Messung der insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten reifen Skelettmuskeln von Mäusen
Summary
Eine intakte Regulierung der Muskelglukoseaufnahme ist wichtig für die Aufrechterhaltung der Ganzkörperglukose-Homöostase. Dieses Protokoll stellt die Bewertung der insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten reifen Skelettmuskeln dar, wenn die Auswirkungen verschiedener physiologischer Interventionen auf den Glukosestoffwechsel des ganzen Körpers beschrieben werden.
Abstract
Die Skelettmuskulatur ist ein insulinansprechendes Gewebe und nimmt typischerweise den größten Teil der Glukose auf, die nach einer Mahlzeit in das Blut gelangt. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die Skelettmuskulatur die Extraktion von Glukose aus dem Blut während des Trainings im Vergleich zu Ruhebedingungen um das bis zu 50-fache erhöhen kann. Die Erhöhung der Muskelglukoseaufnahme während des Trainings und der Insulinstimulation hängt von der Translokation des Glukosetransporters 4 (GLUT4) von intrazellulären Kompartimenten zur Muskelzelloberflächenmembran sowie der Phosphorylierung von Glukose zu Glucose-6-phosphat durch Hexokinase II ab. Die Isolierung und Inkubation von Mausmuskeln wie M. soleus und M . extensor digitorum longus (EDL) ist ein geeignetes Ex-vivo-Modell, um die Auswirkungen von Insulin und elektrisch induzierter Kontraktion (ein Modell für Bewegung) auf die Glukoseaufnahme in reifen Skelettmuskeln zu untersuchen. So ermöglicht das Ex-vivo-Modell die Bewertung der Muskelinsulinsensitivität und ermöglicht es, die Muskelkraftproduktion während der Kontraktion anzupassen, um eine gleichmäßige Rekrutierung von Muskelfasern während der Messung der Muskelglukoseaufnahme zu gewährleisten. Darüber hinaus eignet sich das beschriebene Modell für pharmakologische Wirkstofftests, die sich auf die Insulinsensitivität der Muskeln auswirken oder hilfreich sein können, wenn es darum geht, die regulatorische Komplexität der Glukoseaufnahme der Skelettmuskulatur abzugrenzen.
Hier beschreiben und liefern wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten Soleus- und EDL-Muskelpräparaten von Mäusen unter Verwendung von radioaktiv markierter [3H]2-Desoxy-D-Glucose und [14C]Mannitol als extrazellulärem Marker. Dies ermöglicht eine genaue Beurteilung der Glukoseaufnahme in reifer Skelettmuskulatur in Abwesenheit von Störfaktoren, die das intakte Tiermodell stören können. Darüber hinaus liefern wir Informationen über die metabolische Lebensfähigkeit der inkubierten Mausskelettmuskulatur, was darauf hindeutet, dass die angewandte Methode unter bestimmten Bedingungen bei der Untersuchung des Muskelenergiestoffwechsels einige Vorbehalte aufweist.
Introduction
Die Skelettmuskulatur besitzt die Fähigkeit, große Mengen Glukose aus dem extrazellulären Raum als Reaktion auf Insulin und Bewegung zu extrahieren. Dies trägt zur Aufrechterhaltung der Ganzkörper-Glukosehomöostase bei und sichert die Glukoseversorgung in Zeiten hohen Energiebedarfs. Da sich eine intakte Regulation der Glukoseaufnahme der Skelettmuskulatur als wichtig für die allgemeine Gesundheit und körperliche Leistungsfähigkeiterwiesen hat 1,2, haben Messungen der Muskelglukoseaufnahme unter verschiedenen Bedingungen viel Aufmerksamkeit erhalten. Bei Menschen und Tieren wurde die hyperinsulinämisch-euglykämische Klemme als Goldstandardtechnik zur Beurteilung der Insulinsensitivität in vivo 3,4 verwendet. Im Gegensatz zu den Erkenntnissen aus einem oralen Glukosetoleranztest erfordert die hyperinsulinämisch-euglykämische Klemmtechnik keine intakte gastrointestinale Funktion oder Insulinsekretion aus der Bauchspeicheldrüse und ermöglicht somit den Vergleich der Insulinreaktionen zwischen Probanden, die Variationen in der Magen-Darm- und/oder Pankreasfunktion aufweisen. Messungen der Muskelglukoseaufnahme in vivo während des Trainings beim Menschen werden seit den 1960er Jahren häufig durchgeführt5. Zunächst durch den Einsatz von arteriovenösen Gleichgewichtstechniken6 und später durch den Einsatz der Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Bildgebung in Kombination mit einem positronenemittierenden Glukoseanalogon, z.B. 18F-Fluor-Desoxy-Glucose7. Bei Nagetieren wird die trainingsstimulierte Muskelglukoseaufnahme in vivo typischerweise durch die Verwendung von radioaktiven oder stabilen isotopenmarkierten Glukoseanaloga 8,9,10 durchgeführt.
Eine ergänzende Methode zur Messung der Muskelglukoseaufnahme in vivo besteht darin, kleine Muskeln von Nagetieren zu isolieren und zu inkubieren und anschließend die Glukoseaufnahme mit radioaktiven oder stabilen isotopenmarkierten Glukoseanaloga11,12,13 zu messen. Diese Methode ermöglicht eine genaue und zuverlässige Quantifizierung der Glukoseaufnahmeraten in reifen Skelettmuskeln und kann in Gegenwart verschiedener Insulinkonzentrationen und während der durch elektrische Stimulation ausgelösten Kontraktion durchgeführt werden. Noch wichtiger ist, dass Messungen der Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten Skelettmuskeln von Bedeutung sind, wenn der metabolische Phänotyp der Muskeln untersucht wird, die verschiedenen Interventionen unterzogen wurden (z. B. Ernährung, körperliche Aktivität, Infektion, Therapeutika). Das isolierte Skelettmuskelmodell ist auch ein geeignetes Werkzeug für pharmakologische Verbindungstests, die die Glukoseaufnahme per se beeinflussen und/oder die Insulinsensitivität modifizieren können12,14. Auf diese Weise kann die Wirksamkeit von Verbindungen zur Regulierung des Muskelglukosestoffwechsels in einem hochkontrollierten Milieu getestet und bewertet werden, bevor anschließend in vivo in präklinischen Tiermodellen getestet wird.
Unter bestimmten Bedingungen kann die metabolische Lebensfähigkeit eine Herausforderung im isolierten und inkubierten Skelettmuskelmodellsystem darstellen. In der Tat bedeutet das Fehlen eines Kreislaufsystems in den inkubierten Muskeln, dass die Zufuhr von Substraten (z. B. Sauerstoff und Nährstoffen) vollständig von einer einfachen Diffusion zwischen den Muskelfasern und der Umgebung abhängt. In diesem Zusammenhang ist es von Bedeutung, dass die inkubierten Muskeln klein und dünn sind und daher weniger eine Barriere für die Sauerstoffdiffusion während der Inkubationdarstellen 15. Insbesondere bei längerer Inkubation über mehrere Stunden können sich aufgrund unzureichender Sauerstoffversorgung hypoxische Zustände entwickeln, die zu einem Erschöpfung der Muskelenergie führen15. Obwohl verschiedene Marker der metabolischen Lebensfähigkeit in inkubierten Rattenmuskeln bereits berichtet wurden, zusammen mit der Identifizierung wichtiger Variablen, die zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Rattenmuskeln beitragen15, ist eine umfassende Bewertung der metabolischen Lebensfähigkeit in kleinen inkubierten Mausmuskeln immer noch gerechtfertigt. Daher wird der Glykogengehalt derzeit hauptsächlich als Marker für die metabolische Lebensfähigkeit in inkubierten Mausskelettmuskelnverwendet 16,17.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der basalen, insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten Soleus- und EDL-Muskeln von Mäusen unter Verwendung von radioaktiv markierter [3H]2-Desoxy-D-Glucose und [14C]Mannitol als extrazellulärem Marker. In der vorliegenden Studie wurde die Glukoseaufnahme während eines Zeitraums von 10 Minuten gemessen und die Methode wird unter Verwendung submaximaler und maximal wirksamer Insulinkonzentrationen sowie eines einzigen Kontraktionsprotokolls vorgestellt. Die hierin beschriebenen Protokolle können jedoch leicht in Bezug auf Inkubationszeit, Insulindosierung und elektrisches Stimulationsprotokoll modifiziert werden. Darüber hinaus bieten wir eine gründliche Charakterisierung verschiedener Marker der metabolischen Lebensfähigkeit in inkubiertem Soleus- und EDL-Mausmuskel. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Glukoseergänzung zum Inkubationspuffer unerlässlich ist, um die metabolische Lebensfähigkeit des für 1 Stunde inkubierten Muskels zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine intakte Regulierung der Glukoseaufnahme in der Skelettmuskulatur ist wichtig für die Erhaltung der allgemeinen Gesundheit1. Daher dient die Untersuchung der Muskelglukoseaufnahme oft als primäre Anzeige bei der Bewertung verschiedener gesundheitsverändernder Interventionen. Hier beschreiben wir eine Ex-vivo-Methode zur Messung der Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten Soleus- und EDL-Muskeln von Mäusen als Reaktion auf Insulin und elektrisch induzierte Kontraktionen. Die Methode i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Danish Council for Independent Research – Medical Sciences (FSS8020-00288B) und der Novo Nordisk Foundation (NNF160C0023046) unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch ein Forschungsstipendium an Rasmus Kjøbsted von der Danish Diabetes Academy unterstützt, das von der Novo Nordisk Foundation mit der Fördernummer NNF17SA0031406 finanziert wird. Die Autoren danken Karina Olsen, Betina Bolmgren und Irene Bech Nielsen (Department of Nutrition, Exercise and Sports, Faculty of Science, University of Copenhagen) für ihre kompetente technische Unterstützung.
Materials
| [14C]D-mannitol | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0127 | |
| [3H]2-deoxy-D-glucose | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ART 0103A | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375 | |
| 4-0 USP non-sterile surgical nylon suture | Harvard Apparatus | 51-7698 | |
| Streptavidin/HRP (Conjugate) | DAKO | P0397 | Used to detect ACC protein |
| Akt2 antibody | Cell Signaling | 3063 | |
| AMPKα2 antibody | Santa Cruz | SC-19131 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6505 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| CaCl2 | Merck | 1020831000 | |
| Calibration kit (force) | Danish Myo Technology A/S | 300041 | |
| Chemiluminescence | Millipore | WBLUF0500 | |
| D-Glucose | Merck | 1084180100 | |
| D-Mannitol | Sigma | M4125 | |
| Data collection program | National Instruments | LabVIEW software version 7.1 | |
| Dialysis tubing | Visking | DTV.12000.09 Size No.9 | |
| Digital imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | |
| EDTA | Sigma EDS | E9884 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Electrical Pulse Stimulator | Digitimer | D330 MultiStim System | |
| Glycerol | Sigma | G7757 | |
| HEPES | Sigma | H7637 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| Insulin | Novo Nordisk | Actrapid, 100 IE/mL | |
| KCl | Merck | 1049361000 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873025 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| MgSO4 | Merck | 1058860500 | |
| Muscle Strip Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 820MS | |
| Na-Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Na-Pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Na-Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| NaCl | Merck | 106041000 | |
| NaF | Sigma | S1504 | |
| NaHCO3 | VWR | 27778260 | |
| pACC Ser212 antibody | Cell Signaling | 3661 | |
| pAkt Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | |
| pAMPK Thr172 antibody | Cell Signaling | 2531 | |
| phenylmethylsulfonylfluoride | Sigma | P7626 | |
| Platinum electrodes | Danish Myo Technology A/S | 300145 | |
| pTBC1D4 Ser588 antibody | Cell Signaling | 8730 | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb-2910TR | |
| Scintillation fluid | Perkin Elmer | 6013329 | |
| Statistical analyses software | Systat | SigmaPlot version 14 | |
| TBC1D4 antibody | Abcam | ab189890 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Ultrapure water | Merck | Milli-Q Reference A+ System | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
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