Summary
3次元(3D)細胞系は、有機生成を調査するための関連モデルです。胆嚢の生成とその特性評価のためのヒドロゲルベースの方法が提案されている。このプロトコルは、嚢胞形成効率、サイズを評価し、その機能をテストするための簡単で信頼性の高い方法で、3D特性評価の障壁を解明します。
Abstract
胆管球は、肝臓の胆管を並べ、胆汁の形成と修飾を監督する上皮細胞である。過去20年間、肝臓病の文脈では、嚢胞、スフェロイド、チューブ状構造などの胆管組織に基づく3次元(3D)モデルが出現し、組織トポロジーを模倣して有機生成、疾患モデリング、薬物スクリーニング研究が行われています。これらの構造は、主に、ヒドロゲルにコリンジクサイトを埋め込むことによって得られた。主な目的は、上皮の極性、機能的、形態学的特性に対処することによって自己組織化を研究することであった。しかし、嚢胞形成効率に焦点を当てた研究はほとんどありません。この場合、効率は単一平面の画像から定量化されることがよくあります。機能アッセイおよび構造解析は、ヒドロゲル重合不均一性および副作用に起因する嚢胞分布の潜在的不均一性を表すことなく行われる。したがって、定量分析は、ある記事から別の物品への比較に使用できません。さらに、この方法論では、異なるマトリックスと細胞タイプの3D成長ポテンシャルの比較はできません。さらに、免疫染色嚢胞の実験的なトラブルシューティングについては言及されていない。本稿では、初期細胞分布が嚢胞形成の異種垂直分布に関連していることを示す、信頼性の高い普遍的な方法を提供する。ヒドロゲルに埋め込まれた胆管球細胞は、10日間の時間経過に沿ってヒドロゲル深度に沿ってZスタック分析を続ける。この方法により、嚢胞形成効率および成長の強い運動が得られる。また、嚢胞極性と分泌機能を評価する方法も紹介する。最後に、イメージングのための嚢胞崩壊を制限するために、免疫染色プロトコルを最適化するための追加のヒントが提供されます。このアプローチは、他の3D細胞培養研究に適用することができ、したがって、あるシステムを別のシステムと比較する可能性を開くことができます。
Introduction
過去30年間で、インビトロ研究の分野は3D培養システムに向けて進歩してきました。スキャフォールド/マトリックスの存在下または存在下でのスフェロイドまたは凝集体として細胞を3Dで培養するためのプロトコルの数が出現している、ドロップで、撹拌中、微小流体デバイス、または浮遊1。3D培養法の使用は、特に嚢胞またはアキニと呼ばれる3D構造で自己組織化することが示された上皮細胞に対して、2次元(2D)培養よりも利点を証明している。この場合、細胞は内腔を囲む単層を形成し、そこで細胞は生理学的特異的機能を改善した完全な上皮表現型を獲得する2。
多くの研究は、天然マトリックスでこれらの上皮オルガノイドを形成するための方法の開発に貢献しています。.これにより、生体細胞および細胞微小環境相互作用において再現化を図り、上皮表現型3、4、5、6、7の確立および安定性を得ることを可能にした。近年、特に移植可能なオルガノイドの開発や、上皮プログラムを調整するための微小環境の要件を解読することを目的として、上皮アチーニ8、9、10の形成を高める合成ヒドロゲルが開発されている。残念ながら、これらの研究は、定性的なデータに関する報告、または2D平面8、9、10における非嚢胞に対する嚢胞の比率などの内部参照を使用して計算方法を提示する。これは、上皮オルガノイドの効率、安定性、または形態学的および生理学的特徴の点で異なる研究間の比較を排除する。
マイクロ流体デバイスを用いたビーズ中の上皮細胞のマイクロカプセル化により、より現実的な定量的および比較的な結果が得られました。この技術を用いて、様々な細胞型のオルガノイドが形成され、異なる3D細胞構造11、12の形態に基づいて分化された。しかし、この技術は、マイクロ流体デバイスを製造するためにクリーンルームを使用する必要があり、作業することは容易ではありません。この技術は、いくつかのタイプのヒドロゲルのために確立されていますが、その汎用性を制限し、他のヒドロゲルに適用する技術的な適応を必要とします。したがって、上皮オルガノイドを開発することを意図したほとんどの研究は、ヒドロゲルバルク中の上皮細胞の埋め込みに依存しています。これらの方法では、3D培養全体の中でのゲル構造および細胞分布の高い不均一性は、しばしば無視される。したがって、ほとんどの解析は単一の 2D 画像に関連しており、これは 3D ボリューム全体におけるさまざまなセルラー オブジェクトの分布を大まかに表しています。
胆管、胆管閉鎖、原発性硬化性胆管炎などの胆管に影響を及ぼす疾患は、とりわけ、死亡率および罹患率の主な原因である。肝臓移植を除いて、これらの状態13に対する有効な治療法はない。胆管の形成、疾患原因、および進行を調査する努力は、新しい治療法の開発を可能にする14.
嚢胞、スフェロイドまたはチューブ様構造の胆道性組織モデルは、正常または患者由来、分化、または前駆細胞由来の胆管球細胞株を用いて15、16、17、18、19、20を開発した。様々な研究は、コリンギオライト極性、コリンギオライトマーカーの発現、繊毛の存在、胆管形成および吸収能、および管腔形成および閉塞を再現している。そのすべてが、胆管球表現型、形態、および機能15、17、19の重要な特徴を表す。他の人は、長期間の患者由来胆様オルガノイドの維持を長期間20に報告している。最近、我々は、胆嚢の有機生成における生化学的および生物物理学的手掛かりの役割を調べた。重要なことに、胆道閉鎖症の病因は胆道球形体および管7,22において研究された。さらに、胆管球老化、炎症促進性サイトカインの分泌、ならびにマクロファージの採用などの原発性硬化性胆管炎の主要な特徴は、胆道スフェロイド15,20を用いて研究に成功した。しかしながら、これらの質問に対処できる、生理的にcholangiocyte表現型、生理学、および微小環境を調節するvitro 3D定量モデルで再現性が依然として必要とされている。さらに、少数の出版物は、嚢胞形成効率21、23を報告している。これは、特に、有機的な生成、疾患原因、および薬物応答とコリンギョ球機能および分極の相関を調査する際に確立する重要なポイントです。さらに、プロトコル間で使用されるスキャフォールド/マトリックスの違いにより、システム間で比較することは困難です。これらの問題を解決するために、内腔形成、胆管状分極、胆管形成機能を模倣した胆嚢胞を生成する定量的、信頼できる普遍的な方法を提案する。重要なことは、時間の経過に伴う、嚢胞形成効率、サイズ、生存率、分極性、および機能性を評価する際に、3Dゲルを横切ってZ軸に沿って行われる体系的な分析を提示することです。さらに、天然ヒドロゲルおよび正常ラット胆管球(NRC)sをプロトコルの例として使用したが、他の天然または合成ヒドロゲル、ならびに上皮細胞は3D嚢胞構造の形成に使用することができた。
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Protocol
1. 嚢胞の発生
注: ゲル化によって細胞の埋め込みが可能な場合、このプロトコルはあらゆるタイプのヒドロゲルで実行できます。
- ヒドロゲルコーティング
注:チャンバースライドの適切なヒドロゲルコーティングは、その後の嚢胞イメージングを妨げ、嚢胞形成効率の計算を損なう可能性があり、ウェルの底部に2D細胞層の形成を避けるための重要なステップです。- ゲル溶液の均質性を確保するために、ヒドロゲルを一晩4°C(O/N)で解凍する。
- 氷または-20°CのO/Nにピペットチップをプレクールし、8ウェルチャンバースライド-20°CO/Nでスライドします。
- ヒドロゲルと8ウェルチャンバースライドを氷で満たされたアイスバケツの上に置きます。
- 15 mL円錐形チューブで、40%ヒドロゲル(V/V)を含む溶液を冷たいNRC完全培地( 材料表を参照)に調製し、チューブを氷の上に置きます。
- チャンバースライドをコーティングするには、冷たいピペットチップを使用して、各ウェルの中央に50μLのヒドロゲル溶液を加え、ピペットチップを使用して表面全体に広がり、チャンバースライドを氷の上に保持します(図1A)。
注:ハイドロゲル溶液を可能な限り均等に分散して、泡を避けてください。 - ヒドロゲルを重合するために、チャンバースライドを37°Cで少なくとも15分間インキュベートし、5%CO2.
- 細胞製剤
- NRC完全培地、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、トリプシンエチレン酢酸(トリプシン-EDTA)を37°Cに予熱した水浴中で温めます。
- ヒドロゲルが重合している間、T-25 cm2 コラーゲンコーティングフラスコ21でNrCが70%の合流率に成長することを確認する。予熱した1x PBSで細胞を一度洗います。
- NRCを5 mLの予熱1x PBS(T-25 cm2フラスコの場合)で37°C、5%CO2で20分間インキュベートします。
注:このステップは、トリプシン-EDTAでのインキュベーション時間を短縮し、細胞の自己組織化特性を保持するのに役立ちます。 - PBSを捨て、トリプシン-EDTAを1mL加え、37°Cで5〜10分間インキュベートし、5%CO2.
- 4 mLの予熱完熱NRC培地で中和します。セル懸濁液を15 mL円錐形チューブに集めて移し、150 x g で4分間スピンします。
- 培地を廃棄し、予熱した培地の5mLで細胞ペレットを再懸濁する。
- 40 μmの細胞ストレーナーを使用して、細胞溶液を50 mLの円錐チューブにフィルターし、細胞を数えます。
注:ストレーナーを通して細胞を渡すことは、定量的な結果を再現可能にするための重要なステップです。すなわち、埋め込まれる細胞凝集物のほぼ同じサイズを得るために。
- ヒドロゲル溶液中の細胞懸濁液の埋め込み
- 1,600 μLの 80% ヒドロゲル (V/V) の溶液を、完全な NRC 培地 (チューブ 1) で調製します。氷の中に入っていきなさい。5 x 105 細胞/mLを1,600 μLの冷常NRC培地(チューブ2)で希釈し、氷に保ちます。
注:このステップは、ヒドロゲルを細胞懸濁液と混合しながら重合することを避け、細胞の生存率を維持するために迅速に実行する必要があります。 - 40%ヒドロゲル(V/V)に2.5 x 10 5細胞/mLの細胞播種液を調製するために、チューブ1およびチューブ2を混合する。400 μL のセル溶液を、気泡を避けてヒドロゲルコーティングチャンバー スライドの各ウェルに追加します(図 1B)。
- チャンバースライドを37°Cで5%CO2で媒体が変わるまで保管します。
- 培養で2日後、各ウェルの隅から培地の250μLを取り除き、ヒドロゲルをピペットアウトしないように注意してください。次いで、250μLの培養液をゆっくりと添加する。2日ごとにメディアを変更します。
注:特に嚢胞の開始中に、チャンバースライドの動きを最小限に抑えます。
- 1,600 μLの 80% ヒドロゲル (V/V) の溶液を、完全な NRC 培地 (チューブ 1) で調製します。氷の中に入っていきなさい。5 x 105 細胞/mLを1,600 μLの冷常NRC培地(チューブ2)で希釈し、氷に保ちます。
2. 嚢胞定量
- 嚢胞イメージング
注:このセクションは、顕微鏡がCO2 と温度を制御するために加熱室を装備していない場合、細胞の生存率を損なわないように迅速に実行する必要があります。完全なヒドロゲル体積における嚢胞分布を代表する一貫した定量化を保証するために、嚢胞は位相対顕微鏡法および連続イメージング(Zスタック)を介してイメージングされ、異なる時間ポイントにわたって事前定義されたパラメータを有する。- 各時間ポイントのハイドロゲルの深さに沿ってZスタックを取ります(図1C,D)。この例では、Z スタックは 1 日、2 日、4 日目、7 日目、および 10 日に取得されます。
注: この方法の適用性を確認するために、ヒドロゲル内の初期細胞分布が均一であることを確認してください。- 画像取得ソフトウェアを搭載した位相コントラスト顕微鏡を使用して、手動ノーズピースパッドウィンドウで10倍の目標倍率を選択します(図2B(1))。
- 白色のランプをオンにして、明視野イメージングオプションを選択します。
- バーのサブメニューで [再生] ボタンを選択して、カメラの電源を入ります。嚢胞のフィールドに焦点を当て、露光時間を設定します(図2B(2))。イメージを 自動保存するには、[自動キャプチャ フォルダ] ウィンドウを開きます(図 2B(3))。
- キャプチャ Z シリーズ ウィンドウを開き、Z スタックの上面と底面を Z ねじで定義します(同じ XY 座標は、異なる Z スクリーン)。目的、解像度のレベルに応じてZステップを調整し、ボタンを押して「今すぐ実行」を押して取得を開始します(図2B(4))。
注:この例では、嚢胞は520 μmのヒドロゲル厚に広がり、20μmのZステップ間隔で26枚の画像がヒドロゲル深度に沿って取得されます。目的に応じて、Zステップは、任意の嚢胞を逃さないように調整し、単一細胞および凝集体の検出を確実にする必要があります。 - 1 ウェルあたり、オーバーラップしない Z スタックを少なくとも 3 つ取ります。
注:このサンプリングは、この例のように、嚢胞がヒドロゲル重合の不均一性のためにエッジよりもゲルの深さに多い場合に必要です。 - 代表的なデータセットを使用するには、ステップ 2.1.1.5 を繰り返します。合計で3つの井戸のために。
注:嚢胞の不均一な分布は、ヒドロゲルの種類、その重合、および細胞株によって異なります。井戸あたり3つのZスタックと実験ごとに3つの井戸を考慮すると、最低200個の嚢胞が9つのZスタックにわたって画像化され、各時点で嚢胞形成および嚢胞の成長を特徴付ける。
- 各時間ポイントのハイドロゲルの深さに沿ってZスタックを取ります(図1C,D)。この例では、Z スタックは 1 日、2 日、4 日目、7 日目、および 10 日に取得されます。
- 画像処理
注:ヒドロゲルでは、NrCsは単一の細胞、嚢胞または凝集体として見つけることができます。嚢胞は、内腔を囲む円形で薄い対照的な細胞シェルの存在によって同定され、細胞凝集体は不規則な形状を有し、内腔を有さない。凝集体と単一細胞は、緻密で対比された外観を有する(図3B(4) )。- フィジーソフトウェアを開き、Zスタックを開いてフィジーメニューに移動し、[ファイル| 解析する Z スタックを選択します。必要に応じて、[仮想スタック] オプションを選択し、 [はい] をクリックして開きます (図 3A(1))。
- 画像を介してスタックを複製 する |複製します。 [重複スタック] ボックスをクリックし、 [OK] をクリックします (図 2) 。
注: この例では、Z スタックは 16 ビットでエンコードされた .nd2 ファイル形式です。 - 複製されたスタックから最小強度投影を作成します。画像メニューに移動|スタック |Z プロジェクト.投影タイプ "最小強度" を選択し、 "OK" ( 図 3A(2) )をクリックします (補助図 3) 。
- 投影から背景を引きます。[プロセス] メニューに移動する |背景を減算する 。ローリングボール半径の500.0ピクセルを入力し、「明るい背景」をクリックして、背景よりも対照的な嚢胞をレンダリングします(図3A(3))(補足図4)。
注: ローリング ボールの半径は、背景の減算が操作される領域のサイズを定義します。このパラメーターは、識別する最大オブジェクトのサイズに設定する必要があります。 - コントラストの強調が必要な場合は、[イメージ] メニュー |調整 |明るさ/コントラスト |自動 |を適用します。フィジーは自動的に明るさとコントラストを最適化します。(図3A(3))では、下のグレーと上のグレーの値がそれぞれ49702と65452に設定されています(補助図5)。
注: 投影が調整されていない場合は、[分析] メニューに移動|スケールを設定し、対応するキャリブレーションμm/ピクセル比を入力します(補足図6)。
- 嚢胞計数と嚢胞サイズ測定
- おおよその嚢胞径を測定するには、フィジーメニューの直線ツールを選択し、最終投影の各嚢胞の直径を横切る線を描きます(図3B(4))。各嚢胞に対して作成された新しい関心領域 (ROI) を ROIマネージャに追加します。カウントされた嚢胞を表示するには、[すべて表示] をクリックします (補助図 7)
- Zスタックの投影からセットROIを重ね合わせることにより、嚢胞がカウントされずに残っていないか確認します。これを行うには 、Z スタック ウィンドウ をクリックして選択します。ROI マネージャで、[すべて表示] をクリックし、Z スタックに沿ってカーソルを移動して、イメージごとにイメージがカウントされていることを確認します (補助図 8)。
- ステップ 2.3.1 で新しい嚢胞がカウントされ、ROI が追加されたら、ROI セットを選択し、[詳細] をクリックして [ROI マネージャ] ウィンドウで保存します 。保存 (補助図 9)
- ROI マネージャですべての ROI を選択し、ROI マネージャで [測定] をクリックして、各嚢胞のサイズを取得します。これにより、各嚢胞とその推定サイズに番号を付ける「結果」という名前の測定の新しいウィンドウが開きます。次に、[結果] ウィンドウをクリックし、メニューを使用して、.csv形式で保存します。名前を付けて保存(補助図 10)
注:半自動スタックを処理し、突起から嚢胞の数/サイズを推定し、より速いカウント手順のためにデータを保存するマクロを作成できます。これを行うには、バーメニューの「録音」ツールを選択し、 プラグインをクリックして |マクロ |レコード.
- 嚢胞形成効率の定量化
- Y日目のシストの数を
、投影(Y=1、2、4、7、または10)で数えます。 - Y日目の1000個の細胞の嚢胞形成効率を計算するには、その時点で数えられた嚢胞の数を、ヒドロゲル体積から推測される0日目に播種した細胞の数で割り、1000を掛ける(図3C、図4)。
- Y日目のシストの数を
、投影(Y=1、2、4、7、または10)で数えます。
3. 細胞生存率
- 5 mg/mLでフルオレセインジアセト(FDA)のストック溶液を調製し、5 mgのFDAを1 mLアセトンに溶解し、-20°Cで保存します。
- 脱イオン水(dH2O)中の2mg/mLの濃度でヨウ化プロピジウム(PI)のストック溶液を調製し、4°Cで保存します。
- 胎児の子牛血清(FCS)なしでNRC培地を準備する。
- FDA/PI染色液を調製するには、4 μLのFDAストック溶液(8 μg/mL最終濃度)と25 μLのPIストック溶液(20 μg/mL最終濃度)を、FCSを使用しないNRC培地2.5 mLに添加します。
- チャンバースライドから培地を取り出し、250μLの染色液を各ウェルに加え、37°C、5%CO2で暗闇の中で4〜5分間インキュベートする。慎重に染色液をピペットアウトし、1x PBSの250 μLで1回洗浄します。
- 各ウェルに250 μLの完全なNRC培地を慎重に加え、テキサス赤とフルオレセインイソチオシアネート(FITC)フィルターを使用して反転蛍光顕微鏡を使用して写真を撮ります。ライブセルは緑色になり、死んだ細胞は赤になります(図5A)。
注:生細胞/死細胞を定量化するために、ステップ2の後のヒドロゲルボリューム全体にZスタックを取り、画像処理法を蛍光に適応させます。
4. 分泌活動
注:胆管腔細胞の素端膜を介した分泌活性は、内腔内のフルオレセインの分泌によって評価される。その特異性は、多剤耐性(MDR)トランスポーター阻害剤24であるベラパミルと同様の試験を行うことによって評価することができる。
- 5 μg/mLでHoechst 33258の染色液を調製するには、FCSを使用しないNRC培地2.5mLに0.83 μLのHoechstストック溶液(dH2 Oで15mg/mLストック濃度)を加えます。
- 各ウェルに250 μLのHoechst溶液を加え、37°Cでインキュベートし、5%CO2で15分間インキュベートします。
- Hoechst溶液を取り外し、各ウェルに250 μLのFDA溶液(8 μg/mL最終濃度)を加えます。インキュベート 4-5 分 37 °C、5% CO2.
注:細胞がFDA染色液にさらされるとすぐに、フルオレセイン分泌動態のフォローアップは、嚢胞が分泌するのに必要な時間を較正するのに役立つかもしれません。これを行うには、タイムラプスイメージングを介して1時間ごとに写真を撮ります。この例では、ヒドロゲル中のNRC分泌嚢胞を観察するのに必要な時間は約15〜20分である。 - FCSを使用しない培地でリンスした後、5分の反転蛍光顕微鏡を使用して画像を撮ります。4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)およびFITCフィルタを使用して、内腔内の核標識およびフルオレセイン蓄積を明らかにする(図6A)。分泌嚢胞の数を定量化するには、ステップ2のようにZスタックを取り、画像処理ステップを蛍光画像に適応させます。
注意: ベラパミル検定の場合、前のプロセスの前に、次の条件に従って、ベラパミルとのインキュベーションを行います(手順4.3.~4.4. - ジメチルスルホキシド(DMSO)で10 mMベラパミルのストック溶液を調製します。10 μMの作業用溶液を調製するには、2.5 μL のベラパミルストック溶液を、FCSを使用しない 2.5 mL 培養培地と混合します。
- 内腔内の蛍光がMDR分泌から生じると評価するには、別のスライドを取り、各ウェルに250 μLのベラパミル作動溶液を追加し、37°Cで20分、5%CO2をインキュベートする
- 溶液を取り除き、各ウェルに250 μLのFDA溶液(8 μg/mL最終濃度)を加えます。37°Cで暗闇の中で4-5分、5%CO2をインキュベートする。次いで、250μLの1x PBSで、イメージング前に洗浄する(図6B、C)。
5. 免疫蛍光による上皮極性評価
- 固定溶液を調製するには、4%ホルムアルデヒドと5%スクロースを混合し、1xPBS、pH7.4、37°Cで予熱した水浴中でインキュベートする。
- 細胞を固定するために、マトリックスを損傷することなく、ウェルから培養培地を静かにピペットアウトする。400 μLの固定溶液をウェルの側面にゆっくりと加えます。室温(RT)で20分間インキュベートします。
注:損傷を防ぐために、必ずマトリックスの上に液体の25 μLを残してください。 - 固定溶液を静かに取り出し、400 μLの1x PBSで3x(RT)で洗浄します。
- ピペットをPBSに出し、400 μLのパーメアビライゼーション溶液(1x PBSで0.5%トリトンX-100)を加え、RTで10分間インキュベートします。
- パーメアビライゼーション溶液を静かに取り除き、続いて400 μLの1x PBSで3回のクイック洗浄を行い、RTで30分の長い洗浄ステップを行います。
注:このステップでは、スライドは2日間4°Cで保存することができます。この場合、蒸発およびマトリックス乾燥を防止するためにパラフィンフィルムでスライドを密封する。 - PBSを取り出し、1x PBSに0.1%のウシ血清アルブミン(BSA)と10%のヤギ血清を含むブロッキング溶液400 μLを加え、RTで60分間インキュベートします。
注意: 0.1%を超えるBSA濃度は、内腔の引き込みおよびさらなる嚢胞崩壊をもたらす(代表結果セクションを参照) (図7A)。 - ブロック溶液をピペットアウトし、PBS / 0.05% Tween 20の400 μLで1回洗浄し、廃棄します。
- 抗体溶液の150μLを加え、例えば、1x PBSで1:400およびファロジン568(16.2 nM最終濃度)を希釈し、RTで90分間インキュベートする。
注:このE-カドヘリンの希釈は、標準的な2D免疫蛍光プロトコルと同じ使用です。 - PBS/0.05%Tween 20,3xの400 μLでサンプルを洗浄します。毎回RTで10分間サンプルをインキュベートする。
- 2次抗体(ヤギ抗ウサギIgGアレクサフルオールプラス647)の150 μLを加え、1x PBSで1:500希釈し、RTで60分インキュベートします。
- 3xを400 μLのPBS/0.05%Tween 20で洗浄し、毎回RTで10分間サンプルをインキュベートします。
- 3xを400 μLの1x PBSで洗浄し、毎回RTで10分間サンプルをインキュベートします。
- 最後の洗浄のPBSを廃棄し、以下の2つのオプションのいずれかに従って共焦点顕微鏡を介して視覚化のためにチャンバースライドを準備します。
- 1x PBS 400 μL と 50 μL の DAPI を井戸ごとに追加します。サンプルは、カバースリップで取り付けなくても、ウェルの底部を通して検査することができます(図7B)。
- DAPIを含む抗フェード試薬のウェルあたり100 μLを加え、スライド乾燥O/NをRTで行います。
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Representative Results
嚢胞の形成と特徴付け
3D細胞培養システムは、有機生成および疾患モデリング25を研究するための重要なツールである。残念ながら、これらの方法のほとんどは、様々な研究間の嚢胞形成効率の点で、嚢胞の数と非嚢胞の数を比較することによって単一の平面上で行われる内部定量化を使用する定性的である7、8、9、10、15、18、23。このプロトコルで提案された方法は、実験の時間にわたって嚢胞の全数およびそれぞれのサイズを記録することによって、嚢胞形成および成長の進化の分析を可能にする(図4)。
位相コントラスト画像に基づいて、0日目に、主に小細胞凝集体を細胞播種後8時間がヒドロゲルに埋め込まれていることが判明した。1日目には、中央値直径42.95(26.53、50.47)の小さな嚢胞(第1、第3四分位数)μmおよびヒドロゲル全体に散在する嚢胞の融合が顕著である。4日目までに、凝集構造と中央値の直径75μmの嚢胞を観察することが一般的である。7日目と10日目までに、嚢胞の直径の中央値はそれぞれ108.67(75.31、141.76)μm及び186.46(113.98,278.29)μmに達した(図4A-C)。興味深いことに、 嚢胞形成効率は、1日目の70.03±5.05個の嚢胞/1000細胞から99.83±10日目まで12.81個の嚢胞/1000細胞が10日目まで一定に保たれる(図4B)、嚢胞が埋め込み時に存在する細胞集合体から本質的に形成されることを示唆している。嚢胞サイズの進化に関しては、平均サイズはゆっくりと規則的な傾斜に従うが、サイズ分布は培養時間に沿って広く増加し、様々な嚢胞が同じ速度で成長しないことを示している。興味深いことに、これは、嚢胞がヒドロゲル中に均等に分布していないという我々の観察(示されていない)に関連している可能性があり、ヒドロゲル体積の中心に横たわっている最大の嚢胞である。嚢胞径の増加は主に分泌活性に依存するため(NRC由来の嚢胞では細胞分裂率が制限されるため)、この活性は細胞培養体積において均質ではないヒドロゲル特性に大きく依存していると推測できる。
次に、FDA/PI生きた染色を用いて、10日目にヒドロゲル(0日目)と嚢胞に細胞を埋め込んだ後の細胞の生存率を確認した(図5A)。FDAは、生細胞のみを生きる非蛍光分子であり、酵素反応を通じて、緑色蛍光化合物フルオレセイン26に変換することができる。PIは、壊死細胞27のDNA内で補間される生細胞用の非パート意味分子である。興味深いことに、10日目の培養体積中の細胞全体の3%未満を表す死んだ細胞は、ほとんどが嚢胞の外に、単離された細胞または小さな凝集体の一部として見られる。しかし、10日目に壊死細胞の破片が大きな嚢胞に蓄積していることに気づいた(図5B)。したがって、嚢胞性培養物の維持のために、これらの状態では10日前に嚢胞の通過が推奨される。
機能評価
生理学的条件において、胆管球の主な機能は、MDRチャネルが主要なプレーヤーである吸収および分泌機構を介して運河胆汁を修飾する。嚢胞の機能性を評価するために、FDA/Hoechstで1日目の嚢胞をインキュベートし、フルオレセインの形成と基礎から座端の発光空間への分泌物を観察しました(図6A,B)。したがって、嚢胞中のNRCが分泌機能を保持していることを確認する。また、蛍光の分泌は、MDR阻害剤ベラパミル(図6C)による嚢胞の前処理によって阻害され、内腔への蛍光FDAの蓄積はMDRトランスポーターを介した分泌によるものであり、細胞間空間から漏出することによるものではないことを示した。
嚢胞極性の評価
NRC嚢胞の分極化を確立するために、免疫蛍光プロトコルの一連の最適化ステップを実施した。嚢胞における上皮細胞極性の検査における主な障害の1つは、内腔に含まれる流体の漏出による免疫蛍光プロセス中のオルガノイドアーキテクチャの頻繁な崩壊である。この問題を回避するために、免疫蛍光プロトコルの各ステップは、様々な状態が嚢胞構造の維持にどのように影響するかをテストすることによって評価されている。固定(ホルムアルデヒド(2-4%)+スクロース(5-10%))または透過性条件(トリトンX-100およびスクロースの両方の0.1〜1%)を調節することは、嚢胞アーキテクチャにあまり影響を与えないことがわかりました。これらの範囲は、強く固定し、穏やかに胆管球を透過させるために使用することができます(図7A)。しかし、高濃度の場合嚢胞の後退や内腔の崩壊が起こり、飽和状態の間にBSAを0.1%以下に保つことが嚢胞の完全性を維持する上で重要なステップであることを観察しました(図7A)。
胆管球機能は、その適切なアピコバソラショナル極性29に依存している。NRC嚢胞が偏光構造としてヒドロゲル中で自己集合することを確認するために、それぞれF-アクチンおよびEカドヘリンのアペカルおよびバソラタル局在化を確認した。我々の嚢胞におけるEカドヘリン発現は、NRCが少なくとも10日間ヒドロゲル(図7B)中に上皮表現型を維持することを示している。
図1:嚢胞形成と特徴付けの実験的ワークフロー(A)チャンバースライドのヒドロゲルコーティング。(B)ヒドロゲル中に細胞埋め込み。(C) 嚢胞形成の顕微鏡検査(D) 嚢胞の成長、生存率、機能性、および分極の10日間のフォローアップ評価。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:画像取得方法 (A) ヒドロゲル深度に沿って行われるZスタック獲得のワークフロー 1日目から10日目:Zスタック取得(1)最小強度投影と嚢胞定量のZ-スタックの画像処理(2)生成(3)(B) 目的の選択を示す画像取得ソフトウェアのスクリーンショット (1), パラメータの調整 (2), 画像の自動保存 (3), Zスタックキャリブレーション (4). この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:嚢胞サイズおよび嚢胞形成効率の定量方法。() 画像処理レイアウトを描写する:Zスタックを分析する(1),その最小強度 Z-projection (2), 背景減算後の最終的な Z 投影 (3) 嚢胞数と嚢胞サイズ推定に使用される。(B) 投影の嚢胞識別 (A3) と投影ズーム (4) を使用して、明るい内腔を囲む暗い細胞シェルによって特徴付けられた嚢胞の識別を示す。(C)1,000個の細胞に対する嚢胞形成効率の計算式。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ヒドロゲルにおける嚢胞形成効率及び嚢胞サイズ分布 (A) 3D培養の0、1、2、4、7、および10日目における代表的な位相コントラスト画像を示すタイムラプス。(B) 平均嚢胞形成効率の動態を有するプロットグラフ ± SEM (n=3)。(C)培養時における嚢胞サイズ分布を示す箱およびウィスカープロット。黒いバーは、第1四分位数、中央値、第3四分位数を表します。線は分布の幅を表します。黒い点は分布の最小値と最大値を表します( n =3)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ヒドロゲル中のNRC嚢胞の生存率。 (A) 0日目と10日目の文化の代表的な蛍光ライブ画像は、FDA(緑色=ライブ)とPI(赤=死んだ)で染色された。なお、赤色蛍光は主に単一細胞に関連していた。(B) 10日目に壊死性嚢胞の代表的な蛍光ライブ画像が生じ、そこでは死細胞(赤色)が内腔に蓄積しているのが見られた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ヒドロゲル中のNRC嚢胞の機能性.(A)細胞の層が、分泌されたFDA(緑色)によってHoechst(青)と内腔で標識された核によって明らかにされた10日間の嚢胞の代表的な蛍光ライブ画像。(B)代表的な位相コントラスト/蛍光ライブ画像は、内腔に蓄積を示したFDAとの分泌試験後に生画像である。(C)MDR阻害剤であるベラパミルへの博覧会の後、FDAが細胞の層に保持されたことを示す嚢胞の代表的な相コントラスト/蛍光ライブ画像。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:ヒドロゲル中のNRC嚢胞の蛍光免疫。()プロトコルの各ステップで代表的な嚢胞形状を示す明視野画像を用いる免疫蛍光プロトコルの最適化。左から右へ:(リビング嚢胞)は、固定前の完全な培地で生きている嚢胞、固定後の嚢胞、浸透後の嚢胞(パーメアビライズ)、飽和ステップ後の嚢胞、および(標識)免疫標識ステップで嚢胞である。(B)(1-2):尖体表面マーカーF-actin(赤オレンジ)、バソラテララルマーカーEカドヘリン(緑色)およびDAPIで染色された核(青)を示す嚢胞を通るセクションの共焦点像。(3):F-アクチンの場合は赤オレンジ、Eカドヘリンの場合は緑色の標識を持つ嚢胞のセットの3D再構成。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補助図1:スタックの開口部 Z スタックを開く手順を示すソフトウェアのスクリーンショットキャプチャ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 2: スタックの複製。 Z スタックを複製するプロセスを示すソフトウェアのスクリーンショットキャプチャ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補助図3:最小強度投影の生成。 複製された Z スタックから最小強度の投影を作成する手順を示すソフトウェアのスクリーンショットをキャプチャします。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 4: 背景の削除 Z スタック投影から背景を削除するメソッドを示すソフトウェアのスクリーンショットキャプチャ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補助図5:コントラスト強化。 Z スタック投影のコントラストを強化する手順を概説するソフトウェアのスクリーンショットをキャプチャします。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:画像キャリブレーション スクリーンショットは、ZスタックとZスタック投影をミクロンで校正するプロセスを非分類するソフトウェアのキャプチャーです。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図7:嚢胞計数。 直線ツールを使用してZスタック投影上の嚢胞を数える手順を示すソフトウェアのスクリーンショットキャプチャ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図8:嚢胞計数検査。 Zスタック投影とZスタックでカウントされる嚢胞の数を比較するメソッドを概説するソフトウェアのスクリーンショットキャプチャ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 9: ROI 節約 カウントで定義された ROI セットを保存する方法を示すソフトウェアのスクリーンショットをキャプチャします。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図10:嚢胞の大きさと数の測定値。 スクリーンショットは、Zスタック投影とZスタックから嚢胞サイズと嚢胞番号を測定し、保存する方法を詳述したソフトウェアのキャプチャーです。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
3D細胞構造の有機生成および維持を研究するために、様々な組織がモデル化され、異なる細胞起源を用いて、合成ヒドロゲル8、9、10、21を含む異なる種類の細胞外マトリックスも使用している。しかし、オルガノイドの形成や機能性の観点から方法を比較できる3D定量分析の欠如のため、7、8、9、10、15、18、ヒドロゲルまたは薬物スクリーニングのさらなる標準化は手の届かないところに残っています。
これらの欠陥に対処するために、上皮細胞由来嚢胞を生成するためのヒドロゲルベース、再現性、標準化されたプロトコルを提案する。ここでは、基礎層層由来ヒドロゲル中の胆嚢胞の形成を、参照した胆管球細胞株から例示した。3D定量の制限を解除するために、嚢胞形成効率は、ヒドロゲルに播種された細胞の総数に対して計算され、嚢胞成長キネティクスは一定のヒドロゲル体積を越えて測定される。
私たちは、関連する嚢胞定量分析を可能にするために、嚢胞を生成し、特徴付けるための一連の体系的なステップを提供します。この目的のために、ヒドロゲル埋め込み時に細胞凝集体の均一な分布を生成し、嚢胞計数の代表的なサンプルを有する条件を設定することによって嚢胞形成に影響を与えるヒドロゲルの構造の不均一性を回避するために特別な努力がなされている。
実験再現性は、細胞が培養容器の表面に接触する際に2D層形成を回避するために、細胞凝集体サイズを制限し、セルヒドロゲル添加前にチャンバスライドの細胞凝集サイズおよびプレコーティングを濾過するなど、重要なステップを通じて対処される。一貫した定量化は、異なるサンプルと実験間で一定のパラメータセットを持つヒドロゲルのZ軸に沿って写真を撮って解決されます。
嚢胞形成効率および嚢胞成長動態は、ヒドロゲルに播種された細胞の総数から推定される。その結果、画像処理のための適応可能なアルゴリズムは、嚢胞カウントおよび嚢胞サイズ測定のための画像をセグメント化するために提案される。提案された方法の目新しさは、カウントと測定がZスタック投影で行われるということです。特定の背景を削除した後、分析する画像の数が制限され、かなりの時間の増加とハードディスクの飽和を制限することができます。免疫蛍光は、構造レベルでの3D培養物、特に分極、適切な上皮細胞機能4におけるキーを解析するための重要なツールである。したがって、プロトコルの免疫蛍光部分の固定、透過、およびブロッキングステップを慎重に最適化する作業を行いました。BSA濃度のトラブルシューティングは、嚢胞の引き込みおよびさらなる内腔崩壊を防ぎます。
提案された方法全体が、単純で再現性が高く、かつ高価なプロトコル、3D細胞培養を生成し、定性的および定量的パラメータを調査する経路を開く。さらに、この方法は、異なる種類の行列間の比較を可能にする:ポリ(エチレングリコール)(PEG)由来のヒドロゲルと同じ方法を使用して、ルーメンの形成と成長がそれぞれ21のヒドロゲル剛性および粘着性に大きく依存していることを実証することができた。このプロトコルは、組織特異的上皮スフェロイドモデルの標準化に関与する可能性のある異なる細胞に由来するスフェロイドの形成および機能を比較するためにも適用可能である。しかし、培養培地、初期細胞播種、嚢胞形成に必要な時間などの培養条件の最適化が他の細胞タイプに必要になる可能性があることは制限である。胆管分野では、胆管有機新生に関する質問、疾患の分子経路、薬物検査に関する質問に答える可能性があります。このプロトコルは、嚢胞カウントやイメージング処理などの一部のステップがまだ自動化されていないので、高スループット分析に適用される場合にも限界を見つけるでしょう。この場合の自動処理の制限は、画像の背景です。これは、基部膜型ゲルのような天然の複合ヒドロゲルの不均一構造によるものであるが、PEG由来ヒドロゲルなどの透明なゲルに自動化が適用される可能性があると考えています。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
NRC細胞株を提供してくれたニコラス・ラルッソ博士(メイヨークリニック、ロチェスター、ミネソタ州、米国)に感謝します。
この作業は、iLite RHUプログラム(ANR-16-RHUS-0005を付与)とDHUヘパティノフの両方の財政的支援を受けました。
イザベル・ガルシンとレソー・デ・イメージリー・セルライア・パリ・サクレーのイメージング支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 µl- Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000020 | |
| 100 µl - Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000046 | |
| 1000 µl - Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000062 | |
| 1X PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| 200 µl - Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000054 | |
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma-Aldrich | T5516 | NRC complete medium final concentration = 3.4 µg/mL |
| Acetic acid | VWR | 20104-298 | 0.02N final |
| Aerosol barrier pipettes tips 10 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707439 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 1000 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707404 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 200 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707430 | |
| Antibiotic Antimicotic Solution (100X) | Sigma-Aldrich | A5955 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Bovine pituitary extract | Thermo Fisher Scientific | 13028-014 | NRC complete medium final concentration = 30 µg/mL |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | 1:1000 dilution |
| Chemically Defined Lipid Concentrate (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Collagen high concentration, rat tail | Thermo Fisher Scientific | 354249 | 50 µg/mL final concentration |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | NRC complete medium final concentration = 0.393 µg/mL |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 21331-020 | NRC complete medium final concentration = 1X |
| E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal | Thermo Fisher Scientific | PA5-32178 | 1:400 dilution |
| Eclipse TE300 inverted microscope | Nikon | imaging | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | NRC complete medium final concentration = 0.32 mM |
| Fetal calf serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution |
| Fluoroshield with DAPI (Mounting medium) | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Formaldehyde 16% (W/V) | Thermo Fisher Scientific | 28906 | 4% (W/V) |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-064 | 1:10 dilution |
| Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA - flash 4.OLT) | Hamamatsu | imaging | |
| Hoechst 33258 | Sigma-Aldrich | B1155 | 5 µg/mL final concentration |
| IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647 | Thermo Fisher Scientific | A32733 | 1:500 dilution |
| ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n | Open source image processing software | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium (100X) | Thermo Fisher Scientific | 51300-044 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 356231 | 4:10 dilution |
| NIS Elements software version 4.50.00 | Nikon | image acquisition and display | |
| Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2) | Nikon | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 20 µg/mL final concentration |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | 16.2 nM final concentration |
| Sir-Actin / Verapamil kit | Spirochrome | SC001 | 10 µM final concentration |
| Soybean trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 17075-029 | NRC complete medium final concentration = 50 µg/mL |
| Sterile cell strainer 40 µm (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 11926955 | |
| Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 7200886 | |
| Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 553913 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | 5:100 dilution |
| Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon) | Thermo Fisher Scientific | 353108 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 5:1000 dilution |
| Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | 1X |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 5:10000 dilution |
| Vitamin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11120-037 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi | Clinisciences | 80826 |
References
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