Cultura das Neurosferas Derivadas dos Nichos Neurogênicos em Voles de Pradaria Adulta
Summary
Estabelecemos as condições para cultivar células progenitoras neurais da zona subventricular e do giro dento do cérebro adulto de voles de pradaria, como um estudo in vitro complementar, para analisar as diferenças sex-dependentes entre nichos neurogênicos que poderiam fazer parte de mudanças plásticas funcionais associadas aos comportamentos sociais.
Abstract
Neurosferas são agregados de células primárias que compreendem células-tronco neurais e células progenitoras. Essas estruturas 3D são uma excelente ferramenta para determinar o potencial de diferenciação e proliferação de células-tronco neurais, bem como para gerar linhas celulares do que pode ser avaliado ao longo do tempo. Além disso, as neurosferas podem criar um nicho (in vitro) que permite a modelagem do ambiente de mudança dinâmica, como diferentes fatores de crescimento, hormônios, neurotransmissores, entre outros. Microtus ochrogaster (pradaria vole) é um modelo único para compreender a base neurobiológica dos comportamentos sociosexual e da cognição social. No entanto, os mecanismos celulares envolvidos nesses comportamentos não são bem conhecidos. O protocolo visa obter células progenitoras neurais dos nichos neurogênicos do vole da pradaria adulta, que são cultivadas sob condições não aderentes, para gerar neurosferas. O tamanho e o número de neurosferas dependem da região (zona subventricular ou giro dento) e sexo do vole da pradaria. Este método é uma ferramenta notável para estudar diferenças dependentes do sexo em nichos neurogênicos in vitro e as mudanças de neuroplasticidade associadas a comportamentos sociais como a união de pares e cuidados biparentais. Além disso, poderiam ser examinadas condições cognitivas que acarretam déficits nas interações sociais (transtornos do espectro autista e esquizofrenia).
Introduction
O vole da pradaria (Microtus ochrogaster), um membro da família Cricetidae, é um pequeno mamífero cuja estratégia de vida se desenvolve como uma espécie socialmente monogâmous e altamente sociável. Tanto os machos quanto as fêmeas estabelecem um vínculo de par duradouro após o acasalamento ou longos períodos de convivência caracterizados pela partilha do ninho, pela defesa de seu território e pela exibição de cuidados biparentais para sua prole1,2,3,4. Assim, o vole pradaria é um modelo valioso para a compreensão da base neurobiológica do comportamento sociosexual e das deficiências na cognição social5.
Neurogênese adulta é um dos processos mais primordiais da plasticidade neural que leva a mudanças comportamentais. Por exemplo, nosso grupo de pesquisa relatou em voles masculinos que a coabitação social com o acasalamento aumentou a proliferação celular na zona subventricular (VZ) e na zona subgranular no giro dentado (DG) do hipocampo, sugerindo que a neurogênese adulta pode desempenhar um papel na formação de laços induzidos pelo acasalamento em voles de pradaria (dados inéditos). Por outro lado, embora as regiões cerebrais onde novos neurônios são gerados e integrados sejam bem conhecidas, os mecanismos moleculares e celulares envolvidos nesses processos permanecem indeterminados devido a desvantagens técnicas em todo o modelo cerebral6. Por exemplo, as vias de sinalização que controlam a expressão genética e outras atividades celulares têm um período de ativação relativamente curto (detecção de fosfoproteome)7. Um modelo alternativo são células-tronco neurais adultas isoladas e cultivadas ou células progenitoras para elucidar componentes moleculares envolvidos na neurogênese adulta.
A primeira abordagem para manter precursores neurais in vitro do cérebro de mamíferos adultos (camundongos) foi o ensaio das neurosferas, que são agregados celulares crescendo sob condições não aderentes que preservam seu potencial multipotente para gerar neurônios, bem como astrócitos8,9,10. Durante seu desenvolvimento, há um processo seletivo onde apenas os precursores responderão a mitogênios como o Fator de Crescimento Epidérmico (EGF) e o Fator de Crescimento do Fibroblasto 2 (FGF2) para proliferar e gerar neuroesferas8,9,10.
Pelo que sabemos, nenhum protocolo é relatado na literatura para obter progenitores neurais adultos de voles pradarias. Aqui, estabelecemos as condições de cultura para isolar progenitores neuronais de nichos neurogênicos e sua manutenção in vitro através do ensaio de formação da neurosfera. Assim, os experimentos podem ser projetados para identificar os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na proliferação, migração, diferenciação e sobrevivência das células-tronco neurais e progenitores, processos que ainda são desconhecidos na pradaria. Além disso, a elucidação de diferenças in vitro nas propriedades das células derivadas do VZ e DG poderia fornecer informações sobre o papel dos nichos neurogênicos na plasticidade neural associados a mudanças no comportamento sociosexual e comportamentos cognitivos, e déficits nas interações sociais (transtorno do espectro autista e esquizofrenia), que também poderiam ser dependentes do sexo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um estágio para obter uma cultura de células-tronco neurais é o período de digestão com a solução enzimática, que não deve exceder mais de 30 minutos porque pode diminuir a viabilidade celular. As neurosferas devem surgir entre 8 e 10 dias após a cultura inicial; se eles não emergirem até o dia 12, descartem a cultura e repitam o experimento, reduzindo o período de digestão. Outra questão são os vasos sanguíneos que cobrem o tecido cerebral. Eles devem ser completamente removidos durante a dissecção po…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelas bolsas CONACYT 252756 e 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT EM 202818 e IN203518; INPER 2018-1-163, e NIH P51OD11132. Agradecemos a Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris e Susana Castro por sua excelente assistência técnica.
Materials
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
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