Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

التوصيف الكمي واللثي للأكياس الظهارية الظهارية الوظيفية والمستقطبة

Published: May 16, 2020 doi: 10.3791/61404
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1Physiopathogénèse et traitement des maladies du foie, Université Paris-Saclay, Inserm U1193, 2ESPCI Paris, Université PSL
* These authors contributed equally

Summary

تعد الأنظمة الخلوية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) نماذج ذات صلة بالتحقيق في تكوين الأعضاء. ويقترح طريقة هيدروجيل القائم على إنتاج الخراجات الصفراوية وتوصيفها. هذا البروتوكول يكشف الحواجز من توصيف 3D، مع طريقة واضحة وموثوق بها لتقييم كفاءة تكوين الكيس، والأحجام، واختبار وظائفها.

Abstract

Cholangiocytes، الخلايا الظهارية التي تصطف القنوات الصفراوية في الكبد، والإشراف على تشكيل الصفراء وتعديلها. في السنوات العشرين الماضية، في سياق أمراض الكبد، ظهرت نماذج ثلاثية الأبعاد (3D) تستند إلى cholangiocytes مثل الخراجات، الزفير، أو هياكل تشبه الأنابيب لتقليد طوبولوجيا الأنسجة لنشأة الأعضاء، والنمذجة المرض، ودراسات فحص المخدرات. وقد تم الحصول على هذه الهياكل أساسا عن طريق تضمين cholangiocytes في هيدروجيل. كان الغرض الرئيسي لدراسة التنظيم الذاتي من خلال معالجة القطبية الظهارية، والخصائص الوظيفية، والمورفولوجية. ومع ذلك، تركز دراسات قليلة جدا على كفاءة تكوين الكيس. وعندما يكون الأمر كذلك، غالباً ما يتم تحديد الكفاءة من صور طائرة واحدة. يتم إجراء التحاليل الوظيفية والتحليل الهيكلي دون تمثيل التغايرية المحتملة لتوزيع الكيسات الناشئة عن التغايرات التبليمرة الهيدروجيل والآثار الجانبية. ولذلك، لا يمكن استخدام التحليل الكمي، عند القيام به، للمقارنة من مادة إلى أخرى. وعلاوة على ذلك، فإن هذه المنهجية لا تسمح بإجراء مقارنات لإمكانات النمو ثلاثية الأبعاد لمختلف المصفوفات وأنواع الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، لا يوجد أي ذكر لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها التجريبية للخراجات المثبطة للمناعة. في هذه المقالة، ونحن نقدم طريقة موثوقة وعالمية لإظهار أن توزيع الخلايا الأولية يرتبط التوزيع الرأسي غير متجانسة من تكوين كيس. يتم اتباع خلايا تشولانجيوسيكي جزءا لا يتجزأ من هيدروجيل مع Z-مداخن تحليل على طول عمق هيدروجيل على مدى الوقت من 10 أيام. مع هذه الطريقة، يتم الحصول على حركية قوية من كفاءة تكوين الكيس والنمو. ونحن نقدم أيضا طرق لتقييم قطبية الكيس وظيفة وإفرازية. وأخيراً، يتم توفير نصائح إضافية لتحسين بروتوكولات الكبت المناعي من أجل الحد من انهيار الكيس للتصوير. ويمكن تطبيق هذا النهج على دراسات أخرى لثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد، مما يفتح إمكانيات مقارنة نظام بآخر.

Introduction

في العقود الثلاثة الماضية، تقدم مجال البحوث في المختبر نحو نظم الثقافة 3D. وقد ظهر عدد من البروتوكولات لخلايا زراعة في 3D كما spheroids أو المجاميع في وجود أو عدم وجود سقالة / مصفوفة، في قطرة، في التحريض، في الأجهزة microfluidic، أو العائمة1. وقد ثبت استخدام أساليب الثقافة 3D مزاياه على الثقافات 2-الأبعاد (2D)، لا سيما بالنسبة للخلايا الظهارية، والتي تبين أن التنظيم الذاتي في هياكل 3D، ودعا الخراجات أو acini. في هذه الحالة، تشكل الخلايا أحادية الطبقات تطويق التجويف، حيث الخلايا الحصول على النمط الظاهري الظهاري الكامل مع وظائف محددة الفسيولوجية المحسنة2.

وقد ساهمت العديد من الدراسات في تطوير أساليب لتشكيل هذه العضيات الظهارية في المصفوفات الطبيعية. وقد سمح هذا لtuapitulate في الخلية الخلية في الجسم الحي والخلايا الدقيقة البيئة التفاعلات، للحصول على إنشاء واستقرار الظاهري الظهارية3،4،5،6،7. في الآونة الأخيرة ، وعلى وجه الخصوص بهدف تطوير organoids القابلة للزراعة وفك متطلبات البيئة الدقيقة لتنظيم البرنامج الظهاري ، وقد وضعت الهيدروجيل الاصطناعية لتعزيز تشكيل aciniظهاري 8،9،10. للأسف ، هذه الدراسات تقرير عن البيانات النوعية ، أو أساليب حساب الحالية باستخدام المراجع الداخلية مثل نسبة الخراجات على غير الخراجات في طائرة 2D8،9،10. وهذا يمنع أي مقارنة بين الدراسات المختلفة من حيث الكفاءة والاستقرار، أو التوصيف المورفولوجي والفسيولوجي للعضويات الظهارية.

وقد سمح صغر حجم الخلايا الظهارية في الخرز باستخدام الأجهزة microfluidic للحصول على نتائج أكثر واقعية الكمية والمقارنة. باستخدام هذه التكنولوجيا ، تم تشكيل organoids من أنواع الخلايا المختلفة وتفاضلها على أساس مورفولوجيا بين مختلف الهياكل الخلوية 3D11،12. ومع ذلك ، فإن هذه التكنولوجيا ليست سهلة للعمل مع وتتطلب استخدام غرف نظيفة لإنتاج الأجهزة microfluidic. وقد أنشئت هذه التكنولوجيا لبعض أنواع من الهيدروجيل ولكنها تتطلب التكيف التقني لتطبيقها على الهيدروجيل الأخرى، مما يحد من تعدد استعمالاتها. لذلك، تعتمد معظم الدراسات التي تهدف إلى تطوير العضيات الظهارية على تضمين الخلايا الظهارية في الجزء الأكبر من الهيدروجيل. في هذه الطرق ، وغالبا ما يتم إهمال التغايرية العالية للجيل structuration وتوزيع الخلايا داخل الثقافة 3D كله. ولذلك، فإن معظم التحليلات تتعلق بصور 2D واحدة، والتي تمثل فقط تقريباً توزيع الكائنات الخلوية المختلفة في وحدة التخزين ثلاثية الأبعاد.

الأمراض التي تؤثر على القنوات الصفراوية، مثل cholangiocarcinoma، التنافر الصفراوي، التهاب القولون الشوكولي الأولي، من بين أمور أخرى، هي سبب رئيسي للوفيات والمراضة. باستثناء زراعة الكبد، لا توجد علاجات فعالة لهذه الحالات13. الجهود المبذولة للتحقيق في تكوين القناة الصفراوية، وأسباب المرض، والتقدم سوف تسمح لتطوير العلاجات الجديدة14.

وقد وضعت نماذج الهياكل المرارة من الخراجات، spheroids أو هياكل تشبه أنبوب باستخدام العادي أو المريض المستمدة، متمايزة، أو سلف المشتقة من خطوط الخلايا cholangiocyte15،16،17،18،19،20. وقد لخصت دراسات مختلفة قطبية cholangiocyte, التعبير عن علامات cholangiocyte, وجود أهداب, إفراز cholangiocyte والقدرة الاستيعابية, وتشكيل تجويف وعرقلة; كل منها يمثل خصائص هامة من النمط الظاهري cholangiocyte ، مورفولوجيا ، والوظيفة15،17،19. وأفادت آخرون الحفاظ على organoids الصاري المستمدة من المريض لفترات طويلة من الوقت20. في الآونة الأخيرة، قمنا بالتحقيق في دور الإشارات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية على الخراجات الصفراوية21. الأهم من ذلك، تمت دراسة التسبب في الرضّاء من الزّرّية الصفراوية في الزّوئيّات الصفراوية و الأنابيب7،22. وعلاوة على ذلك، تمت دراسة السمات الرئيسية لالتهاب الشفة الزخراب الصلاسية الأولية مثل شيخوخة cholangiocyte، إفراز السيتوكينات الموالية للالتهابات، فضلا عن تجنيد الضامة بنجاح باستخدام spheroids الصفراوية15،20. ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجة إلى نماذج كمية 3D في المختبر التي تعدل من الناحية الفسيولوجية النمط الظاهري للكولينجيويت ، وعلم وظائف الأعضاء ، والبياضة الدقيقة حيث يمكن معالجة هذه الأسئلة. وعلاوة على ذلك، ذكرت المنشورات قليلة فقط تكوين الكيس كفاءة21،23. هذه نقطة مهمة لإنشاء, لا سيما عند التحقيق في تكوين الأعضاء, سبب المرض, وارتباط الاستجابات المخدرات مع وظيفة cholangiocyte والاستقطاب. وبالإضافة إلى ذلك، مع وجود اختلافات في سقالة / مصفوفة المستخدمة من بروتوكول إلى بروتوكول، فإنه من الصعب مقارنة بين النظم. لحل هذه القضايا، نقترح طريقة كمية وموثوقة وعالمية لتوليد الخراجات الصفراوية تحاكي تشكيل التجويف، والاستقطاب cholangiocyte، ووظيفة إفرازات cholangiocyte. الأهم من ذلك، ونحن نقدم تحليلا منهجيا على طول المحور Z عبر هلام 3D عند تقييم مع مرور الوقت، كفاءة تكوين الكيس، وحجم، ومقومات البقاء، والاستقطاب، والوظائف. وعلاوة على ذلك، استخدمنا هيدروجيل طبيعي والجرذان cholangiocytes الطبيعية (NRC) ق، كمثال للبروتوكول، ولكن غيرها من الهيدروجيلات الطبيعية أو الاصطناعية، فضلا عن الخلايا الظهارية يمكن استخدامها لتشكيل هياكل الكيسي 3D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. جيل من الخراجات

ملاحظة: يمكن تنفيذ هذا البروتوكول مع أي نوع من الهيدروجيل، إذا كان الجلايشن يسمح بتضمين الخلايا.

  1. هيدروجيل طلاء
    ملاحظة: طلاء هيدروجيل السليم من الشريحة الغرفة هو خطوة حاسمة لتجنب تشكيل طبقات الخلايا 2D على الجزء السفلي من البئر، التي قد تتداخل مع التصوير الكيس اللاحقة وإضعاف حساب كفاءة تكوين كيس.
    1. لضمان تجانس محلول الجل ، اذيب الهيدروجيل عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (O / N).
    2. نصائح ماصة سابقة على الجليد أو O / N في -20 درجة مئوية وشريحة غرفة 8-جيدا في -20 درجة مئوية O / N.
    3. ضع الهيدروجيل وشريحة الحجرة ذات الـ 8 بئر على دلو ثلج مليء بالثلج.
    4. في أنبوب مخروطي 15 مل، إعداد محلول يحتوي على 40٪ هيدروجيل (V/ V) في المتوسط NRC الباردة كاملة (انظر جدول المواد)ووضع الأنبوب على الجليد.
    5. لمعطف شريحة غرفة، وذلك باستخدام نصائح ماصة الباردة، إضافة 50 ميكرولتر من حل هيدروجيل على مركز كل بئر، وتنتشر على السطح كله باستخدام تلميح ماصة، في حين عقد الشريحة غرفة على الجليد (الشكل 1A).
      ملاحظة: نشر حل هيدروجيل بالتساوي ممكن تجنب فقاعات.
    6. لتبليمرة الهيدروجيل، احتضان الشريحة الغرفة لمدة 15 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
  2. إعداد الخلية
    1. الاحماء NRC المتوسطة كاملة، الفوسفات المالحة المخزنة (PBS)، و تريبسين-اثيلينيدياميني حمض رباعية الحموضة (تريبسين-EDTA) في حمام مائي قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية.
    2. في حين أن الهيدروجيل هو البلمرة، وضمان أن تزرع NRCs إلى التقاء 70٪ في قارورة T-25 سم2 الكولاجين المغلفة21. غسل الخلايا مرة واحدة مع ما قبل ساخنة 1X برنامج تلفزيوني.
    3. احتضان NRCs مع 5 مل من قبل ساخنة 1X PBS (ل قارورة T-25 سم2) لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
      ملاحظة: هذه الخطوة، التي تقصر وقت الحضانة مع التربسين-EDTA هو دور فعال في الاحتفاظ بخصائص التنظيم الذاتي للخلايا.
    4. تجاهل برنامج تلفزيوني، إضافة 1 مل من تريبسين-EDTA، واحتضان لمدة 5-10 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
    5. تحييد مع 4 مل من ما قبل ساخنة كاملة NRC المتوسطة. جمع ونقل تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 15 مل, وتدور في 150 × ز لمدة 4 دقائق.
    6. تجاهل المتوسطة وإعادة بناء بيليه الخلية في 5 مل من المتوسطة قبل ساخنة.
    7. باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر، قم بتصفية محلول الخلية في أنبوب مخروطي 50 مل وفرز الخلايا.
      ملاحظة: تمرير الخلايا من خلال مصفاة هو خطوة حاسمة بالنسبة للنتائج الكمية لتكون قابلة للتكرار أي، للحصول على حجم مماثل تقريبا من مجاميع الخلية لتكون جزءا لا يتجزأ.
  3. تضمين تعليق الخلية في حل الهيدروجيل
    1. إعداد حل من 1600 ميكرولتر من 80٪ هيدروجيل (V / V) في متوسطة NRC كاملة باردة (أنبوب 1); إبقاء في الجليد. تخفيف 5 × 105 خلايا / مل في 1600 ميكرولتر من الباردة كاملة NRC المتوسطة (أنبوب 2) والحفاظ في الجليد.
      ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة بسرعة لتجنب البلمرة من الهيدروجيل في حين خلطه مع تعليق الخلية والحفاظ على صلاحية الخلية.
    2. لإعداد محلول بذر الخلايا من 2.5 × 105 خلايا / مل في 40٪ هيدروجيل (V / V)، مزيج أنبوب 1 والأنابيب 2. إضافة 400 μL من حل الخلية في كل بئر من شريحة غرفة الهيدروجيل المغلفة تجنب فقاعات (الشكل 1B).
    3. الحفاظ على الشريحة الغرفة في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى تغيير وسائل الإعلام.
    4. بعد 2 أيام في الثقافة، وإزالة 250 ميكرولتر من المتوسط من زاوية كل بئر، يجب الحرص على عدم الماصات من الهيدروجيل. ثم، ببطء إضافة 250 ميكرولتر من الوسط ثقافة. تغيير الوسط كل 2 أيام.
      ملاحظة: تقليل حركة الشريحة الغرفة، لا سيما أثناء بدء الكيس.

2. كمية الكيس

  1. تصوير الكيس
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذا القسم بسرعة لعدم المساس بصلاحية الخلية إذا لم يتم تجهيز المجهر بغرفة تدفئة للتحكم في CO2 ودرجة الحرارة. من أجل ضمان القياس الكمي متسقة، ممثل توزيع الكيس في حجم هيدروجيل الكامل، يتم تصوير الخراجات عن طريق المجهر على النقيض من المرحلة والتصوير التسلسلي (Z-المكدسات)، مع معلمات محددة مسبقا في جميع أنحاء نقاط زمنية مختلفة.
    1. اتخاذ Z- المكدس على طول عمق هيدروجيل لكل نقطة زمنية (الشكل 1C، D). في هذا المثال، يتم أخذ مكدسات Z في أيام 1 و 2 و 4 و 7 و 10.
      ملاحظة: تحقق من أن توزيع الخلايا الأولي موحد في الهيدروجيل لضمان إمكانية تطبيق هذه الطريقة.
      1. مع المجهر المرحلة النقيض مجهزة برنامج اقتناء صورة، حدد التكبير الهدف 10x في نافذة لوحة الأنف القطعة اليدوية(الشكل 2B (1)).
      2. قم بتشغيل المصباح الأبيض وحدد خيار التصوير في الحقل الساطع.
      3. قم بتشغيل الكاميرا عن طريق تحديد الزر"تشغيل"في القائمة الفرعية للشريط. التركيز على حقل من الخراجات وتعيين وقت التعرض(الشكل 2B (2)). فتح نافذة مجلد التقاط السيارات لحفظ تلقائي للصور ( الشكل2B (3)).
      4. فتح نافذة التقاط سلسلة Z وتحديد مع المسمار Z الطائرات العلوية والسفلى من المكدس Z (نفس إحداثيات س ص ولكن Z مختلفة فرزها). ضبط الخطوة Z اعتمادا على الهدف، ومستوى القرار واضغط على زر "تشغيل الآن" لإطلاق اقتناء(الشكل 2B (4)).
        ملاحظة: في هذا المثال، تنتشر الخراجات على سمك هيدروجيل 520 ميكرومتر. يتم الحصول على 26 صورة على طول عمق الهيدروجيل مع فاصل زمني 20 ميكرومتر Z-الخطوة. اعتمادا على الهدف، ينبغي تعديل الخطوة Z لعدم تفويت أي كيس وضمان الكشف عن الخلايا والمجاميع واحدة.
      5. خذ على الأقل 3 غير متداخلة Z- مكدسات في بئر.
        ملاحظة: هذه العينات ضرورية عندما، كما هو الحال في هذا المثال، الخراجات هي أكثر عددا في عمق الجل من على حواف بسبب عدم التجانس في البلمرة هيدروجيل.
      6. لكي يكون هناك مجموعة بيانات تمثيلية كرر الخطوة 2.1.1.5. ل3 آبار في المجموع.
        ملاحظة: التوزيع غير المتجانس للخراجات يعتمد على نوع الهيدروجيل، البلمرة، وخط الخلية. النظر في ثلاث اكوادس Z في البئر وثلاثة آبار لكل تجربة، وصورت ما لا يقل عن 200 الخراجات أكثر من تسعة Z-رصة لتوصيف تشكيل الكيس ونمو الكيس في كل نقطة زمنية.
  2. معالجة الصور
    ملاحظة: في الهيدروجيل، يمكن العثور على NRCs كخلايا مفردة أو كيسات أو مجاميع. يتم تحديد الخراجات من خلال وجود قذيفة خلية مستديرة ورقيقة مغايرة تحيط بالتجويف ، في حين أن مجاميع الخلايا تقدم شكلًا غير منتظم وليس لديك تجويف. المجاميع والخلايا المفردة لها مظهر كثيف ومتناقض (الشكل 3B (4)).
    1. افتح برنامج فيجي، افتح مكدس Z ثم انتقل إلى قائمة فيجي وانقر فوق ملف | فتح (الشكلالتكميلي 1). حدد المكدس Z لتحليل. إذا لزم الأمر، حدد"التكديس الظاهري"الخيار وانقر فوق "نعم" لفتح (الشكل 3A (1)).
    2. تكرار المكدس عبر صورة | مكررة. انقر على مربع "كومة مكررة" وانقر فوق "موافق" ( الرقمالتكميلي 2).
      ملاحظة: في هذا المثال، مكدسات Z في تنسيق ملف .nd2 مرمزة في 16 بت.
    3. إنشاء إسقاط كثافة الحد أدنى من المكدس المكرر. اذهب إلى قائمة الصور | مداخن | Z المشروع. حدد نوع الإسقاط "الحد الأدنى كثافة" وانقر فوق "موافق" (الشكل 3A (2)) (الشكل التكميلي 3).
    4. اطرح الخلفية من الإسقاط. انتقل إلى قائمة المعالجة | طرح الخلفية. نوع 500.0 بكسل من نصف قطر الكرة المتداول وانقر فوق "خلفية الضوء" لتقديم الخراجات أكثر تناقضا من الخلفية (الشكل 3A (3)) (الشكل التكميلي 4).
      ملاحظة: نصف قطر الكرة المتداولة يحدد حجم المنطقة التي يتم تشغيل الطرح الخلفية. يجب تعيين هذه المعلمة إلى حجم الكائن الأكبر لتعريف.
    5. إذا كان هناك حاجة إلى تحسين التباين، انتقل إلى قائمة الصور | ضبط | سطوع / تباين | تلقائي | تطبيق. سوف فيجي تلقائيا تحسين السطوع والتباين. في (الشكل 3A (3)، تم تعيين القيم الرمادية السفلية والعليا إلى 49702 و 65452 على التوالي (الشكل التكميلي 5).
      ملاحظة: إذا لم يتم معايرة الإسقاط، انتقل إلى قائمة تحليل | تعيين مقياس واكتب نسبة المعايرة المطابقة μm/pixel(الشكل التكميلي 6).
  3. قياس عد الكيس وحجم الكيس
    1. لقياس قطر الكيس التقريبي، حدد أداة الخط المستقيم في قائمة فيجي وارسم خطًا عبر قطر كل كيس على الإسقاط النهائي(الشكل 3B (4)). إضافة منطقة جديدة من الفائدة (ROI) التي تم إنشاؤها لكل كيس إلى مدير ROI: اضغط على "t" اختصار على لوحة المفاتيح لأسرع العد وفتح مدير العائد على الاستثمار. انقر فوق "إظهار الكل" لرؤية الخراجات التي تم عدها ( الرقمالتكميلي 7)
    2. تحقق من أنه لم يتم ترك أي كيس دون العد عن طريق فرض مجموعة ROIs من الإسقاط على المكدس Z. للقيام بذلك، انقر فوق إطار Z-المكدس لتحديده. في مدير ROI ، انقر فوق "إظهار الكل" وتحريك المؤشر على طول المكدس Z للتحقق من تلك الصورة لكل صورة ، تم حساب جميع الخراجات ( الشكلالتكميلي 8).
    3. مرة واحدة وقد تم عد الخراجات الجديدة وROIs وأضاف على الخطوة 2.3.1.، حدد مجموعة العائد على الاستثمار وحفظه عبر نافذة مدير ROI عن طريق النقر على المزيد | حفظ (الشكل التكميلي 9).
    4. حدد كل ROIs في مدير العائد على الاستثمار وانقر فوق "قياس" في مدير ROI للحصول على حجم كل كيس. هذا سيفتح نافذة جديدة من القياسات المسماة "النتائج" ترقيم كل كيس وحجمه المقدر. ثم احفظ .csv التنسيق عن طريق النقر على "نتائج" نافذة وعبر القائمة : ملف | حفظ باسم (الشكل التكميلي 10).
      ملاحظة: يمكن إنشاء ماكرو إلى مكدسات معالجة شبه تلقائيًا، وتقدير عدد الكيس/ الأحجام من الإسقاطات، وتخزين البيانات لإجراء العد الأسرع. للقيام بذلك، حدد أداة "سجل" في قائمة شريط ، عن طريق النقر على الإضافات | وحدات الماكرو | سجل.
  4. القياس الكمي لكفاءة تكوين الكيس
    1. عد عدد الخراجات في اليوم Y ، Equation 1 على إسقاط (Y = 1 ، 2 ، 4 ، 7 أو 10).
    2. لحساب كفاءة تكوين الكيس ل1000 خلية في اليوم Y، قسم عدد الخراجات التي تم عدها في ذلك الوقت على عدد الخلايا المصنفة في اليوم 0 الاستدلال من حجم هيدروجيل وضرب من قبل 1000(الشكل 3C، الشكل 4).
      Equation 2

3- قابلية الخلية للاستمرار

  1. إعداد محلول الأسهم من الفلوريسين diacetate (FDA) في 5 ملغ / مل عن طريق حل 5 ملغ من ادارة الاغذية والعقاقير في 1 مل الأسيتون وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  2. إعداد محلول مخزون من يوديد البروديم (PI) بتركيز 2 ملغ/مل في المياه الأيونية (dH2O) وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
  3. إعداد متوسط NRC دون مصل عجل الجنين (FCS).
  4. لإعداد ادارة الاغذية والعقاقير / PI حل تلطيخ، إضافة 4 ميكرولتر من ادارة الاغذية والعقاقير حل المخزون (8 ميكروغرام / مل التركيز النهائي) و 25 ميكرولتر من PI الأسهم الحل (20 ميكروغرام / مل التركيز النهائي) في 2.5 مل من NRC المتوسطة دون FCS.
  5. إزالة المتوسطة من الشريحة الغرفة، إضافة 250 ميكرولتر من حل تلطيخ في كل بئر واحتضان 4-5 دقيقة في الظلام في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. الماصات خارج حل تلطيخ بعناية وغسل مرة واحدة مع 250 ميكرولتر من 1X برنامج تلفزيوني.
  6. إضافة بعناية 250 ميكرولتر من كامل NRC المتوسطة لكل بئر، واتخاذ الصور باستخدام المجهر المقلوب الفلوريسين مع تكساس الأحمر وفلوريسين isothiocyanate (FITC) مرشحات. سوف الخلايا الحية تكون خلايا خضراء والخلايا الميتة تكون حمراء (الشكل 5A).
    ملاحظة: من أجل تحديد حجم الخلايا الحية / الميتة، خذ Z-مكدسات عبر حجم هيدروجيل التالية الخطوة 2 وتكييف طريقة معالجة الصور لفلوريسنس.

4- نشاط إفراز

ملاحظة: يتم تقييم نشاط إفراز من خلال الغشاء الغشاء الزحلي من قبل إفراز الفلوريسين في تجويف. ويمكن تقييم خصوصيتها عن طريق القيام بنفس الاختبار مع فيراباميل، وهو متعدد الأدوية المقاومة (MDR) المانعالناقل 24.

  1. لإعداد حل تلطيخ من Hoechst 33258 في 5 ميكروغرام / مل، إضافة 0.83 ميكرولتر من حل الأسهم Hoechst (15 ملغ / مل تركيز الأسهم في dH2O) في 2.5 مل من NRC المتوسطة دون FCS.
  2. إضافة 250 ميكرولتر من الحل Hoechst في كل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 15 دقيقة.
  3. إزالة الحل Hoechst وإضافة 250 ميكرولتر من ادارة الاغذية والعقاقير حل (8 ميكروغرام / مل التركيز النهائي) في كل بئر. احتضان 4-5 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
    ملاحظة: بمجرد أن تتعرض الخلايا إلى حل ادارة الاغذية والعقاقير تلطيخ، متابعة حركية إفراز الفلورسين قد تكون مفيدة لمعايرة الوقت اللازم لتفرز الخراجات. للقيام بذلك، التقاط الصور كل دقيقة لمدة 1 ساعة عن طريق التصوير الفاصل الزمني. في هذا المثال، الوقت اللازم لمراقبة الخراجات سر NRC في هيدروجيل حوالي 15-20 دقيقة.
  4. التقاط الصور باستخدام المجهر المقلوب الفلوريسين 5 دقائق بعد الشطف مع المتوسطة دون FCS. استخدام 4′, 6-diamidino-2-فينيليندول (DAPI) والمرشحات فيتف للكشف عن الملصقات النوى وتراكم الفلورسين في تجويف (الشكل 6A). لتحديد عدد الخراجات إفراز، واتخاذ Z-مكدسات كما هو الحال في الخطوة 2 وتكييف خطوات معالجة الصور إلى الصور الفلورية.
    ملاحظة: بالنسبة لاختبار فيراباميل، تسبق العملية السابقة (الخطوات 4.3. إلى 4.4.) عن طريق حضانة مع فيراباميل، وفقا للشروط التالية:
  5. إعداد محلول مخزون من 10 mM فيراباميل في ثنائيات الكبريت (DMSO). لإعداد 10 μM حل العمل، مزيج 2.5 μL من فيراباميل حل الأسهم مع 2.5 مل ثقافة المتوسطة دون FCS.
  6. لتقييم أن الفلوريس في التجويف ينتج عن إفراز MDR ، خذ شريحة أخرى وأضف 250 ميكرولتر من محلول عمل فيراباميل في كل بئر واحتضان 20 دقيقة في 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2
  7. إزالة الحل وإضافة 250 ميكرولتر من ادارة الاغذية والعقاقير حل (8 ميكروغرام / مل التركيز النهائي) في كل بئر. احتضان 4-5 دقيقة في الظلام في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. ثم، وغسل مع 250 ميكرولتر من 1X PBS، قبل التصوير(الشكل 6B، C).

5. تقييم القطبية الظهارية عن طريق الفلوروسين

  1. لإعداد حل التثبيت، مزيج 4٪ الفورمالديهايد مع 5٪ السكروز، في 1X PBS، درجة حَمَر 7.4 واحتضان في حمام مائي قبل تسخينه عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  2. لإصلاح الخلايا، الماصات بلطف خارج المتوسطة الثقافة من البئر دون إتلاف المصفوفة. إضافة ببطء 400 μL من حل التثبيت إلى جانب الآبار. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    ملاحظة: دائما ترك 25 ميكرولتر من السائل فوق المصفوفة لمنع تلفه.
  3. قم بإزالة محلول التثبيت برفق واغسل 3x بـ 400 ميكرولتر من 1x PBS في (RT).
  4. الماصات خارج برنامج تلفزيوني، إضافة 400 ميكرولتر من حل permeabilization (0.5٪ تريتون X-100 في 1x PBS) واحتضان 10 دقيقة في RT.
  5. قم بإزالة محلول permeabilization بلطف، تليها 3 غسيلات سريعة مع 400 ميكرولتر من PBS 1x وخطوة غسيل طويلة من 30 دقيقة في RT.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن تخزين الشريحة عند 4 درجة مئوية لمدة يومين. في هذه الحالة، ختم الشريحة مع فيلم البارافين لمنع التبخر وتجفيف المصفوفة.
  6. إزالة برنامج تلفزيوني، إضافة 400 ميكرولتر من محلول منع تحتوي على 0.1٪ البوم الأبقار (BSA) ومصل الماعز 10٪ في برنامج تلفزيوني 1x واحتضان لمدة 60 دقيقة في RT.
    تنبيه: تركيزات BSA أعلى من 0.1٪ سوف يؤدي إلى تراجع التجويف وانهيار الكيس مزيد من (انظر قسم النتائج التمثيلية) (الشكل 7A).
  7. الماصات خارج الحل حجب وغسل مرة واحدة مع 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني /0.05٪ توين 20 وتجاهل.
  8. أضف 150 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة، على سبيل المثال، الأجسام المضادة E-cadherin المخففة 1:400 وفالويدين 568 (16.2 nM التركيز النهائي) في 1X PBS واحتضان لمدة 90 دقيقة في RT.
    ملاحظة: هذا التخفيف من e-cadherin هو نفسه المستخدمة في بروتوكول المناعة 2D القياسية.
  9. غسل العينة مع 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني/0.05٪ توين 20، 3x؛ في كل مرة احتضان العينة لمدة 10 دقيقة في RT.
  10. أضف 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (الماعز المضاد للأرانب IgG Alexa Fluor Plus 647) ، المخفف 1:500 في PBS 1x واحتضان 60 دقيقة في RT.
  11. غسل 3x مع 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني/0.05٪ توين 20، في كل مرة احتضان العينة لمدة 10 دقيقة في RT.
  12. اغسل 3x مع 400 ميكرولتر من 1X PBS ، في كل مرة تحتضن العينة لمدة 10 دقائق في RT.
  13. تجاهل برنامج تلفزيوني من غسل الماضي وإعداد الشريحة غرفة للتصور عن طريق المجهر confocal بعد واحد من الخيارين أدناه.
    1. إضافة 400 μL من 1X PBS و 50 ميكرولتر من DAPI في البئر. ويمكن فحص العينات من خلال الجزء السفلي من البئر دون الحاجة إلى تركيب مع غطاء (الشكل 7B).
    2. أضف 100 ميكرولتر في بئر من الكاشف المضاد للتجفيف الذي يحتوي على DAPI واترك الشريحة تجفف O/N في RT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تشكيل وتوصيف الخراجات
3D نظم ثقافة الخلايا هي أداة هامة لدراسة تولد الأعضاء والمرضالنمذجة 25. للأسف، معظم هذه الطرق هي نوعية أو استخدام القياس الكمي الداخلي الذي يتم القيام به على مستوى واحد من خلال مقارنة عدد الخراجات مقابل غير الخراجات، في أحجام متغيرة وغير محددة في كثير من الأحيان، ومنع أي مقارنة من حيث كفاءة تكوين الكيس بين الدراسات المختلفة7،8،9،10،15،18،23. الطريقة المقترحة في هذا البروتوكول، من خلال تسجيل عدد كامل من الخراجات وأحجامها على مدى وقت التجربة، يسمح لتحليل تطور تكوين الكيس والنمو (الشكل 4).

بناء على صور النقيض من المرحلة، في اليوم 0، 8 ساعات بعد الخلايا البذر معظمها مجاميع خلية صغيرة وجدت جزءا لا يتجزأ من الهيدروجيل. في اليوم 1، الخراجات الصغيرة من قطر متوسط من 42.95 (26.53، 50.47) (الربع الأول والثالث) μm وانصهار الخراجات المنتشرة في جميع أنحاء هيدروجيل هي ملحوظة. في اليوم 4، من الشائع ملاحظة الهياكل الكلية وكذلك الخراجات من متوسط قطر 75 (56.48، 97.97) μm. في أيام 7 و 10 وصل متوسط قطر الكيس 108.67 (75.31، 141.76) ميكرومتر و 186.46 (113.98، 278.29) ميكرومتر، على التوالي (الشكل 4A-C). ومن المثير للاهتمام، وزيادة كفاءة تكوين الكيس من 70.03 ± 5.05 الخراجات/1000 الخلايا في اليوم 1 إلى 99،83 ± 12.81 الخراجات الخلايا/1000 في اليوم 4 تبقى ثابتة حتى اليوم 10(الشكل 4B)،مما يشير إلى أن الخراجات تشكل أساسا من مجاميع الخلية التي تكون موجودة في وقت تضمين أو أن شكل خلال 48h المقبل، من خلال ترحيل الخلايا أو اندماج مجاميع الخلايا الصغيرة. فيما يتعلق بتطور حجم الكيس ، في حين أن متوسط الحجم يتبع منحدرًا بطيءًا ومنتظمًا ، يزداد توزيع الحجم على نطاق واسع على طول وقت الثقافة ، مما يوضح أن الخراجات المختلفة لا تنمو بنفس السرعة. ومن المثير للاهتمام، وهذا يمكن ربط ملاحظتنا (لا تظهر) أن الخراجات لا توزع بالتساوي في هيدروجيل، أكبر الخراجات الكذب في وسط حجم هيدروجيل. منذ زيادة قطر الكيس يعتمد أساسا على النشاط إفراز (منذ يقتصر معدل انقسام الخلايا في الخراجات NRC مشتقة)، فإنه يمكن استنتاج أن هذا النشاط يعتمد اعتمادا كبيرا على خصائص هيدروجيل التي ليست متجانسة في حجم ثقافة الخلية.

ثم أكدنا صلاحية الخلايا بعد تضمينها في الهيدروجيل (يوم 0) والخراجات في اليوم 10 باستخدام ادارة الاغذية والعقاقير / PI تلطيخ يعيش (الشكل 5A). ادارة الاغذية والعقاقير هو جزيء غير الفلورسنت التي تعيش الخلايا فقط، من خلال رد فعلانزيمي، قادرة على تحويل إلى الفلورسين فلورسنت خضراء . PI هو جزيء غير permeant للخلايا الحية التي تتشابك في الحمض النووي للخلايا نخر27. ومن المثير للاهتمام، الخلايا الميتة التي تمثل أقل من 3٪ من الخلايا كلها في حجم الثقافة في اليوم 10، وتوجد في الغالب خارج الخراجات، وخلايا معزولة أو جزء من المجاميع الصغيرة. ومع ذلك، لاحظنا أن الحطام من الخلايا النخرية تتراكم في بعض الخراجات الكبيرة في اليوم 10(الشكل 5B). لذلك ، للحفاظ على الثقافات الكيسية ، يوصى بتمرير الخراجات قبل 10 أيام في تلك الظروف.

التقييم الوظيفي
في الظروف الفسيولوجية، وتتمثل الوظيفة الرئيسية للcholangiocytes لتعديل الصفراء القناة عبر آليات absorptive وإفرازية التي قناة MDR هو لاعب رئيسي28. لتقييم وظيفة الخراجات، ونحن احتضنت اليوم 10 الخراجات مع ادارة الاغذية والعقاقير / Hoechst ولاحظت تشكيل الفلوريسين وإفرازه من القاعدية في الفضاء الإنارة apical (الشكل 6A, B). وهكذا، مؤكدا أن NRCs في الخراجات الاحتفاظ بوظائفها إفرازية. وعلاوة على ذلك، تم تثبيط إفراز الفلورسين عن طريق المعالجة المسبقة للخراجات مع مثبط MDR فيراباميل(الشكل 6C)،مما يدل على أن تراكم ادارة الاغذية والعقاقير في التجويف كان بسبب إفراز من خلال الناقل MDR وليس عن طريق تسرب من الفضاء بين الخلايا.

تقييم قطبية الكيس
من أجل تأسيس الاستقطاب من الخراجات NRC، أجرينا سلسلة من الخطوات الأمثل في بروتوكول immunofluorescence. أحد العوائق الرئيسية في فحص قطبية الخلايا الظهارية في الخراجات هو الانهيار المتكرر للهندسة العضوية خلال عملية الفلوروس المناعي ، بسبب تسرب السائل الموجود في التجويف. للتحايل على هذه المشكلة، تم تقييم كل خطوة من بروتوكول المناعة من خلال اختبار كيف يمكن أن تؤثر الظروف المختلفة على الحفاظ على هيكل الكيس. وجدنا أن تعديل تحديد (الفورمالديهايد (2-4٪ + السكروز (5-10 ٪) أو ظروف permeabilization (0.1-1٪ من كل من تريتون X-100 وسوكروز) لم يكن لها تأثير كبير على بنية الكيس. ويمكن استخدام هذه النطاقات لإصلاح بقوة و permeabilize بلطف cholangiocytes (الشكل 7A). ومع ذلك، لاحظنا أن الحفاظ على BSA عند 0.1٪ أو أقل أثناء التشبع هو خطوة رئيسية في الحفاظ على سلامة الكيس، حيث تؤدي التركيزات الأعلى إلى تراجع الكيس وانهيار التجويف(الشكل 7A).

وظائف Cholangiocyte تعتمد على قطبية apico-basolateral المناسبة الخاصة بهم29. للتحقق من أن الخراجات NRC الذاتي تجميع في هيدروجيل والهياكل المستقطبة، وأكدنا التعريب apical والبصلة من F-actin وE-cadherin، على التوالي. E-cadherin التعبير في الخراجات لدينا يشير أيضا إلى أن NRCs الحفاظ على النمط الظاهري الظهارية في الهيدروجيل(الشكل 7B)خلال 10 أيام على الأقل.

Figure 1
الشكل 1: سير العمل التجريبي لتكوين الكيس وتوصيفه. (أ)هيدروجيل طلاء من الشريحة الغرفة. (B) دمج الخلايا في الهيدروجيل. (C) المجهرية من تكوين كيس. (D) تقييم متابعة لمدة 10 أيام لنمو الكيس، والقدرة على البقاء، والوظائف، والاستقطاب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: طريقة الحصول على الصور. (أ)سير عمل اقتناء Z-المكدس التي يتم تنفيذها على طول عمق هيدروجيل من يوم 1 إلى 10: Z-كومة اقتناء (1) معالجة الصور من Z - المكدس (2) توليد من الحد الأدنى من كثافة الإسقاط والكيس الكم (3). (ب) صور لقطات شاشة برنامج الحصول على الصور تظهر اختيار الهدف (1) ، وتعديل المعلمات (2) ، وتوفير التلقائي للصور (3) ، والمعايرة Z - المكدس (4). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: طريقة القياس الكمي لحجم الكيس وكفاءة تكوين الكيس. (A) صورة معالجة تخطيط يصور : Z - مداخن لتحليل (1) ، الحد الأدنى من الشدة Z - الإسقاط (2) ، النهائي Z - الإسقاط بعد طرح الخلفية (3) تستخدم في عد الكيس وتقدير حجم الكيس. (B) التعرف على كيس على الإسقاط (A3) مع تقريب الإسقاط (4) لإظهار التعرف على الخراجات التي تتميز بها قذيفة خلية داكنة ترفق لومن أكثر إشراقًا ، والتي تتميز بخطوط زرقاء مرسومة لقياس القطر مقابل المجاميع مع مظهر داكن وغير منتظم يشير إليه السهام الحمراء. (C) صيغة لحساب كفاءة تكوين الكيس ل1000 خلية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: كفاءة تكوين الكيس وتوزيع حجم الكيس في الهيدروجيل. (A) الفاصل الزمني يظهر صور تباين المرحلة التمثيلية في أيام 0 و 1 و 2 و 4 و 7 و 10 من الثقافات ثلاثية الأبعاد. (B) الرسم البياني مؤامرة مع الحركية من متوسط كفاءة تكوين الكيس ± SEM (n = 3). (C) مربع وخفقات مؤامرة تبين حجم توزيع الكيس خلال وقت الثقافة. وتمثل القضبان السوداء الربع الأول، ومتوسط الربع الثالث؛ الخطوط تمثل عرض التوزيع؛ النقاط السوداء تمثل الحد الأدنى والحد الأقصى للتوزيع، n = 3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: قابلية الخراجات NRC في الهيدروجيل. (أ)ممثل الفلورسنت صور حية من الثقافات في اليوم 0 واليوم 10، ملطخة ادارة الاغذية والعقاقير (الأخضر = العيش) وPI (الأحمر = الميت). لاحظ أن الفلورس الأحمر كان مرتبطاً بشكل رئيسي بالخلايا المفردة. (ب)ممثل الفلورسنت صورة حية من كيس في اليوم 10، حيث شوهدت الخلايا الميتة (باللون الأحمر) تتراكم في التجويف. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: وظائف الخراجات NRC في الهيدروجيل. (أ)ممثل الفلورسنت صور حية من كيس لمدة 10 أيام حيث تم الكشف عن طبقة الخلية عن طريق وضع العلامات النوى مع Hoechst (الأزرق) والتجويف من قبل ادارة الاغذية والعقاقير المفرزة (الأخضر). (ب) تمثيلية المرحلة التباين / الفلورسنت صور حية بعد اختبار إفراز مع ادارة الاغذية والعقاقير ، والتي تم عرضها المتراكمة في التجويف. (C) بعد المعرض لفيراباميل، مثبط MDR، تمثيلية المرحلة التباين / الصور الحية الفلورية من الخراجات التي تبين أن ادارة الاغذية والعقاقير تم الاحتفاظ بها في طبقة الخلية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: immunofluorescence من الخراجات NRC في هيدروجيل. (أ) تحسين بروتوكول الفلوروسين مع صور حقل مشرق تظهر أشكال كيس تمثيلي في كل خطوة من البروتوكول. من اليسار إلى اليمين: (الكيس الحي) كيس حي في وسط كامل قبل التثبيت، (التثبيت)كيس بعد التثبيت، (Permeabilization)كيس آخر بعد permeabilization، (التشبع)كيس بعد خطوة التشبع و (وضع العلامات)كيس في خطوة المناعة. (B)(1-2): صور كونفوكال لقسم من خلال كيس يظهر علامة السطح apical F-actin (الأحمر والبرتقالي) ، وعلامة basolateral E-cadherin (الأخضر) والنيات الملطخة بDAPI (الأزرق). (3): إعادة تشكيل ثلاثية الأبعاد لمجموعة من الخراجات مع العلامات التالية: أحمر-برتقالي لـ F-actin والأخضر لـ E-cadherin. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: فتح مكدس. لقطة للشاشة يلتقط من البرنامج الذي يصور الإجراء لفتح Z - المكدس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 2: مضاعفة التكديس. لقطات من لقطات البرنامج تظهر عملية لتكرار Z - المكدس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 3: توليد إسقاط الحد الأدنى من الكثافة. لقطات من لقطات من البرنامج الذي يوضح الإجراء لإنشاء إسقاط الحد الأدنى كثافة من تكرار Z المكدس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 4: إزالة الخلفية. لقطة للشاشة تلتقط البرنامج الذي يصور طريقة إزالة الخلفية من إسقاط Z-المكدس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 5: تعزيز التباين. لقطات من لقطات البرنامج يحدد الخطوط العريضة للخطوات لتعزيز التباين من الإسقاط Z - المكدس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 6: معايرة الصورة. لقطات من لقطات التقط البرنامج الذي يحدد عملية معايرة Z - المكدس وSZ كومة الإسقاط في ميكرون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 7: عد الكيسات. لقطات من لقطات تلتقط البرنامج الذي يصور الإجراء لحساب الخراجات على الإسقاط Z - كومة مع أداة خط مستقيم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 8: فحص عد الكيسات. لقطات من لقطات البرنامج يحدد طريقة لمقارنة عدد الخراجات التي تم حسابها على الإسقاط Z - المكدس وZ - المكدس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 9: توفير عائد الاستثمار. لقطات من لقطات البرنامج تبين كيفية حفظ مجموعة العائد على الاستثمار التي حددتها العد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 10: قياس حجم الكيس وعدده. لقطات من لقطات التقط البرنامج بالتفصيل كيفية قياس وحفظ حجم الكيس وعدد الكيس من الإسقاط Z - المكدس وZ - المكدس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

من أجل دراسة تكوين الأعضاء وصيانة الهياكل الخلوية 3D، وقد تم نمذجة الأنسجة المختلفة، وذلك باستخدام أصول الخلوية المختلفة ولكن أيضا أنواع مختلفة من المصفوفات خارج الخلوية بما في ذلك الهيدروجيل الاصطناعية8،9،10،21. ومع ذلك ، نظرا لعدم وجود تحليل كمي 3D التي تسمح للمقارنات بين الأساليب من حيث تشكيل organoids أو وظيفة7،8،9،10،15،18، مزيد من التوحيد للهيدروجل أو فحص المخدرات لا يزال بعيدا عن متناول اليد.

لمعالجة هذه العيوب، نقترح بروتوكولًا قائمًا على الهيدروجيل، قابلًا للتكرار، وموحد لإنشاء الخراجات المشتقة من الخلايا الظهارية. هنا، ونحن تجسد ذلك مع تشكيل الخراجات الصفراوية في الصفيحة القاعدية المستمدة هيدروجيل، من خط الخلية cholangiocyte المشار إليها. لفتح الحد من الكم 3D، يتم حساب كفاءة تكوين الكيس نسبة إلى العدد الإجمالي للخلايا المصنفة في هيدروجيل ويتم قياس حركة نمو الكيس عبر حجم هيدروجيل ثابت.

نحن نقدم سلسلة من الخطوات المنهجية لتوليد وتوصيف الخراجات، للسماح التحليل الكمي للكيسة ذات الصلة. ولهذا الغرض، بذلت جهود خاصة لتوليد توزيع موحد للمجاميع الخلوية في وقت تضمين الهيدروجيل والتحايل على عدم تجانس هيكل الهيدروجيل، مما يؤثر على تكوين الكيس عن طريق وضع الشروط اللازمة للحصول على عينة تمثيلية لعد الكيس.

ويتم تناول قابلية التكاثر التجريبية من خلال خطوات حاسمة مثل تصفية تعليق الخلايا للحد من حجم الخلية الإجمالية والطلاء المسبق لشرائح الحجرة قبل إضافة الخلية هيدروجيل لتجنب تشكيل طبقة ثنائية الأبعاد عندما تتصل الخلايا بسطح وعاء الثقافة. يتم حل القياس الكمي متسقة التقاط الصور على طول المحور Z من الهيدروجيل مع مجموعة ثابتة من المعلمات عبر عينات مختلفة والتجارب.

وتقدر كفاءة تكوين الكيس وحركية نمو الكيس من العدد الإجمالي للخلايا المصنفة في الهيدروجيل. وبالتالي، يقترح خوارزمية قابلة للتكيف لمعالجة الصور لتجزئة الصور لعد الكيس وقياسات حجم الكيس. وحداثة الطريقة المقترحة هي أن يتم العد والقياسات على إسقاطات المكدس Z. بعد إزالة خلفية محددة ، يتم تقييد عدد الصور لتحليل ، مما يسمح لتحقيق مكاسب كبيرة من الوقت والحد من تشبع القرص الثابت. الفلور المناعية هي أداة هامة لتحليل الثقافات 3D على المستوى الهيكلي، لا سيما الاستقطاب، المفتاح في وظيفة الخلايا الظهارية السليم4. وهكذا، اضطلعنا بالمهمة المتمثلة في تحسين التثبيت، والوصول، وعرقلة خطوات جزء من بروتوكولنا؛ استكشاف الأخطاء وإصلاحها تركيز BSA لمنع تراجع الكيس وانهيار التجويف.

تماما الأسلوب المقترح يفتح الطريق لتوليد بروتوكول بسيط، استنساخ، ومكلفة فعالة، والثقافات الخلوية 3D والتحقيق في المعلمات النوعية والكمية. وعلاوة على ذلك، هذه الطريقة تسمح للمقارنات بين أنواع مختلفة من المصفوفات: باستخدام نفس الطريقة مع بولي (Ethylene جلايكول) (PEG) المستمدة من الهيدروجيل يمكننا أن نثبت أن تشكيل التجويف والنمو تعتمد بشكل حاسم على صلابة hydrogel ولصق، على التوالي21. هذا البروتوكول هو أيضاً قابلة للتطبيق لمقارنة تشكيل ووظيفة الزفيرويدات المشتقة من خلايا مختلفة، والتي يمكن أن تشارك في توحيد نماذج الظهارية الظهارية الخاصة بالأنسجة. ومع ذلك، فإن القيد هو أن تحسين ظروف الثقافة مثل وسائل الإعلام والثقافة، وبذر الخلايا الأولية، والوقت اللازم لتشكيل كيس قد تكون مطلوبة لأنواع الخلايا الأخرى. في مجال القناة الصفراوية، قد يساهم هذا العمل في الإجابة على الأسئلة المتعلقة بنشأة الجهاز القناة الصفراوية، وكذلك المسارات الجزيئية للمرض، واختبار المخدرات. هذا البروتوكول سوف تجد أيضا حده عند تطبيقها على تحليل الإنتاجية العالية منذ بعض الخطوات مثل عد الكيس ومعالجة التصوير لا يتم أتمتة حتى الآن، على الرغم من أننا نقترح وحدات الماكرو لأشباه أتمتة عملية التصوير التي يمكن تطويرها أكثر من أجل أتمتة. القيد على المعالجة التلقائية في هذه الحالة هو خلفية الصورة. ويرجع ذلك إلى هيكل غير متجانسة من الهيدروجيلات المعقدة الطبيعية مثل هلام نوع الغشاء الطابق السفلي، ولكننا نعتقد أن أتمتة يمكن تطبيقها على المواد الهلامية الشفافة مثل الهيدروجيل المشتقة من البثق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر الدكتور نيكولاس لاروسو (مايو كلينك، روتشستر، مينيسوتا، الولايات المتحدة)، الذي تكرم بتوفير خط الخلايا في المركز النرويجي للاجئين.

وقد تلقى هذا العمل الدعم المالي من برنامج iLite RHU (منحة ANR-16-RHUS-0005) وHHU Hepatinov.

نشكر إيزابيل غارسين وRéseau d'Imagerie Cellulaire باريس Saclay لدعمهم في التصوير.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 µl- Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000020
100 µl - Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000046
1000 µl - Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000062
1X PBS Thermo Fisher Scientific 14190-094
200 µl - Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000054
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt Sigma-Aldrich T5516 NRC complete medium final concentration = 3.4 µg/mL
Acetic acid VWR 20104-298 0.02N final
Aerosol barrier pipettes tips 10 µl (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 2707439
Aerosol barrier pipettes tips 1000 µl (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 2707404
Aerosol barrier pipettes tips 200 µl (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 2707430
Antibiotic Antimicotic Solution (100X) Sigma-Aldrich A5955 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Bovine pituitary extract Thermo Fisher Scientific 13028-014 NRC complete medium final concentration = 30 µg/mL
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A2153 1:1000 dilution
Chemically Defined Lipid Concentrate (100X) Thermo Fisher Scientific 11905-031 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Collagen high concentration, rat tail Thermo Fisher Scientific 354249 50 µg/mL final concentration
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902 NRC complete medium final concentration = 0.393 µg/mL
DMEM F12 Thermo Fisher Scientific 21331-020 NRC complete medium final concentration = 1X
E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal Thermo Fisher Scientific PA5-32178 1:400 dilution
Eclipse TE300 inverted microscope Nikon imaging
Ethanolamine Sigma-Aldrich E9508 NRC complete medium final concentration = 0.32 mM
Fetal calf serum Thermo Fisher Scientific 10270-106 NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution
Fluoroshield with DAPI (Mounting medium) Sigma-Aldrich F6057
Formaldehyde 16% (W/V) Thermo Fisher Scientific 28906 4% (W/V)
Goat serum Thermo Fisher Scientific 16210-064 1:10 dilution
Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA - flash 4.OLT) Hamamatsu imaging
Hoechst 33258 Sigma-Aldrich B1155 5 µg/mL final concentration
IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647 Thermo Fisher Scientific A32733 1:500 dilution
ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n Open source image processing software
Insulin-Transferrin-Selenium (100X) Thermo Fisher Scientific 51300-044 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
L-Glutamine (100X) Thermo Fisher Scientific 25030-024 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL) Thermo Fisher Scientific 356231 4:10 dilution
NIS Elements software version 4.50.00 Nikon image acquisition and display
Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-035 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2) Nikon
Prolong Gold Antifade Reagent Thermo Fisher Scientific P36931
Propidium Iodide (PI) Sigma-Aldrich P4170 20 µg/mL final concentration
Rhodamine Phalloidin Thermo Fisher Scientific R415 16.2 nM final concentration
Sir-Actin / Verapamil kit Spirochrome SC001 10 µM final concentration
Soybean trypsin inhibitor Thermo Fisher Scientific 17075-029 NRC complete medium final concentration = 50 µg/mL
Sterile cell strainer 40 µm (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 22363547
Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 1367811E
Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 1367811D
Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 11926955
Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 7200886
Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 553913
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 5:100 dilution
Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon) Thermo Fisher Scientific 353108
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 5:1000 dilution
Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red Thermo Fisher Scientific 25300-054 1X
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 5:10000 dilution
Vitamin (100X) Thermo Fisher Scientific 11120-037 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi Clinisciences 80826

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  2. Martín-Belmonte, F., et al. Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis. Current Biology. 18, 507-513 (2008).
  3. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  4. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging Cells in Three-Dimensional Collagen Matrix. Current Procotols in Cell Biology. , Chapter 10 (Unit 10) (2010).
  5. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bisell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9064-9068 (1992).
  6. Kim, S. P., Lee, D. H., Park, J. K. Development of hepatocyte spheroids immobilization technique using alternative encapsulation method. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 3, 96-102 (1998).
  7. Lorent, K., et al. Identification of a plant isoflavonoid that causes biliary atresia. Science Translational Medicine. 7 (286), 67 (2015).
  8. Nowak, M., Freudenberga, U., Tsurkana, M. V., Wernera, C., Levental, K. R. Modular GAG-matrices to promote mammary epithelial morphogenesis in vitro. Biomaterials. 112, 20-30 (2017).
  9. Miroshnikova, Y. A., et al. Engineering Strategies to Recapitulate Epithelial Morphogenesis Within Synthetic Three-Dimensional Extracellular Matrix With Tunable Mechanical Properties. Physical Biology. 8 (2), 026013 (2011).
  10. Ozdemir, T., et al. Tuning Hydrogel Properties to Promote the Assembly of Salivary Gland Spheroids in 3D. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (12), 2217-2230 (2016).
  11. Dolega, M. E., Abeille, F., Picollet-D'hahan, N., Gidrol, X. Controlled 3D culture in Matrigel microbeads to analyze clonal acinar development. Biomaterials. 52, 347-357 (2015).
  12. Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucleic Acids Research. 46 (12), 70 (2018).
  13. Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
  14. Tam, P. K., Yiua, R. S., Lendahl, U., Andersson, E. R. Cholangiopathies - Towards a molecular understanding. EBioMedicine. 35, 381-393 (2018).
  15. Loarca, L., et al. Development and characterization of cholangioids from normal and diseased human cholangiocytes as an in vitro model to study primary sclerosing cholangitis. Laboratory Investigation. 97, 1385-1396 (2017).
  16. De Assuncao, T. M., Jalan-Sakrikar, N., Huebert, R. C. Regenerative medicine and the biliary tree. Seminars in Liver Disease. 37, 17-27 (2017).
  17. Dianat, N. H., et al. Generation of functional cholangiocyte-like cells from human pluripotent stem cells and HepaRG cells. Hepatology. 60, 700-714 (2014).
  18. Masyuk, A. I., et al. Cholangiocyte autophagy contributes to hepatic cystogenesis in polycystic liver disease and represents a potential therapeutic target. Hepatology. 67 (3), 1088-1108 (2018).
  19. Sampaziotis, F., Cardoso, M., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nature Biotechnology. 33 (8), 845-852 (2015).
  20. Soroka, J. C., et al. Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile. Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).
  21. Funfak, F., et al. Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417 (2019).
  22. Du, Y., et al. Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions. Hepatology. 0 (0), (2019).
  23. Shiota, J. M., Mohamad Zaki, N. H., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts. Journal of Visualized Experiments. (146), e59544 (2019).
  24. Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).
  25. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  26. Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment. International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).
  27. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death. Journal of Visualized Experiments. (50), e2597 (2011).
  28. Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O'Hara, S. P., LaRusso, N. F. Physiology of Cholangiocytes. Comprehensive Physiology. 3 (1), (2013).
  29. Spirlì, C., et al. Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line. American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 159، cholangiocytes، التنظيم الذاتي، التجويف، قطبية الخلية، الخراجات، تكوين الأعضاء، القنوات الصفراوية
التوصيف الكمي واللثي للأكياس الظهارية الظهارية الوظيفية والمستقطبة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bouzhir, L., Gontran, E., Loarca,… More

Bouzhir, L., Gontran, E., Loarca, L., Collado-Hilly, M., Dupuis-Williams, P. Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts. J. Vis. Exp. (159), e61404, doi:10.3791/61404 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter