Культура нейросфер, полученных из нейрогенных ниш во взрослой прерии Voles
Summary
Мы создали условия для культуры нейронных клеток-предшественников из субвентрикулярной зоны и зубной извилины взрослого мозга прерий voles, в качестве дополнительного исследования in vitro, для анализа секс-зависимых различий между нейрогенными нишами, которые могут быть частью функциональных пластиковых изменений, связанных с социальным поведением.
Abstract
Нейросферы являются первичными клеточными агрегатами, которые состоят из нервных стволовых клеток и клеток-предшественников. Эти 3D структуры являются отличным инструментом для определения дифференциации и распространения потенциала нервных стволовых клеток, а также для создания клеточных линий, чем можно повести с течением времени. Кроме того, нейросферы могут создать нишу (in vitro), что позволяет моделирование динамических меняющихся условиях, таких как различные факторы роста, гормоны, нейротрансмиттеры, среди других. Микротус охрогастер (prairie vole) является уникальной моделью для понимания нейробиологической основы социально-сексуального поведения и социального познания. Тем не менее, клеточные механизмы, участвующие в этом поведении, не очень хорошо известны. Протокол направлен на получение нейронных клеток-предшественников из нейрогенных ниш взрослой прерии vole, которые культурироваться в условиях неприятеля, для создания нейросфер. Размер и количество нейросфер зависят от региона (субвентрикулярной зоны или зубной извилины) и пола прерии vole. Этот метод является замечательным инструментом для изучения секс-зависимых различий в нейрогенных нишах in vitro и нейропластичных изменений, связанных с социальным поведением, таким как парная связь и двухпарадный уход. Кроме того, когнитивные условия, которые влечет за собой дефицит в социальных взаимодействий (расстройства аутистического спектра и шизофрении) могут быть рассмотрены.
Introduction
Прерии vole (Microtus ochrogaster), член семьи Cricetidae, является небольшое млекопитающее, чья жизненная стратегия развивается как социально моногамный и весьма общительный вид. Как самцы, так и самки устанавливают прочную парную связь после спаривания или длительных периодов сожительства, характеризующихся разделением гнезда, защитой своей территории и проявлением двухродногоухода за потомством 1,2,3,4. Таким образом, прерии vole является ценной моделью для понимания нейробиологической основы социально-сексуального поведения и нарушений в социальном познании5.
Взрослый нейрогенез является одним из наиболее важных процессов нервной пластичности, что приводит к поведенческим изменениям. Например, наша исследовательская группа сообщила в мужских voles, что социальное сожительство с спариванием увеличение пролиферации клеток в субвентрикулярной зоне (ВЗ) и субгранулярной зоне в зубной извилине (DG) гиппокампа, предполагая, что взрослый нейрогенез может играть определенную роль в формировании парных связей, вызванных спариванием в прерии voles (неопубликованные данные). С другой стороны, хотя области мозга, где новые нейроны генерируются и интегрированы хорошо известны, молекулярные и клеточные механизмы, участвующие в этих процессах остаются неопределенными из-за технических недостатков во всеймодели мозга 6. Например, сигнальные пути, контролирующие экспрессию генов и другие клеточные виды деятельности, имеют относительно короткий период активации (обнаружение фосфопротеома)7. Одной из альтернативных моделей являются изолированные и культурные взрослые нервные стволовые клетки или клетки-предшественники для выяснения молекулярных компонентов, участвующих во взрослом нейрогенезе.
Первым подходом к поддержанию в пробирке нервных прекурсоров от взрослого млекопитающего (мыши) мозга был анализ нейросфер, которые являются клеточными агрегатами, растущими в непристремленных условиях, которые сохраняют их мультипотентный потенциал для генерации нейронов, а такжеастроцитов 8,9,10. Во время их развития, есть процесс отбора, где только предшественники будут реагировать на митогены, такие как эпидермальный фактор роста (EGF) и фактор роста фибробластов 2 (FGF2) размножаться и генерироватьнейросферы 8,9,10.
К нашим знаниям, в литературе не сообщается о протоколе получения взрослых нейронных прародителей из прерий voles. Здесь мы создали культурные условия для изоляции прогениторов нейронов от нейрогенных ниш и их поддержания в пробирке через анализ формирования нейросферы. Таким образом, эксперименты могут быть разработаны для выявления молекулярных и клеточных механизмов, участвующих в распространении, миграции, дифференциации и выживании нервных стволовых клеток и прародителей, процессов, которые до сих пор неизвестны в прерии vole. Кроме того, выяснение различий в пробирке в свойствах клеток, полученных из ВЗ и ГД, может предоставить информацию о роли нейрогенных ниш в нервной пластичности, связанных с изменениями в социально-сексуальном поведении и когнитивном поведении, а также о дефиците социальных взаимодействий (расстройство аутистического спектра и шизофрения), которые также могут быть секс-зависимыми.
Protocol
Representative Results
Discussion
Стадией получения культуры нервных стволовых клеток является период пищеварения с энзиматическим раствором, который не должен превышать более 30 минут, поскольку он может снизить жизнеспособность клеток. Нейросферы должны появиться через 8-10 дней после первоначальной культуры; если о?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами CONACYT 252756 и 253631; УНАМ-ДГАПА-ПАПИИТ В202818 и В203518; INPER 2018-1-163 и NIH P51OD11132. Мы благодарим Дейси Гаска, Карлоса Лосано, Мартин Гарсия, Алехандру Кастилью, Нидию Эрнандес, Джессику Норрис и Сюзанну Кастро за отличную техническую помощь.
Materials
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5′ flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
