Medición de la absorción de glucosa estimulada por insulina y contracción en músculo esquelético maduro aislado e incubado de ratones
Summary
La regulación intacta de la absorción de glucosa muscular es importante para mantener la homeostasis de glucosa en todo el cuerpo. Este protocolo presenta una evaluación de la absorción de glucosa estimulada por la insulina y la contracción en el músculo esquelético maduro aislado e incubado al delinear el impacto de varias intervenciones fisiológicas en el metabolismo de la glucosa en todo el cuerpo.
Abstract
El músculo esquelético es un tejido sensible a la insulina y generalmente absorbe la mayor parte de la glucosa que ingresa a la sangre después de una comida. Además, se ha informado que el músculo esquelético puede aumentar la extracción de glucosa de la sangre hasta 50 veces durante el ejercicio en comparación con las condiciones de reposo. El aumento en la absorción de glucosa muscular durante el ejercicio y la estimulación de la insulina depende de la translocación del transportador de glucosa 4 (GLUT4) de los compartimentos intracelulares a la membrana de la superficie de la célula muscular, así como de la fosforilación de la glucosa a glucosa-6-fosfato por la hexoquinasa II. El aislamiento e incubación de músculos de ratón como m. soleus y m. extensor digitorum longus (EDL) es un modelo ex vivo apropiado para estudiar los efectos de la insulina y la contracción inducida eléctricamente (un modelo para el ejercicio) en la absorción de glucosa en el músculo esquelético maduro. Por lo tanto, el modelo ex vivo permite la evaluación de la sensibilidad a la insulina muscular y permite igualar la producción de fuerza muscular durante la contracción, asegurando un reclutamiento uniforme de las fibras musculares durante las mediciones de la absorción de glucosa muscular. Además, el modelo descrito es adecuado para pruebas farmacológicas de compuestos que pueden tener un impacto en la sensibilidad a la insulina muscular o pueden ser de ayuda cuando se trata de delinear la complejidad reguladora de la absorción de glucosa del músculo esquelético.
Aquí describimos y proporcionamos un protocolo detallado sobre cómo medir la absorción de glucosa estimulada por la insulina y la contracción en preparaciones musculares aisladas e incubadas de sóleo y EDL de ratones que utilizan [3H]2-desoxi-D-glucosa y [14C]manitol como marcador extracelular. Esto permite una evaluación precisa de la absorción de glucosa en el músculo esquelético maduro en ausencia de factores de confusión que puedan interferir en el modelo animal intacto. Además, proporcionamos información sobre la viabilidad metabólica del músculo esquelético de ratón incubado, lo que sugiere que el método aplicado posee algunas advertencias bajo ciertas condiciones al estudiar el metabolismo de la energía muscular.
Introduction
El músculo esquelético posee la capacidad de extraer grandes cantidades de glucosa del espacio extracelular en respuesta a la insulina y el ejercicio. Esto ayuda a mantener la homeostasis de glucosa en todo el cuerpo y asegura el suministro de glucosa durante los momentos de alta demanda de energía. Dado que se ha demostrado que la regulación intacta de la absorción de glucosa del músculo esquelético es importante para la salud general y el rendimiento físico 1,2, las mediciones de la absorción de glucosa muscular durante diversas afecciones han recibido mucha atención. En humanos y animales, la pinza hiperinsulinémica-euglucémica se ha utilizado como la técnica estándar de oro para evaluar la sensibilidad a la insulina in vivo 3,4. A diferencia de los hallazgos obtenidos de una prueba de tolerancia oral a la glucosa, la técnica de pinza hiperinsulinémica-euglucémica no requiere una función gastrointestinal intacta o la secreción de insulina del páncreas y, por lo tanto, permite comparar las respuestas a la insulina entre sujetos que exhiben variaciones en la función gastrointestinal y / o pancreática. Las mediciones de la absorción de glucosa muscular in vivo durante el ejercicio en humanos se han realizado con frecuencia desde la década de 19605. Primero mediante el uso de técnicas de equilibrio arteriovenoso6 y más tarde mediante el uso de imágenes de tomografía por emisión de positrones (PET) en combinación con un análogo de glucosa emisora de positrones, por ejemplo, 18F-fluoro-desoxi-glucosa7. En roedores, la absorción de glucosa muscular estimulada por el ejercicio in vivo se realiza típicamente mediante el uso de análogos de glucosa marcados con isótopos radiactivos o estables 8,9,10.
Un método complementario a las mediciones de la captación de glucosa muscular in vivo, es aislar e incubar músculos pequeños de roedores y posteriormente medir la absorción de glucosa utilizando análogos de glucosa marcados con isótopos radiactivos o estables 11,12,13. Este método permite una cuantificación precisa y confiable de las tasas de absorción de glucosa en el músculo esquelético maduro y se puede realizar en presencia de varias concentraciones de insulina y durante la contracción provocada por la estimulación eléctrica. Más importante aún, las mediciones de la absorción de glucosa en el músculo esquelético aislado e incubado son relevantes cuando se investiga el fenotipo metabólico muscular de ratones que se han sometido a diversas intervenciones (por ejemplo, nutrición, actividad física, infección, terapéutica). El modelo de músculo esquelético aislado es también una herramienta adecuada para las pruebas de compuestos farmacológicos que pueden afectar la absorción de glucosa per se y/o modificar la sensibilidad a la insulina12,14. De esta manera, la eficacia de los compuestos diseñados para regular el metabolismo de la glucosa muscular puede ser probada y evaluada en un entorno altamente controlado antes de las pruebas in vivo posteriores en modelos animales preclínicos.
Bajo algunas condiciones, la viabilidad metabólica puede plantear un desafío en el sistema modelo de músculo esquelético aislado e incubado. De hecho, la falta de un sistema circulatorio en los músculos incubados implica que la entrega de sustratos (por ejemplo, oxígeno y nutrientes) depende completamente de la difusión simple entre las fibras musculares y el entorno circundante. Con respecto a esto, es de importancia que los músculos incubados sean pequeños y delgados y, por lo tanto, representen menos barrera para la difusión de oxígeno durante la incubación15. Especialmente durante incubaciones prolongadas durante varias horas, se pueden desarrollar estados hipóxicos debido al suministro insuficiente de oxígeno que resulta en el agotamiento de la energía muscular15. Aunque varios marcadores de viabilidad metabólica en el músculo de rata incubado se han reportado previamente junto con la identificación de variables importantes que ayudan a mantener la viabilidad muscular dela rata 15, todavía se justifica una evaluación exhaustiva de la viabilidad metabólica en pequeños músculos de ratones incubados. Por lo tanto, en la actualidad, el contenido de glucógeno se ha utilizado principalmente como marcador de viabilidad metabólica en el músculo esquelético de ratón incubado16,17.
Aquí describimos un protocolo detallado para medir la absorción de glucosa basal, estimulada por la insulina y la contracción en el músculo sóleo y EDL aislado e incubado de ratones utilizando [3H]2-desoxi-D-glucosa y [14C]manitol como marcador extracelular. En el presente estudio, la absorción de glucosa se midió durante un período de 10 minutos y el método se presenta con el uso de concentraciones de insulina submáxima y máximamente efectivas, así como un protocolo de contracción único. Sin embargo, los protocolos descritos en este documento pueden modificarse fácilmente con respecto al tiempo de incubación, la dosis de insulina y el protocolo de estimulación eléctrica. Además, proporcionamos una caracterización exhaustiva de varios marcadores de viabilidad metabólica en el sóleo incubado y el músculo de ratón EDL. Los resultados indican que la suplementación con glucosa al tampón de incubación es esencial para preservar la viabilidad metabólica del músculo incubado durante 1 hora.
Protocol
Representative Results
Discussion
La regulación intacta de la absorción de glucosa en el músculo esquelético es importante para preservar la salud general1. Por lo tanto, la investigación de la absorción de glucosa muscular a menudo sirve como una lectura primaria al evaluar varias intervenciones que alteran la salud. Aquí describimos un método ex vivo para medir la absorción de glucosa en el músculo sóleo y EDL aislado e incubado de ratones en respuesta a la insulina y las contracciones inducidas eléctricamente. El m?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo Danés para la Investigación Independiente – Ciencias Médicas (FSS8020-00288B) y la Fundación Novo Nordisk (NNF160C0023046). Este trabajo también fue apoyado por una beca de investigación a Rasmus Kjøbsted de la Academia Danesa de Diabetes, que está financiada por la Fundación Novo Nordisk, número de subvención NNF17SA0031406. Los autores desean agradecer a Karina Olsen, Betina Bolmgren e Irene Bech Nielsen (Departamento de Nutrición, Ejercicio y Deportes, Facultad de Ciencias, Universidad de Copenhague) por su hábil asistencia técnica.
Materials
| [14C]D-mannitol | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0127 | |
| [3H]2-deoxy-D-glucose | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ART 0103A | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375 | |
| 4-0 USP non-sterile surgical nylon suture | Harvard Apparatus | 51-7698 | |
| Streptavidin/HRP (Conjugate) | DAKO | P0397 | Used to detect ACC protein |
| Akt2 antibody | Cell Signaling | 3063 | |
| AMPKα2 antibody | Santa Cruz | SC-19131 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6505 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| CaCl2 | Merck | 1020831000 | |
| Calibration kit (force) | Danish Myo Technology A/S | 300041 | |
| Chemiluminescence | Millipore | WBLUF0500 | |
| D-Glucose | Merck | 1084180100 | |
| D-Mannitol | Sigma | M4125 | |
| Data collection program | National Instruments | LabVIEW software version 7.1 | |
| Dialysis tubing | Visking | DTV.12000.09 Size No.9 | |
| Digital imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | |
| EDTA | Sigma EDS | E9884 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Electrical Pulse Stimulator | Digitimer | D330 MultiStim System | |
| Glycerol | Sigma | G7757 | |
| HEPES | Sigma | H7637 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| Insulin | Novo Nordisk | Actrapid, 100 IE/mL | |
| KCl | Merck | 1049361000 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873025 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| MgSO4 | Merck | 1058860500 | |
| Muscle Strip Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 820MS | |
| Na-Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Na-Pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Na-Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| NaCl | Merck | 106041000 | |
| NaF | Sigma | S1504 | |
| NaHCO3 | VWR | 27778260 | |
| pACC Ser212 antibody | Cell Signaling | 3661 | |
| pAkt Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | |
| pAMPK Thr172 antibody | Cell Signaling | 2531 | |
| phenylmethylsulfonylfluoride | Sigma | P7626 | |
| Platinum electrodes | Danish Myo Technology A/S | 300145 | |
| pTBC1D4 Ser588 antibody | Cell Signaling | 8730 | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb-2910TR | |
| Scintillation fluid | Perkin Elmer | 6013329 | |
| Statistical analyses software | Systat | SigmaPlot version 14 | |
| TBC1D4 antibody | Abcam | ab189890 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Ultrapure water | Merck | Milli-Q Reference A+ System | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
References
- DeFronzo, R., Tripathy, D. Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes. Diabetes Care. 32, 157-163 (2009).
- Coyle, E. F., et al. Carbohydrate feeding during prolonged strenuous exercise can delay fatigue. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 55 (1), 230-235 (1983).
- Kim, J. K. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp to assess insulin sensitivity in vivo. Methods in Molecular Biology. 560, 221-238 (2009).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
- Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiological Reviews. 93 (3), 993-1017 (2013).
- Sanders, C. A., Levinson, G. E., Abelmann, W. H., Freinkel, N. Effect of exercise on the peripheral utilization of glucose in man. The New England Journal of Medicine. 271, 220-225 (1964).
- Barrington, S. F., Maisey, M. N. Skeletal muscle uptake of fluorine-18-FDG: effect of oral diazepam. Journal of Nuclear Medicine Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 37 (7), 1127-1129 (1996).
- Fentz, J., et al. AMPKα is critical for enhancing skeletal muscle fatty acid utilization during in vivo exercise in mice. FASEB Journal. 29 (5), 1725-1738 (2015).
- Maarbjerg, S. J., et al. Genetic impairment of AMPKalpha2 signaling does not reduce muscle glucose uptake during treadmill exercise in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 924-934 (2009).
- Stöckli, J., et al. The RabGAP TBC1D1 plays a central role in exercise-regulated glucose metabolism in skeletal muscle. Diabetes. 64 (6), 1914-1922 (2015).
- Jørgensen, S. B., et al. Knockout of the alpha2 but not alpha1 5′-AMP-activated protein kinase isoform abolishes 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranosidebut not contraction-induced glucose uptake in skeletal muscle. The Journal of Biological Chemistry. 279 (2), (2004).
- Kjøbsted, R., et al. Prior AICAR stimulation increases insulin sensitivity in mouse skeletal muscle in an AMPK-dependent manner. Diabetes. 64 (6), 2042-2055 (2015).
- Lantier, L., et al. AMPK controls exercise endurance, mitochondrial oxidative capacity, and skeletal muscle integrity. FASEB Journal. 28 (7), 3211-3224 (2014).
- Cokorinos, E. C., et al. Activation of skeletal muscle AMPK promotes glucose disposal and glucose lowering in non-human primates and mice. Cell Metabolism. 25 (5), 1147-1159 (2017).
- Bonen, A., Clark, M. G., Henriksen, E. J. Experimental approaches in muscle metabolism: hindlimb perfusion and isolated muscle incubations. The American Journal of Physiology. 266, 1-16 (1994).
- van Breda, E., Keizer, H. A., Glatz, J. F., Geurten, P. Use of the intact mouse skeletal-muscle preparation for metabolic studies. Evaluation of the model. The Biochemical Journal. 267 (1), 257-260 (1990).
- Sogaard, P., et al. Effects of fibre type and diffusion distance on mouse skeletal muscle glycogen content in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (6), 1189-1197 (2009).
- Lowry, O. H., Passonneau, J. V. Typical fluorometric procedures for metabolite assays. A Flexible System of Enzymatic Analysis. , 68-92 (1972).
- Jensen, T. E., et al. Contraction-stimulated glucose transport in muscle is controlled by AMPK and mechanical stress but not sarcoplasmatic reticulum Ca(2+) release. Molecular Metabolism. 3 (7), 742-753 (2014).
- Kristensen, J. M., Treebak, J. T., Schjerling, P., Goodyear, L., Wojtaszewski, J. F. P. Two weeks of metformin treatment induces AMPK-dependent enhancement of insulin-stimulated glucose uptake in mouse soleus muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (10), 1099-1109 (2014).
- Szekeres, F., et al. The Rab-GTPase-activating protein TBC1D1 regulates skeletal muscle glucose metabolism. AJP: Endocrinology and Metabolism. 303 (4), 524-533 (2012).
- Pehmøller, C., et al. Genetic disruption of AMPK signaling abolishes both contraction- and insulin-stimulated TBC1D1 phosphorylation and 14-3-3 binding in mouse skeletal muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297 (3), 665-675 (2009).
- Ryder, J. W., Bassel-Duby, R., Olson, E. N., Zierath, J. R. Skeletal muscle reprogramming by activation of calcineurin improves insulin action on metabolic pathways. The Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44298-44304 (2003).
- Long, Y. C., Glund, S., Garcia-Roves, P. M., Zierath, J. R. Calcineurin regulates skeletal muscle metabolism via coordinated changes in gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 282 (3), 1607-1614 (2007).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PloS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
- Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198 (2012).
- Tullson, P. C., Terjung, R. L. Adenine nucleotide metabolism in contracting skeletal muscle. Exercise and Sport Sciences Reviews. 19, 507-537 (1991).
- Wojtaszewski, J. F., Jakobsen, A. B., Ploug, T., Richter, E. A. Perfused rat hindlimb is suitable for skeletal muscle glucose transport measurements. The American Journal of Physiology. 274 (1), 184-191 (1998).
- Hansen, P. A., Gulve, E. A., Holloszy, J. O. Suitability of 2-deoxyglucose for in vitro measurement of glucose transport activity in skeletal muscle. Journal of AppliedPhysiology. 76 (2), 979-985 (1994).
- Watson-Wright, W. M., Tan, M. H., Bonen, A. Insulin binding and 2-deoxy-D-glucose uptake in fast- and slow-twitch mouse skeletal muscle at 18 and 37 degrees C. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 62 (12), 1460-1465 (1984).
- Hansen, P. A., Marshall, B. A., Chen, M., Holloszy, J. O., Mueckler, M. Transgenic overexpression of hexokinase II in skeletal muscle does not increase glucose disposal in wild-type or Glut1-overexpressing mice. The Journal of Biological Chemistry. 275 (29), (2000).
- Virkamäki, A., Rissanen, E., Hämäläinen, S., Utriainen, T., Yki-Järvinen, H. Incorporation of [3-3H]glucose and 2-[1-14C]deoxyglucose into glycogen in heart and skeletal muscle in vivo: implications for the quantitation of tissue glucose uptake. Diabetes. 46 (7), 1106-1110 (1997).
- Bhave, G., Neilson, E. G. Body fluid dynamics: back to the future. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 22 (12), 2166-2181 (2011).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Metabolism and the circadian clock converge. Physiological Reviews. 93 (1), 107-135 (2013).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Molecular Metabolism. 3 (1), 29-41 (2014).
- Basse, A. L., et al. Skeletal muscle insulin sensitivity show circadian rhythmicity which is independent of exercise training status. Frontiers in Physiology. 9, 1198 (2018).
- Segal, S. S., Faulkner, J. A. Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 248 (3), 265-270 (1985).
- Wallberg-Henriksson, H. Glucose transport into skeletal muscle. Influence of contractile activity, insulin, catecholamines and diabetes mellitus. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 564, 1-80 (1987).
- Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
- Cleland, P. J., Rattigan, S., Clark, M. G. Glucose-induced loss of exercise-mediated 3-0-methyl glucose uptake by isolated rat soleus and epitrochlearis muscles. Hormone and Metabolic Research. 22 (2), 121-122 (1990).
- Gulve, E. A., Cartee, G. D., Holloszy, J. O. Prolonged incubation of skeletal muscle in vitro: prevention of increases in glucose transport. The American Journal of Physiology. 261 (1), 154-160 (1991).
- Deshmukh, A. S., et al. Deep proteomics of mouse skeletal muscle enables quantitation of protein isoforms, metabolic pathways, and transcription factors. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 841-853 (2015).
- Rudich, A., Klip, A. Push/pull mechanisms of GLUT4 traffic in muscle cells. Acta physiologica Scandinavica. 178 (4), 297-308 (2003).
- Kjøbsted, R., et al. Enhanced muscle insulin sensitivity after contraction/exercise is mediated by AMPK. Diabetes. 66 (3), 598-612 (2017).
- Kjøbsted, R., et al. TBC1D4 is necessary for enhancing muscle insulin sensitivity in response to AICAR and contraction. Diabetes. 68 (9), 1756-1766 (2019).
