Cultura de las Neuroesferas Derivadas de los Nichos Neurogénicos en Voles de La Pradera Adulta
Summary
Establecimos las condiciones para cultivar células progenitoras neuronales de la zona subventricular y dennato gyrus del cerebro adulto de las praderas voles, como un estudio in vitro complementario, para analizar las diferencias dependientes del sexo entre nichos neurogénicos que podrían ser parte de los cambios plásticos funcionales asociados con los comportamientos sociales.
Abstract
Las neuroesferas son agregados de células primarias que comprenden células madre neurales y células progenitoras. Estas estructuras 3D son una excelente herramienta para determinar el potencial de diferenciación y proliferación de las células madre neurales, así como para generar líneas celulares que se pueden probar con el tiempo. Además, las neuroesferas pueden crear un nicho (in vitro) que permite el modelado del entorno de cambio dinámico, como factores de crecimiento variables, hormonas, neurotransmisores, entre otros. Microtus ochrogaster (prairie vole) es un modelo único para entender la base neurobiológica de los comportamientos socio-sexuales y la cognición social. Sin embargo, los mecanismos celulares involucrados en estos comportamientos no son bien conocidos. El protocolo tiene como objetivo obtener células progenitoras neuronales de los nichos neurogénicos de la pradera adulta vole, que se cultivan en condiciones no adherentes, para generar neuroesferas. El tamaño y el número de neuroesferas dependen de la región (zona subventricular o giro dentado) y el sexo de la pradera vole. Este método es una herramienta notable para estudiar las diferencias dependientes del sexo en nichos neurogénicos in vitro y los cambios de neuroplasticidad asociados con comportamientos sociales como la unión de pares y la atención biparental. Además, se podrían examinar las condiciones cognitivas que entrañan déficits en las interacciones sociales (trastornos del espectro autista y esquizofrenia).
Introduction
La pradera vole(Microtus ochrogaster), miembro de la familia Cricetidae, es un pequeño mamífero cuya estrategia de vida se desarrolla como una especie socialmente monógama y altamente sociable. Tanto los machos como las hembras establecen un vínculo de pareja duradero después del apareamiento o largos períodos de convivencia caracterizados por compartir el nido, defender su territorio, y mostrar cuidado biparental para su progenie1,2,3,4. Por lo tanto, la pradera vole es un modelo valioso para entender la base neurobiológica de la conducta socio-sexual y las deficiencias en la cognición social5.
La neurogénesis adulta es uno de los procesos más importantes de plasticidad neuronal que conduce a cambios de comportamiento. Por ejemplo, nuestro grupo de investigación informó en voles masculinos que la cohabitación social con el apareamiento aumentó la proliferación celular en la zona subventricular (VZ) y la zona subgranular en el giro dentado (DG) del hipocampo, lo que sugiere que la neurogénesis adulta puede desempeñar un papel en la formación de la unión de pareja inducida por el apareamiento en voles de praderas (datos inéditos). Por otro lado, aunque las regiones cerebrales donde se generan e integran nuevas neuronas son bien conocidas, los mecanismos moleculares y celulares implicados en estos procesos permanecen indeterminados debido a inconvenientes técnicos en todo el modelo cerebral6. Por ejemplo, las vías de señalización que controlan la expresión génica y otras actividades celulares tienen un período de activación relativamente corto (detección de fosfoproteoma)7. Un modelo alternativo son las células madre neurales adultas aisladas y cultivadas o las células progenitoras para dilucidar los componentes moleculares implicados en la neurogénesis adulta.
El primer enfoque para mantener precursores neuronales in vitro del cerebro de mamíferos adultos (ratón) fue el ensayo de neuroesferas, que son agregados celulares que crecen en condiciones no adherentes que preservan su potencial multipotente para generar neuronas, así como astrocitos8,9,10. Durante su desarrollo, existe un proceso de selección donde sólo los precursores responderán a mitógenos como el Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) y el Factor de Crecimiento fibroblasto 2 (FGF2) para proliferar y generar neuroesferas8,9,10.
Hasta nuestro conocimiento, no se informa de ningún protocolo en la literatura para obtener progenitores neuronales adultos de los voles de las praderas. Aquí, establecimos las condiciones de cultivo para aislar a los progenitores neuronales de nichos neurogénicos y su mantenimiento in vitro a través del ensayo de formación de neurosfera. Por lo tanto, los experimentos pueden ser diseñados para identificar los mecanismos moleculares y celulares involucrados en la proliferación, migración, diferenciación y supervivencia de las células madre neurales y progenitores, procesos que todavía se desconocen en la pradera vole. Además, el esclarecer las diferencias in vitro en las propiedades de las células derivadas de la VZ y la DG podría proporcionar información sobre el papel de los nichos neurogénicos en la plasticidad neuronal asociados con los cambios en el comportamiento socio-sexual y los comportamientos cognitivos, y los déficits en las interacciones sociales (trastorno del espectro autista y esquizofrenia), que también podrían ser sexualmente dependientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una etapa para obtener un cultivo de células madre neurales es el período de digestión con la solución enzimática, que no debe exceder más de 30 min porque podría disminuir la viabilidad celular. Las neuroesferas deben emerger a los 8-10 días después del cultivo inicial; si no emergen en el día 12, deseche el cultivo y repita el experimento, reduciendo el período de digestión. Otro problema son los vasos sanguíneos que cubren el tejido cerebral. Deben eliminarse por completo durante la disección porque el e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por las subvenciones CONACYT 252756 y 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 e IN203518; INPER 2018-1-163 y NIH P51OD11132. Agradecemos a Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernández, Jessica Norris y Susana Castro por su excelente asistencia técnica.
Materials
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5′ flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
