P. A., Marshall, B. A., Chen, M., Holloszy, J. O., Mueckler, M. Transgenic overexpression of hexokinase II in skeletal muscle does not increase glucose disposal in wild-type or Glut1-overexpressing mice. The Journal of Biological Chemistry. 275 (29), (2000).
- Virkamäki, A., Rissanen, E., Hämäläinen, S., Utriainen, T., Yki-Järvinen, H. Incorporation of [3-3H]glucose and 2-[1-14C]deoxyglucose into glycogen in heart and skeletal muscle in vivo: implications for the quantitation of tissue glucose uptake. Diabetes. 46 (7), 1106-1110 (1997).
- Bhave, G., Neilson, E. G. Body fluid dynamics: back to the future. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 22 (12), 2166-2181 (2011).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Metabolism and the circadian clock converge. Physiological Reviews. 93 (1), 107-135 (2013).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Molecular Metabolism. 3 (1), 29-41 (2014).
- Basse, A. L., et al. Skeletal muscle insulin sensitivity show circadian rhythmicity which is independent of exercise training status. Frontiers in Physiology. 9, 1198 (2018).
- Segal, S. S., Faulkner, J. A. Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 248 (3), 265-270 (1985).
- Wallberg-Henriksson, H. Glucose transport into skeletal muscle. Influence of contractile activity, insulin, catecholamines and diabetes mellitus. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 564, 1-80 (1987).
- Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
- Cleland, P. J., Rattigan, S., Clark, M. G. Glucose-induced loss of exercise-mediated 3-0-methyl glucose uptake by isolated rat soleus and epitrochlearis muscles. Hormone and Metabolic Research. 22 (2), 121-122 (1990).
- Gulve, E. A., Cartee, G. D., Holloszy, J. O. Prolonged incubation of skeletal muscle in vitro: prevention of increases in glucose transport. The American Journal of Physiology. 261 (1), 154-160 (1991).
- Deshmukh, A. S., et al. Deep proteomics of mouse skeletal muscle enables quantitation of protein isoforms, metabolic pathways, and transcription factors. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 841-853 (2015).
- Rudich, A., Klip, A. Push/pull mechanisms of GLUT4 traffic in muscle cells. Acta physiologica Scandinavica. 178 (4), 297-308 (2003).
- Kjøbsted, R., et al. Enhanced muscle insulin sensitivity after contraction/exercise is mediated by AMPK. Diabetes. 66 (3), 598-612 (2017).
- Kjøbsted, R., et al. TBC1D4 is necessary for enhancing muscle insulin sensitivity in response to AICAR and contraction. Diabetes. 68 (9), 1756-1766 (2019).
