Summary

Kultur der Neurosphären Abgeleitet von den neurogenen Nischen in Adult Prairie Voles

Published: June 10, 2020
doi:

Summary

Wir etablierten die Bedingungen zur Kultur neuronaler Vorläuferzellen aus der subventrikulären Zone und dentate Gyrus des erwachsenen Gehirns von Präriewühlmäusen, als ergänzende In-vitro-Studie, um die geschlechtsabhängigen Unterschiede zwischen neurogenen Nischen zu analysieren, die Teil funktioneller plastischer Veränderungen sein könnten, die mit sozialen Verhaltensweisen verbunden sind.

Abstract

Neurosphären sind primäre Zellaggregate, die neuronale Stammzellen und Vorläuferzellen umfassen. Diese 3D-Strukturen sind ein ausgezeichnetes Werkzeug, um das Differenzierungs- und Proliferationspotenzial neuronaler Stammzellen zu bestimmen und Zelllinien zu erzeugen, die im Laufe der Zeit untersucht werden können. Auch Neurosphären können eine Nische (in vitro) schaffen, die die Modellierung der dynamischen Veränderung sende Umgebung ermöglicht, wie verschiedene Wachstumsfaktoren, Hormone, Neurotransmitter, unter anderem. Microtus ochrogaster (Präriewühlmaus) ist ein einzigartiges Modell zum Verständnis der neurobiologischen Grundlagen sozio-sexueller Verhaltensweisen und sozialer Kognition. Jedoch, die zellulären Mechanismen in diesen Verhaltensweisen beteiligt sind nicht gut bekannt. Das Protokoll zielt darauf ab, neuronale Vorläuferzellen aus den neurogenen Nischen der erwachsenen Präriewühlmaus zu erhalten, die unter nicht anhaftenden Bedingungen kultiviert werden, um Neurosphären zu erzeugen. Die Größe und Anzahl der Neurosphären hängt von der Region (subventrikuläre Zone oder Dentate Gyrus) und Geschlecht der PrärieWühlmaus ab. Diese Methode ist ein bemerkenswertes Werkzeug, um geschlechtsabhängige Unterschiede in neurogenen Nischen in vitro und die Neuroplastizitätsänderungen im Zusammenhang mit sozialen Verhaltensweisen wie Paarbindung und biparentaler Pflege zu untersuchen. Auch kognitive Bedingungen, die Defizite in sozialen Interaktionen (Autismus-Spektrum-Störungen und Schizophrenie) mit sich bringen, könnten untersucht werden.

Introduction

Die Präriewühlmaus(Microtus ochrogaster), ein Mitglied der Familie der Cricetidae, ist ein kleines Säugetier, dessen Lebensstrategie sich als sozial monogame und hochgesellige Spezies entwickelt. Sowohl Männchen als auch Weibchen stellen eine dauerhafte Paarbindung nach der Paarung oder lange Zeiträume des Zusammenlebens durch die gemeinsame Nutzung des Nestes, Die Verteidigung ihres Territoriums, und die Darstellung biparentalpflegefürsorge für ihre Nachkommen1,2,3,4. Somit ist die Präriewühlmaus ein wertvolles Modell für das Verständnis der neurobiologischen Grundlagen des sozio-sexuellen Verhaltens und der Beeinträchtigungen der sozialen Wahrnehmung5.

Die adulte Neurogenese ist einer der wichtigsten Prozesse der neuronalen Plastizität, die zu Verhaltensänderungen führt. Zum Beispiel berichtete unsere Forschungsgruppe bei männlichen Wühlmäusen, dass das soziale Zusammenleben mit der Paarung die Zellproliferation in der subventrikulären Zone (VZ) und der subgranularen Zone im Dentate Gyrus (DG) des Hippocampus erhöht, was darauf hindeutet, dass die adulte Neurogenese eine Rolle bei der Bildung von Paarbindung spielen kann, die durch Paarung in Präriewühlmäusen induziert wird (unveröffentlichte Daten). Auf der anderen Seite sind zwar die Hirnregionen, in denen neue Neuronen erzeugt und integriert werden, bekannt, aber die molekularen und zellulären Mechanismen, die an diesen Prozessen beteiligt sind, bleiben aufgrund technischer Nachteile im gesamten Gehirnmodell6unbestimmt. Zum Beispiel haben die Signalwege, die die Genexpression steuern, und andere zelluläre Aktivitäten eine relativ kurze Aktivierungszeit (Nachweis von Phosphoproteome)7. Ein alternatives Modell sind isolierte und kultivierte adulte neuronale Stammzellen oder Vorläuferzellen, um molekulare Komponenten aufzuklären, die an der adulten Neurogenese beteiligt sind.

Der erste Ansatz zur Aufrechterhaltung von in vitro neuronalen Vorläufern aus erwachsenen Säugetieren (Maus) Gehirn war der Assay von Neurosphären, die zelluläre Aggregate sind, die unter nicht-anhaftenden Bedingungen wachsen, die ihr multipotentes Potenzial zur Erzeugung von Neuronen, sowie Astrozyten8,9,10bewahren. Während ihrer Entwicklung gibt es ein Auswahlverfahren, bei dem nur die Vorläufer auf Mitogene wie epidermal growth Factor (EGF) und Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) reagieren, um sich zu vermehren und Neurosphären8,9,10zu erzeugen.

Nach unserem Wissen wird in der Literatur kein Protokoll berichtet, um erwachsene neuronale Vorfahren aus Präriewühlmäusen zu erhalten. Hier haben wir die Kulturbedingungen geschaffen, um neuronale Vorläufer aus neurogenen Nischen und deren In-vitro-Pflege durch den Neurosphärenbildungstest zu isolieren. So können Experimente entwickelt werden, um die molekularen und zellulären Mechanismen zu identifizieren, die an der Proliferation, Migration, Differenzierung und überleben der neuronalen Stammzellen und Vorläufer beteiligt sind, Prozesse, die in der Präriewühlmaus noch unbekannt sind. Darüber hinaus könnte die Aufklärung von In-vitro-Unterschieden in den Eigenschaften der Zellen, die von der VZ und der GD abgeleitet wurden, Informationen über die Rolle neurogener Nischen in der neuronalen Plastizität liefern, die mit Veränderungen des sozio-sexuellen Verhaltens und kognitiven Verhaltens verbunden sind, und Defizite in sozialen Interaktionen (Autismus-Spektrum-Störung und Schizophrenie), die auch geschlechtsabhängig sein könnten.

Protocol

Die Studie wurde von der Forschungsethikkommission des Instituto de Neurobiologa, der Universidad Nacional Auténoma de México, Mexiko und des Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163) genehmigt. Die Fortpflanzung, Pflege und humane Endpunkte der Tiere wurden nach dem offiziellen mexikanischen Standard (NOM-062-Z00-1999) auf der Grundlage der “Ley General de Salud en Materia de Investigacion para la Salud” (Allgemeines Gesundheitsgesetz für Gesundheitsforschung) der mexikanischen Gesundheitsgeheimnisaria festgel…

Representative Results

Neurosphären wurden aus neuronalen Stammzellen gebildet, die aus der VZ und DG sowohl weiblicher als auch männlicher erwachsener Präriewühlmäuse isoliert wurden. Etwa 8-10 Tage nach Beginn der Kultur sollten Zellen die Neurosphären gebildet haben. Beachten Sie, dass die Platte Schmutz in der Primärkultur enthalten kann (Abbildung 3A). In Durchgang 1 sollte die Kultur jedoch nur aus Neurosphären bestehen (Abbildung 3B). Eine h?…

Discussion

Ein Stadium, um eine neuronale Stammzellkultur zu erhalten, ist die Verdauungsphase mit der enzymatischen Lösung, die nicht mehr als 30 min überschreiten sollte, da sie die Zelllebensfähigkeit verringern könnte. Die Neurosphären sollten 8-10 Tage nach der Ursprünglichen Kultur entstehen; wenn sie nicht am 12. Tag auftauchen, entsorgen Sie die Kultur und wiederholen Sie das Experiment, wodurch die Verdauungszeit verkürzt wird. Ein weiteres Problem sind die Blutgefäße, die das Gehirngewebe bedecken. Sie sollten w?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde durch die Stipendien CONACYT 252756 und 253631 unterstützt; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 und IN203518; INPER 2018-1-163 und NIH P51OD11132. Wir danken Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martin Garcia, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris und Susana Castro für ihre ausgezeichnete technische Unterstützung.

Materials

Antibodies Antibody ID
Anti-Nestin GeneTex GTX30671 RRID:AB_625325
Anti-Doublecortin MERCK AB2253 RRID:AB_1586992
Anti-Ki67 Abcam ab66155 RRID:AB_1140752
Anti-MAP2 GeneTex GTX50810 RRID:AB_11170769
Anti-GFAP SIGMA G3893 RRID:AB_477010
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11029 RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11036 RRID:AB_10563566
Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11073 RRID:AB_2534117
Culture reagents
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific/Gibco 15240062 100X
B-27 supplement Thermo Fisher Scientific/Gibco 17504044 50X
Collagenase, Type IV Thermo Fisher Scientific/Gibco 17104019 Powder
Dispase Thermo Fisher Scientific/Gibco 17105041 Powder
DMEM/F12, HEPES Thermo Fisher Scientific/Gibco 11330032
Glucose any brand Powder, Cell Culture Grade
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific/Gibco 35050061 100X
HEPES any brand Powder, Cell Culture Grade
Mouse Laminin Corning 354232 1 mg/mL
N-2 supplement Thermo Fisher Scientific/Gibco 17502048 100X
NAHCO3 any brand Powder, Suitable for Cell Culture
Neurobasal Thermo Fisher Scientific/Gibco 21103049
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific/Gibco 10010023 1X
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma-Aldrich P3655 Powder
Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Recombinant Human FGF-basic Peprotech AF-100-18B
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific/Gibco A1110501 100 mL
Disposable material
24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates Corning/Costar 3473
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3526
40 µm Cell Strainer Corning/Falcon 352340 Blue
Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore Corning 431118 PES membrane, 45 mm diameter neck
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube any brand with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. any brand
Sterile cotton gauzes
Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL any brand
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL any brand
Sterile surgical gloves any brand
Syringe Filters, 0.22 µm pore Merk Millipore SLGPR33RB Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter
Equipment and surgical instruments
Biological safety cabinet
Dissecting Scissors
Dumont Forceps
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Micropipettes
Petri Dishes
Scalpel Blades
Stainless-steel Spatula

References

  1. Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
  2. Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
  3. Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
  4. Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).
  5. McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
  6. Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
  7. Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
  8. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  9. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
  10. Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
  11. Paxinos, G., Keith, B. J. F. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
  12. Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
  13. Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
  14. Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
  15. Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
  16. Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
  17. Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
  18. Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
  19. Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
  20. Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
  21. Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
  22. Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
  23. Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
  24. Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
  25. Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5′ flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
  26. Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).

Play Video

Cite This Article
Ávila-González, D., Young, L. J., Camacho, F., Paredes, R. G., Díaz, N. F., Portillo, W. Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles. J. Vis. Exp. (160), e61402, doi:10.3791/61402 (2020).

View Video