In vitro en in vivo levering van magnetische nanodeeltjeshyperthermie met behulp van een op maat gemaakt leveringssysteem

Summary

Dit protocol presenteert technieken en methodologie die nodig zijn voor de nauwkeurige afgifte van magnetische nanodeeltjeshyperthermie met behulp van een geavanceerd leverings- en monitoringsysteem.

Abstract

Hyperthermie wordt al lang gebruikt bij de behandeling van kanker. De technieken varieerden van het intratumorale inbrengen van hete ijzerstaven tot systemisch afgeleverde tumorantilichaamgerichte magnetische nanodeeltjes, bij temperaturen van 39 °C (koortsniveau) tot 1.000 °C (elektrocauterie) en behandelingstijden van seconden tot uren. De temperatuur-tijdrelatie (thermische dosis) dicteert het effect met hoge thermische doses die resulteren in de weefselablatie en lagere thermische doses, wat resulteert in subletale effecten zoals verhoogde bloedstroom, accumulatie van geneesmiddelen en immuunstimulatie. Een van de meest veelbelovende huidige medische therapieën is magnetische nanodeeltjeshyperthermie (mNPH). Deze techniek omvat het activeren van magnetische nanodeeltjes, die systemisch of intratumoraal kunnen worden toegediend, met een niet-invasief, niet-toxisch afwisselend magnetisch veld. De grootte, constructie en associatie van de magnetische nanodeeltjes en de frequentie en veldsterkte van het magnetisch veld zijn belangrijke verwarmingsdeterminanten. We hebben geavanceerde instrumentatie en technieken ontwikkeld voor het leveren van reproduceerbare magnetische nanodeeltjeshyperthermie in grote en kleine diermodellen en gekweekte cellen. Deze aanpak, met behulp van continue, real-time temperatuurbewaking op meerdere locaties, maakt de levering van goed gedefinieerde thermische doses aan het doelweefsel (tumor) of cellen mogelijk, terwijl de verwarming van niet-doelweefsel wordt beperkt. Nauwkeurige controle en bewaking van de temperatuur, op meerdere locaties, en gebruik van het industriestandaard algoritme (cumulatieve equivalente minuten bij 43 °C /CEM43), maakt een nauwkeurige bepaling en kwantificering van de thermische dosis mogelijk. Ons systeem, dat een breed scala aan temperaturen, thermische doses en biologische effecten mogelijk maakt, is ontwikkeld door een combinatie van commerciële overnames en interne technische en biologische ontwikkelingen. Dit systeem is geoptimaliseerd op een manier die de snelle conversie tussen ex vivo, in vitro en in vivo technieken mogelijk maakt. Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe een effectieve techniek en systeem voor het leveren van reproduceerbare en nauwkeurige magnetische nanodeeltjestherapie (mNP) hyperthermie kan worden ontworpen, ontwikkeld en geïmplementeerd.

Introduction

Hyperthermie is van oudsher gebruikt in kankertherapie, alleen of in combinatie met andere behandelingen. Hoewel het een lange geschiedenis van gebruik heeft, wordt de meest voordelige methode voor het leveren van deze behandeling nog steeds besproken en is afhankelijk van de locatie en locatie van de ziekte. Methoden voor hyperthermieafgifte omvatten microgolf, radiofrequentie, gerichte echografie, laser en metalen nanodeeltjes (zoals goud of ijzeroxide)1,2,3,4. Deze toedieningsmethoden kunnen leiden tot een reeks behandelingstemperaturen van koortsniveau tot honderden graden C. Het biologische effect van hyperthermie hangt voornamelijk af van de gebruikte temperaturen en de duur van de behandeling⁵. Voor dit manuscript en doel richten we ons op magnetische nanodeeltjeshyperthermie (mNPH). Deze methode maakt gerichte, gelokaliseerde, goed bewaakte en gecontroleerde temperatuurveranderingen mogelijk, met behulp van niet-toxische, door de FDA goedgekeurde nanodeeltjes van ijzeroxide.

Een valkuil van andere hyperthermie-modaliteiten is een gebrek aan nauwkeurige cellulaire targeting; hyperthermie heeft geen inherent hoge therapeutische verhouding, daarom is zorgvuldige thermometrie en targeting noodzakelijk⁶. mNPH maakt systemische of intratumorale injectie van mNP’s mogelijk, waarbij warmte alleen wordt gegenereerd waar de mNP’s zich bevinden, waardoor de behandeling rechtstreeks op de tumor wordt gericht. mNPH kan effectief zijn wanneer de magnetische nanodeeltjes zich binnen of buiten de cel bevinden. Voor kankertherapie is het algemene overzicht van mNPH dat de magnetische nanodeeltjes worden geïnjecteerd (intratumoraal of intraveneus), waarna een wisselend magnetisch veld wordt toegepast, waardoor de magnetische polen van nanodeeltjes voortdurend opnieuw worden uitgelijnd, wat leidt tot een gelokaliseerde verwarming van de cellen en het weefsel geassocieerd met de nanodeeltjes ^7,8 . Door het volume nanodeeltjes en de frequentie/sterkte van het wisselmagnetisch veld (AMF) aan te passen, is het mogelijk om de temperatuur die in het weefsel wordt gegenereerd zorgvuldig te regelen.

Deze behandeling werkt goed in tumoren die zich in de buurt van het lichaamsoppervlak bevinden, omdat diepere tumoren een sterkere AMF vereisen, dus het risico op wervelstroomverwarming neemt toe⁹. Er zijn aanwijzingen dat hyperthermie klinisch wordt gebruikt als monotherapie, maar vaak wordt hyperthermie gecombineerd met bestralingstherapie of chemotherapie, wat leidt tot een meer gericht antikankereffect 10,11,12. Klinisch bewijs van hyperthermie in combinatie met bestralingstherapie is besproken in een eerdere publicatie¹³. Ons lab heeft met succes een verscheidenheid aan dieren behandeld, van muizen tot varkens en spontane hondenkankers, met behulp van de mNPH-methode 12,14,15. Dit protocol is bedoeld voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het onderzoeken van de effecten van gelokaliseerde hyperthermiebehandeling, alleen of in combinatie met andere therapieën.

Een van de belangrijkste factoren bij hyperthermie is het kunnen meten en begrijpen, in realtime, van de thermische dosis die wordt afgeleverd aan het doel / tumorweefsel. Een standaardmethode voor het berekenen en vergelijken van de dosis is door het aantonen van de cumulatieve equivalente minuten van verhitting bij 43 °C; dit algoritme maakt het mogelijk om doses onafhankelijk van het toedieningssysteem, maximale en minimale temperaturen (binnen een specifiek bereik) en heat up/cool down parameters ^5,16 te vergelijken. De CEM-berekening werkt het beste voor temperaturen tussen 39-57 °C⁵. In sommige van de onderzoeken die we hebben uitgevoerd, hebben we bijvoorbeeld gekozen voor een thermische dosis van CEM43 30 (d.w.z. 30 minuten bij 43 °C). Door deze dosis te kiezen, konden we in vitro kijken naar een veilige, effectieve immunogenetische effecten, zowel alleen als in combinatie met een enkele dosis straling¹⁷.

Bij magnetische hyperthermie van nanodeeltjes zijn er verschillende factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het bouwen van een geschikt afgiftesysteem. Het instrumentatieontwerp omvat belangrijke veiligheidsfactoren, zoals het gebruik van een koelmachine om ervoor te zorgen dat de magnetische veldafgifteapparatuur koel blijft, zelfs wanneer deze op hoog vermogen wordt gebruikt, en fail-safe procedures die voorkomen dat het systeem wordt ingeschakeld als niet alle temperatuur-, vermogensbeoordelings- en besturingssystemen zijn geactiveerd. Bovendien zijn er belangrijke biologische factoren waarmee rekening moet worden gehouden voor zowel in vivo als in vitro situaties. Bij het gebruik van gekweekte cellen is het noodzakelijk om te behandelen in groeimedia en op een consistente levensvatbare temperatuur te blijven om fysiologische veranderingen te voorkomen die de resultaten kunnen beïnvloeden. Voor individuele nanodeeltjestypen is het belangrijk om de specifieke absorptiesnelheid (SAR) te kennen bij het berekenen van op AMF gebaseerde verwarmingsparameters. Evenzo is het belangrijk om de mNP / Fe-concentratie te kennen, in cellen en weefsels, die nodig is om de gewenste verwarming te bereiken. In vivo methoden vereisen nog meer aandacht voor detail, omdat het dier tijdens de behandeling onder narcose moet worden gehouden en de kerntemperatuur van het dier gedurende de behandeling op een normaal niveau moet worden gehouden. Het laten dalen van de lichaamstemperatuur van het dier, zoals gebeurt onder anesthesie, kan de algehele resultaten beïnvloeden, met betrekking tot de thermische dosis van het te behandelen weefsel.

In dit manuscript bespreken we de methoden die worden gebruikt om een veelzijdig magnetisch nanodeeltjeshyperthermiesysteem te ontwerpen en te construeren, evenals belangrijke gebruiksfactoren waarmee rekening moet worden gehouden. Het beschreven systeem zorgt voor de robuuste, consistente, biologisch geschikte, veilige en goed gecontroleerde afgifte van magnetische nanodeeltjeshyperthermie. Ten slotte moet worden opgemerkt dat de mNPH-onderzoeken die we uitvoeren vaak betrekking hebben op andere therapieën zoals bestraling, chemotherapie en immunotherapie. Om deze resultaten zinvol te laten zijn, is het belangrijk om te bepalen hoe de geleverde warmte de werkzaamheid en/of veiligheidstoxiciteit van andere modaliteiten (of omgekeerd) en het welzijn van het dier kan beïnvloeden. Om deze reden en de eerder genoemde dosimetrie en therapeutische situaties, is het essentieel om strikte aandacht te besteden aan de nauwkeurigheid van de magnetische nanodeeltjeshyperthermie en de continue kern- en doeltemperatuurmetingen. Het doel van dit protocol is om een eenvoudige, consistente methode en beschrijving te bieden voor de levering van veilige en effectieve magnetische nanodeeltjeshyperthermie.

Protocol

Het Dartmouth College Animal Care and Use Program is geaccrediteerd door de American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) en houdt zich aan alle richtlijnen en voorschriften van UDSA en NIH (Office of Laboratory Animal Welfare). Alle in vivo studies werden goedgekeurd door het Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). De euthanasieprocedure voldoet aan de AVMA-richtlijnen voor de euthanasie van dieren 2020. 1. Instrumentatie/…

Representative Results

In vitro studiesCellen zullen alleen de gewenste temperatuur en thermische dosis bereiken en behouden als de hoeveelheid en concentratie van de magnetische nanodeeltjes / ijzer en de AMF op de juiste manier zijn afgestemd. Bij het gebruik van magnetische nanodeeltjes om cellen in vitro (en in vivo) te verwarmen, moet worden opgemerkt dat om hyperthermie te bereiken in cellen met geïnternaliseerde magnetische nanodeeltjes, een specifiek niveau van intracellulaire mNP / Fe nodig zal zijn, en het aanta…

Discussion

Het ontwerp en de implementatie van dit systeem biedt de mogelijkheid om nauwkeurige en reproduceerbare in vitro en in vivo magnetische nanodeeltjes hyperthermie experimenten uit te voeren. Het is van cruciaal belang dat het systeem zo is ontworpen dat de AMF-frequentie en veldsterkte voldoende zijn afgestemd op het magnetische nanodeeltjestype, de concentratie en de gewenste weefsellocatie en -temperatuur. Bovendien is de nauwkeurige bewaking van de temperatuur in realtime cruciaal voor de veiligheid en de berekening va…

Materials

.25% Trypsin	Corning	45000-664	available from many companies
1.5 mL tubes	Eppendorf	Eppendorf 22363204	available from many companies
B16F10 murine melanoma cells	American Type Culture Collection	CRL-6475
C57/Bl6 mice	Charles river	027C57BL/6	6-week-old female mice
Chiller	Thermal Care	NQ 5 series	chiller that cools the coil
Coolant fluid	Dow Chemical Company	Dowtherm SR-1	antenna cooling fluid
Fetal Bovine serum	Hyclone	SH30071	available from many companies
fiber optic probes, software and chassis	FISO		FISO evolution software used to read the temperatures
IR camera	Flir		infrared camera to monitor unintentional heating
iron oxide nanoparticles	micromod Partikeltechnologie GmbH	Bionized NanoFerrite	dextran coated iron oxide nanoparticles
mouse coil, solenoid	Fluxtrol	custom built
penicillin/streptomycin	Corning	45000-652	available from many companies
RF generator	Huttinger	TIG 10/300	power source
RPMI media	Corning	45000-396	available from many companies