העברת in vitro ו- in vivo של היפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים באמצעות מערכת אספקה שנבנתה בהתאמה אישית
Summary
פרוטוקול זה מציג טכניקות ומתודולוגיות הדרושות להעברה מדויקת של היפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים באמצעות מערכת אספקה וניטור מתוחכמת.
Abstract
היפרתרמיה כבר זמן רב בשימוש בטיפול בסרטן. הטכניקות השתנו מהחדרה תוך-גידולית של מוטות ברזל חמים, לננו-חלקיקים מגנטיים ממוקדי נוגדנים לגידול באופן שיטתי, בטמפרטורות של 39 מעלות צלזיוס (רמת חום) עד 1,000 מעלות צלזיוס (אלקטרוקאוטריה) וזמני טיפול משניות עד שעות. הקשר בין הטמפרטורה לזמן (מינון תרמי) מכתיב את האפקט עם מינונים תרמיים גבוהים וכתוצאה מכך אבלציה של הרקמה ומינונים תרמיים נמוכים יותר וכתוצאה מכך השפעות תת-קטלניות כגון זרימת דם מוגברת, הצטברות של תרופות וגירוי חיסוני. אחד הטיפולים הרפואיים המבטיחים ביותר כיום הוא היפרתרמיה ננו-חלקיקית מגנטית (mNPH). טכניקה זו כוללת הפעלת ננו-חלקיקים מגנטיים, שיכולים להיות מועברים באופן מערכתי או תוך-גופי, עם שדה מגנטי חלופי לא פולשני ולא רעיל. הגודל, המבנה והקשר של הננו-חלקיקים המגנטיים והתדר ועוצמת השדה של השדה המגנטי הם גורמי חימום עיקריים. פיתחנו מכשור וטכניקות מתוחכמות להעברת היפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים הניתנים לשחזור במודלים של בעלי חיים גדולים וקטנים ובתאים בתרבית. גישה זו, תוך שימוש בניטור טמפרטורה רציף בזמן אמת במספר מקומות, מאפשרת מתן מנות תרמיות מוגדרות היטב לרקמת המטרה (הגידול) או לתאים תוך הגבלת חימום רקמות שאינן מטרה. בקרה וניטור מדויקים של הטמפרטורה, במספר אתרים, ושימוש באלגוריתם הסטנדרטי בתעשייה (דקות שוות ערך מצטברות ב- 43 °C / CEM43), מאפשרים קביעה וכימות מדויקים של מינון תרמי. המערכת שלנו, המאפשרת מגוון רחב של טמפרטורות, מינונים תרמיים והשפעות ביולוגיות, פותחה באמצעות שילוב של רכישות מסחריות ופיתוחים הנדסיים וביולוגיים פנימיים. מערכת זו עברה אופטימיזציה באופן המאפשר המרה מהירה בין טכניקות ex vivo, in vitro ו- in vivo. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לתכנן, לפתח וליישם טכניקה ומערכת יעילה להעברת היפרתרמיה של טיפול בננו-חלקיקים מגנטיים (mNP) הניתנת לשחזור ומדויק.
Introduction
היפרתרמיה שימשה בעבר בטיפול בסרטן, לבדה או בשילוב עם טיפולים אחרים. למרות שיש לו היסטוריה ארוכה של שימוש, השיטה הטובה ביותר למתן טיפול זה עדיין נתונה לוויכוח והיא תלויה באתר המחלה ובמיקום. שיטות להעברת היפרתרמיה כוללות מיקרוגל, גלי רדיו, אולטרסאונד ממוקד, לייזר וננו-חלקיקים מתכתיים (כגון תחמוצת זהב או ברזל)1,2,3,4. שיטות אספקה אלה יכולות להוביל למגוון טמפרטורות טיפול מרמת חום ועד מאות מעלות צלזיוס. ההשפעה הביולוגית של היפרתרמיה תלויה בעיקר בטמפרטורות המשמשות ובמשך הטיפול5. לשם כך אנו מתמקדים בהיפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים (mNPH). שיטה זו מאפשרת שינויי טמפרטורה ממוקדים, מקומיים, מנוטרים היטב ומבוקרים, תוך שימוש בננו-חלקיקים לא רעילים, מאושרים על ידי ה-FDA.
מלכודת אחת של אופני היפרתרמיה אחרים היא היעדר מיקוד תאי מדויק; היפרתרמיה אין יחס טיפולי גבוה מטבעו, ולכן, תרמומטריה זהירה ומיקוד הוא הכרחי6. mNPH מאפשר הזרקה מערכתית או תוך-גופית של mNPs, כאשר החום נוצר רק במקום שבו ממוקמים ה-mNPs, ובכך מכוון את הטיפול ישירות לגידול. mNPH יכול להיות יעיל כאשר הננו-חלקיקים המגנטיים ממוקמים בתוך התא או מחוצה לו. עבור טיפול בסרטן, הסקירה הכללית של mNPH היא כי ננו-חלקיקים מגנטיים מוזרקים (תוך כדי או תוך ורידי), ואז מופעל שדה מגנטי לסירוגין, מה שגורם לקטבים המגנטיים של ננו-חלקיקים להתיישר מחדש כל הזמן, מה שמוביל לחימום מקומי של התאים והרקמות הקשורים לננו-חלקיקים 7,8 . על ידי התאמת נפח הננו-חלקיקים והתדר/חוזק של השדה המגנטי המתחלף (AMF), ניתן לשלוט בקפידה בטמפרטורה הנוצרת בתוך הרקמה.
טיפול זה פועל היטב בגידולים הקרובים לפני השטח של הגוף, שכן גידולים עמוקים יותר דורשים AMF חזק יותר ולכן הסיכון לחימום זרם אדי עולה9. ישנן עדויות לשימוש בהיפרתרמיה קלינית כמונותרפיה, אולם לעתים קרובות היפרתרמיה משולבת עם הקרנות או כימותרפיה, מה שמוביל לאפקט אנטי-סרטני ממוקד יותר10,11,12. עדויות קליניות לכך שהיפרתרמיה פועלת בשילוב עם הקרנות נבדקות בפרסום קודם13. המעבדה שלנו טיפלה בהצלחה במגוון בעלי חיים, מעכברים ועד חזירים וסרטן כלבים ספונטני, בשיטת mNPH12,14,15. פרוטוקול זה מיועד למעוניינים לחקור את ההשפעות של טיפול היפרתרמיה מקומי, לבד או בשילוב עם טיפולים אחרים.
אחד הגורמים החשובים ביותר בהיפרתרמיה הוא היכולת למדוד ולהבין, בזמן אמת, את המינון התרמי המועבר לרקמת המטרה/הגידול. דרך סטנדרטית לחישוב והשוואת מינון היא באמצעות הדגמה של דקות שוות ערך מצטברות של חימום ב 43 מעלות צלזיוס; אלגוריתם זה מאפשר השוואה של מנות ללא תלות במערכת האספקה, טמפרטורות מקסימום ומינימום (בטווח מסוים) ופרמטרים לחימום/קירור 5,16. חישוב CEM עובד בצורה הטובה ביותר עבור טמפרטורות בין 39-57 מעלות צלזיוס5. לדוגמה, בחלק מהמחקרים שביצענו, בחרנו מנה תרמית של CEM43 30 (כלומר, 30 דקות ב 43 מעלות צלזיוס). בחירת מינון זה אפשרה לנו להסתכל על השפעות אימונוגנטיות בטוחות, יעילות, במבחנה, הן לבד, והן בשילוב עם מנה אחת של קרינה17.
עם היפרתרמיה ננו-חלקיקית מגנטית, ישנם מספר גורמים שיש לקחת בחשבון בבניית מערכת אספקה מתאימה. תכנון המכשור כולל גורמי בטיחות חשובים, כגון שימוש בצ’ילר כדי להבטיח שציוד אספקת השדה המגנטי יישאר קריר גם כאשר הוא מופעל בהספק גבוה, ונהלים בטוחים לכשל המונעים את הפעלת המערכת אם כל הטמפרטורה, הערכת ההספק ומערכות הבקרה לא הופעלו. בנוסף, ישנם גורמים ביולוגיים חשובים שיש לקחת בחשבון הן עבור מצבים in vivo והן עבור מצבים במבחנה. בעת שימוש בתאים בתרבית, יש צורך לטפל במדיה צמיחה ולשמור על טמפרטורה קיימא עקבית כדי למנוע שינויים פיזיולוגיים שעלולים להשפיע על התוצאות. עבור סוגי ננו-חלקיקים בודדים, חשוב לדעת את קצב הספיגה הספציפי (SAR) בעת חישוב פרמטרי חימום מבוססי AMF. באופן דומה, חשוב לדעת את ריכוז ה-mNP/Fe, בתאים וברקמות, הנחוץ להשגת החימום הרצוי. שיטות in vivo דורשות תשומת לב רבה עוד יותר לפרטים מכיוון שיש לשמור על בעל החיים תחת הרדמה במהלך הטיפול וטמפרטורת הגוף המרכזית של החיה נשמרת ברמה נורמלית לאורך כל הטיפול. מתן אפשרות לטמפרטורת הגוף של בעל החיים לרדת, כפי שקורה בהרדמה, יכול להשפיע על התוצאות הכוללות, ביחס למינון התרמי של הרקמה המטופלת.
בכתב יד זה אנו דנים בשיטות המשמשות לתכנון ובנייה של מערכת היפרתרמיה רב-תכליתית של ננו-חלקיקים מגנטיים, כמו גם בגורמי שימוש חשובים שיש לקחת בחשבון. המערכת המתוארת מאפשרת העברה חזקה, עקבית, מתאימה ביולוגית, בטוחה ומבוקרת היטב של היפרתרמיה ננו-חלקיקית מגנטית. לבסוף, יש לציין כי מחקרי mNPH שאנו עורכים כוללים לעתים קרובות טיפולים אחרים כגון הקרנות, כימותרפיה ואימונותרפיה. כדי שתוצאות אלה יהיו משמעותיות, חשוב לקבוע כיצד החום המועבר יכול להשפיע על היעילות ו/או הרעילות הבטיחותית של שיטות אחרות (או להיפך) ועל רווחת החיה. מסיבה זו והדוזימטריה והמצבים הטיפוליים שהוזכרו קודם לכן, חיוני להקדיש תשומת לב קפדנית לדיוק מינון ההיפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים ולמדידות הליבה וטמפרטורת היעד המתמשכות. מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטה ותיאור פשוטים ועקביים להעברת היפרתרמיה בטוחה ויעילה של ננו-חלקיקים מגנטיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
התכנון והיישום של מערכת זו מספק את היכולת לבצע ניסויים מדויקים וניתנים לשחזור בהיפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים in vivo ו- in vivo. זה קריטי שהמערכת מתוכננת כך שהתדר ועוצמת השדה של AMF יותאמו כראוי לסוג הננו-חלקיקים המגנטיים, לריכוז ולמיקום הרקמה ולטמפרטורה הרצויים. בנוסף, ניטור מדויק של הטמפרטור…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר מומן על ידי מספרי מענקים: NCI P30 CA023108 ו- NCI U54 CA151662.
Materials
| .25% Trypsin | Corning | 45000-664 | available from many companies |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Eppendorf 22363204 | available from many companies |
| B16F10 murine melanoma cells | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| C57/Bl6 mice | Charles river | 027C57BL/6 | 6-week-old female mice |
| Chiller | Thermal Care | NQ 5 series | chiller that cools the coil |
| Coolant fluid | Dow Chemical Company | Dowtherm SR-1 | antenna cooling fluid |
| Fetal Bovine serum | Hyclone | SH30071 | available from many companies |
| fiber optic probes, software and chassis | FISO | FISO evolution software used to read the temperatures | |
| IR camera | Flir | infrared camera to monitor unintentional heating | |
| iron oxide nanoparticles | micromod Partikeltechnologie GmbH | Bionized NanoFerrite | dextran coated iron oxide nanoparticles |
| mouse coil, solenoid | Fluxtrol | custom built | |
| penicillin/streptomycin | Corning | 45000-652 | available from many companies |
| RF generator | Huttinger | TIG 10/300 | power source |
| RPMI media | Corning | 45000-396 | available from many companies |
References
- Chen, X., Tan, L., Liu, T., Meng, X. Micro-Nanomaterials for Tumor Microwave Hyperthermia: Design, Preparation, and Application. Current Drug Delivery. 14 (3), 307-322 (2016).
- Luo, W., et al. Effects of radiofrequency ablation versus other ablating techniques on hepatocellular carcinomas: A systematic review and meta-analysis. World Journal of Surgical Oncology. 15 (1), 126 (2017).
- Ter Haar, G. Heat and sound: Focused ultrasound in the clinic. International Journal of Hyperthermia. 31 (3), 223-224 (2015).
- Salunkhe, A. B., Khot, V. M., Pawar, S. H. Magnetic Hyperthermia with Magnetic Nanoparticles: A Status Review. Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (5), 572-594 (2014).
- Dewhirst, M. W., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hanson, M., Hoopes, P. J. Basic principles of thermal dosimetry and thermal thresholds for tissue damage from hyperthermia. International Journal of Hyperthermia. 19 (3), 267-294 (2003).
- Roizin-Towle, L., Pirro, J. P. The response of human and rodent cells to hyperthermia. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 20 (4), 751-756 (1991).
- Hergt, R., Dutz, S., Müller, R., Zeisberger, M. Magnetic particle hyperthermia: Nanoparticle magnetism and materials development for cancer therapy. Journal of Physics Condensed Matter. 18 (38), (2006).
- Kumar, C. S. S. R., Mohammad, F. Magnetic nanomaterials for hyperthermia-based therapy and controlled drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (9), 789-808 (2011).
- Stigliano, R. V., et al. Mitigation of eddy current heating during magnetic nanoparticle hyperthermia therapy. International Journal of Hyperthermia. 32 (7), 735-748 (2016).
- Johannsen, M., et al. Clinical hyperthermia of prostate cancer using magnetic nanoparticles: Presentation of a new interstitial technique. International Journal of Hyperthermia. 21 (7), 637-647 (2005).
- Horsman, M. R., Overgaard, J. Hyperthermia: a Potent Enhancer of Radiotherapy. Clinical Oncology. 19 (6), 418-426 (2007).
- Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Kaufman, P. A., Hoopes, P. J. Magnetic nanoparticle hyperthermia enhancement of cisplatin chemotherapy cancer treatment. International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 845-851 (2013).
- Peeken, J. C., Vaupel, P., Combs, S. E. Integrating hyperthermia into modern radiation oncology: What evidence is necessary. Frontiers in Oncology. 7, 132 (2017).
- Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Trembly, B. S., Hoopes, P. J. Comparison of magnetic nanoparticle and microwave hyperthermia cancer treatment methodology and treatment effect in a rodent breast cancer model. International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 819-827 (2013).
- Stigliano, R. V., Shubitidze, F., Petryk, A. A., Tate, J. A., Hoopes, P. J. Magnetic nanoparticle hyperthermia: predictive model for temperature distribution. Energy-based Treatment of Tissue and Assessment VII. 8584, 858410 (2013).
- Dewhirst, M., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hoopes, P. J., Hanson, M. A. Thermal dose requirement for tissue effect: experimental and clinical findings. Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment II. 4954, 37 (2003).
- Duval, K. E. A., et al. Immunogenetic effects of low dose (CEM43 30) magnetic nanoparticle hyperthermia and radiation in melanoma cells. International Journal of Hyperthermia. 36, 37-46 (2019).
- Giustini, A. J., Petryk, A. A., Cassim, S. M., Tate, J. A., Baker, I., Hoopes, P. J. Magnetic Nanoparticle Hyperthermia in Cancer Treatment. Nano LIFE. 01, 17-32 (2010).
- Hoopes, P. J., et al. Intratumoral iron oxide nanoparticle hyperthermia and radiation cancer treatment. Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment IV. 6440, (2007).
- Semiatin, S. L., Zinn, S. Coil design and fabrication basic design and modifications. Heat Treating. , 32-41 (1988).
- Maxwell, J. C. On physical lines of force. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 21 (139), 161-175 (1861).
