Summary
このプロトコルは、高度な送達および監視システムを使用して、磁性ナノ粒子温熱の正確な送達に必要な技術と方法論を提示します。
Abstract
温熱療法は癌の治療に長い間使用されてきました。技術は、高温の鉄棒の腫瘍内挿入から、39°C(発熱レベル)から1,000°C(電気焼灼)の温度および数秒から数時間の治療時間での全身送達腫瘍抗体標的磁性ナノ粒子までさまざまです。温度-時間関係(熱線量)は、組織のアブレーションをもたらす高熱線量と、血流の増加、薬物の蓄積、免疫刺激などの亜致死効果をもたらす低熱線量での効果を決定します。現在最も有望な治療法の1つは、磁性ナノ粒子温熱療法(mNPH)です。この技術は、非侵襲的、非毒性の交流磁場で全身的または腫瘍内に送達され得る磁性ナノ粒子を活性化することを含む。磁性ナノ粒子のサイズ、構造、会合、および磁場の周波数と電界強度は、主要な加熱決定要因です。私たちは、大小動物モデルや培養細胞に再現性のある磁性ナノ粒子ハイパーサーミアを提供するための高度な機器と技術を開発しました。このアプローチは、複数の場所で継続的なリアルタイムの温度モニタリングを使用して、非標的組織の加熱を制限しながら、標的組織(腫瘍)または細胞に明確に定義された熱線量を送達することを可能にします。複数のサイトでの温度の正確な制御と監視、および業界標準のアルゴリズム(43°C/CEM43での累積等価分)の使用により、熱線量の正確な決定と定量化が可能になります。さまざまな温度、熱線量、生物学的効果を可能にする当社のシステムは、商業的買収と社内のエンジニアリングおよび生物学の開発を組み合わせて開発されました。このシステムは、エキソビボ、インビトロ、およびインビボ技術間の迅速な変換を可能にする方法で最適化されています。このプロトコルの目的は、再現性のある正確な磁性ナノ粒子療法(mNP)温熱療法を提供するための効果的な技術とシステムを設計、開発、および実装する方法を実証することです。
Introduction
温熱療法は歴史的に、単独で、または他の治療法と組み合わせて、癌治療に使用されてきました。それは長い使用の歴史を持っていますが、この治療を提供するための最も有利な方法はまだ議論されており、病気の部位と場所に依存します。温熱伝導の方法には、マイクロ波、高周波、集束超音波、レーザー、および金属ナノ粒子(金や酸化鉄など)が含まれます1,2,3,4。これらの送達方法は、発熱レベルから数百°Cまでの範囲の治療温度につながる可能性があります。温熱療法の生物学的効果は、主に使用される温度と治療期間に依存します5。この論文と目的のために、磁性ナノ粒子ハイパーサーミア(mNPH)に焦点を当てています。この方法では、毒性のないFDA承認の酸化鉄ナノ粒子を使用して、焦点を絞って局所化し、十分に監視し、制御した温度変化を可能にします。
他の温熱療法の落とし穴の1つは、正確な細胞ターゲティングの欠如です。温熱療法は本質的に高い治療比を持たないため、慎重な体温測定とターゲティングが必要です6。mNPHは、mNPの全身的または腫瘍内注射を可能にし、mNPが位置する場所でのみ熱が発生するため、腫瘍に直接治療を標的にします。mNPHは、磁性ナノ粒子が細胞の内側または外側にある場合に有効です。癌治療の場合、mNPHの一般的な概要は、磁性ナノ粒子が注入され(腫瘍内または静脈内に)、次に交番磁場が印加され、ナノ粒子磁極が絶えず再整列し、ナノ粒子に関連する細胞および組織の局所的な加熱をもたらすことです7,8.ナノ粒子の体積と交流磁場(AMF)の周波数/強度を調整することにより、組織内で発生する温度を注意深く制御することができます。
この治療法は、より深い腫瘍がより強いAMFを必要とするため、渦電流加熱のリスクが高まるため、体表面近くの腫瘍でうまく機能します9。ハイパーサーミアが単剤療法として臨床的に使用されているという証拠がありますが、多くの場合、ハイパーサーミアは放射線療法または化学療法と組み合わされ、より標的を絞った抗がん効果につながります10,11,12。放射線療法と組み合わせて機能する温熱療法の臨床的証拠は、以前の出版物でレビューされています13。私たちの研究室では、mNPH法12,14,15を用いて、マウスからブタ、イヌの自然がんまで、さまざまな動物の治療に成功しています。このプロトコルは、単独で、または他の治療法と組み合わせて、局所的な温熱療法の効果を調査することに関心のある人のために設計されています。
温熱療法の最も重要な要素の1つは、標的/腫瘍組織に送達される熱線量をリアルタイムで測定および理解できることです。線量を計算および比較する標準的な方法は、43°Cでの加熱の累積等価分数のデモンストレーションによるものです。このアルゴリズムは、送達システム、最高温度および最低温度(特定の範囲内)、および加熱/冷却パラメータ5,16とは無関係の用量の比較を可能にする。CEM計算は、39〜57°C5の温度に最適です。たとえば、私たちが実施したいくつかの研究では、CEM43 30(つまり、43°Cで30分)の熱線量を選択しました。この線量を選択することで、単独で、または単回線量の放射線と組み合わせて、in vitroで安全で効果的な免疫遺伝学的効果を調べることができました17。
磁性ナノ粒子温熱療法では、適切な送達システムを構築する際に考慮する必要があるいくつかの要因があります。計装設計には、高電力で動作している場合でも磁場供給装置を冷却するためのチラーの使用や、すべての温度、電力評価、および制御システムがアクティブになっていない場合にシステムの電源がオンにならないようにするフェイルセーフ手順など、重要な安全要素が含まれています。さらに、in vivoとin vitroの両方の状況で考慮する必要がある重要な生物学的要因があります。培養細胞を使用する場合、結果に影響を与える可能性のある生理学的変化を避けるために、増殖培地で処理し、一定の生菌温度に維持する必要があります。個々のナノ粒子タイプについては、AMFベースの加熱パラメータを計算する際に比吸収率(SAR)を知ることが重要です。同様に、所望の加熱を達成するために必要な細胞および組織中のmNP/Fe濃度を知ることも重要である。in vivo法では、治療中は動物を麻酔下で維持し、治療中は動物の深部体温を正常なレベルに維持する必要があるため、細部にさらに注意を払う必要があります。麻酔下で起こるように、動物の体温を下げることを許容することは、治療される組織の熱線量に関して、全体的な結果に影響を与える可能性があります。
この原稿では、汎用性の高い磁性ナノ粒子ハイパーサーミアシステムの設計と構築に使用される方法と、考慮する必要のある重要な使用要因について説明します。記載されたシステムは、磁性ナノ粒子温熱療法の堅牢で、一貫性があり、生物学的に適切で、安全で、十分に制御された送達を可能にする。最後に、私たちが実施するmNPH研究には、放射線療法、化学療法、免疫療法などの他の治療法が含まれることが多いことに注意してください。これらの結果が意味のあるものであるためには、供給された熱が他のモダリティの有効性および/または安全性毒性(またはその逆)および動物の幸福にどのように影響するかを判断することが重要です。このため、前述の線量測定および治療状況のために、磁性ナノ粒子温熱療法の投与精度と連続的なコアおよびターゲット温度測定に厳密に注意を払うことが不可欠です。このプロトコルの目標は、安全で効果的な磁性ナノ粒子温熱療法の送達のための簡単で一貫した方法と説明を提供することです。
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Protocol
ダートマス大学のアニマルケアおよび使用プログラムは、米国実験動物ケア認定協会(iAAALAC)の認定を受けており、すべてのUDSAおよびNIH(実験動物福祉局)のガイドラインおよび規制に準拠しています。すべてのin vivo研究は、ダートマス大学施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。安楽死の手順は、動物の安楽死に関する2020年のAVMAガイドラインに準拠しています。
1. システムの計装/設計
- カスタムAMFアンテナ(コイル)を閉ループになるように設計し、目的の磁場を作成するための形状を選択します。発電機の選択によるインダクタンス式と特性を使用して、互換性のあるコイルを設計し、目的のフィールドを生成します。in vitro実験とin vivo実験に異なるデザインを使用してください。
- AMFアンテナのインダクタンスが発電機の許容範囲内にあることを確認してください。コンデンサを加算または減算して、アンテナを発電機に一致(調整)します。
- in vitro実験では、内径2 cm、長さ14 cmの14ターンヘリカルコイルを設計し、1.5 mLチューブを含めることができ、複数のサンプルを同時に処理できます。コイルをビニールポリマーで絶縁し、ポリスチレンスペーサーを使用してコイルをチューブから分離します。設計仕様と考慮事項の詳細は、 補足ファイル1に記載されています。
- in vivo実験では、独自の設計情報を持つメーカーからカスタムメイドの全身ヘリカルコイルを入手してください。8 mm角のチューブ(コイルのボア内でより均一な磁場を作成するため)と、目的の治療領域にコンセントレータを使用します。コンセントレーターを長さ5.0cmにし、合計5回転させて内径3.6 cm、外径5.2 cmにし、目的の治療領域にその位置を配置します。コイルをポリカーボネートシェルで囲みます。
- 電源として定格10kW以上の調整可能な電力と周波数を備えたAMF発電機を使用してください。インダクタンスは、電源とアンテナ/コイルを0.62〜1.18μHenries(μH)の範囲に一致させ、30〜300kHzの範囲の周波数を可能にします。50psiに調整された圧力ブーストポンプを介してリサイクル水を使用して発電機を冷却します。
- AMFアンテナを介して水で希釈された5.6%エチレングリコールベースの熱伝達流体をポンプで送る25トンの冷却能力チラーでコイルを冷却します。チラーの温度を、アンテナがサンプルを加熱または冷却しないように設定します。
- 動物の収容のために、ホルダーとコイル表面の間に0.5cmのエアギャップがあるコイルの中央に吊り下げることができる管状ホルダーを構築します。コイルの周りのシェルを通して空気を循環させる調整可能な調整済みエアポンプを接続し、通常の動物のコア温度を維持するように設定します。麻酔器を動物の頭の近くの管状の動物ホルダーに接続して、麻酔が適切に行われるようにします。
- セル封じ込めのために、水浴からの水をチューブが配置されているスペーサーを通して循環させる装置を作成します。チューブが水に囲まれるようにこのウォーターバスの温度を37°Cに設定します。
- 光ファイバープローブを使用して、腫瘍、動物のコア、および動物環境内の温度を監視したり、in vitro研究のために、細胞ペレットの温度とチューブの周囲の水をモニターしたりします。
- すべての実験で100nmサイズの磁性酸化鉄ナノ粒子を使用してください。
注:濃度と比吸収率(SAR)は、可能な加熱と熱線量に直接影響するため、ナノ粒子を選択する際に考慮しなければならない2つの特性です18。
2.インビトロでの温熱療法
- B16F10マウスメラノーマ細胞をRPMI培地で10%FBSおよび1%ペン/連鎖球菌で培養します。150, 000細胞/ウェルを6ウェルプレートにプレートし、2mLの完全培地を入れます。
- 各ウェル、すなわち、mNPがなくAMFがない細胞、mNPがなくAMFがない細胞、mNPがなくAMFがない細胞、mNPとAMFがある細胞など、適切な治療法を決定します。
注:さらに、温熱療法を別の治療法と組み合わせる場合は、適切なコントロールがあることを確認してください。AMFは、必要な電力および冷却機能を備えた標準的な研究ベンチラボで実行されます。 - めっきの24時間後、前のステップで決定したように、mNPを適切なウェルに追加します。mNPを3 mgの鉄/ mLの濃度に添加します。.ストック培地/mNP溶液を作成するか(古い培地を除去し、この溶液を追加する)、またはmNPを直接穏やかに旋回させるプレートを追加して均質に分配することにより、mNPがウェル全体に分布していることを確認します。
- mNPを添加してから48時間後、ウェルが~80%コンフルエントになったら、培地を除去し、ウェルを新鮮な培地で洗浄して処理を開始します。メディアを取り出します。
- 処理する各ウェルに0.5 mLのトリプシンを加え、穏やかに渦巻きます。顕微鏡を使用して、細胞が剥離していることを確認します。
- 各ウェルに1 mLの培地を加えて、細胞を1.5 mLチューブに回収します。ウェルからすべての細胞を採取します(~1 x 106 細胞)。ウェルごとに明確にラベル付けされた個別のチューブを使用してください。
- チューブを60 x g で2〜3分間スピンして、細胞をペレット化させます。ペレットを培地に保持します。
- コイル内の水で満たされたスペーサーにチューブを配置します。培地および細胞ペレットが37°Cに維持されるように水浴の温度を設定する。 別々の光ファイバー温度プローブを使用して、チューブとウォーターバス内の温度を監視します。
- チラーの電源を入れ、クーラントがコイルを通って流れていることを確認します。電源をオンにし、目的のフィールドに対する最大値のパーセントを調整します。10 kWの発電機を動力源とする14ターンソレノイドコイルを165 kHzおよび23.87 kA / m(300 Oe)で操作します。
- 別の光ファイバー温度プローブをチューブの1つに配置します。以前に決定されたプロトコル熱線量まで細胞を処理する。例は、43°Cで30分です(CEM43の30)。
- チューブ内の培地に細胞を再懸濁し、新しい6ウェルプレートに再プレートします。新しいプレートに明確なラベルを付けます。目標は、収集されたすべての細胞(~1 x 106 セル)を再プレートすることです。
注:新しい6ウェルプレートを使用して、培養する細胞が処理を受けていることを確認する必要があります。古いプレートを使用した場合、トリプシン処理に成功しなかった細胞がプレートに残っている可能性があります。 - 必要に応じて、次の実験手順のために、RNAまたはタンパク質発現分析のために細胞を溶解します。
3.生体内温熱療法
- 細胞培養と接種
- B16F10マウスメラノーマ細胞をRPMI培地で10%FBSおよび1%ペン/連鎖球菌で培養します。希望する数の動物を接種するのに十分な細胞を提供するプレート/皿を使用してください。例えば、100, 000細胞で播種された10, 100 mmディッシュは、48時間以内に20匹のマウス注射に十分な細胞とコンフルエントになります。
- 細胞をトリプシン処理し、純粋なRPMI培地(FBSまたはペン/連鎖球菌を含まない)を使用して収集します。
- 細胞をカウントし、接種量とマウス数に基づいて、所望の細胞濃度の溶液を作成します。
- 気化したイソフルランと酸素を使用して、6週齢の雌C57Bl / 6マウスを麻酔します。誘導されるまで、動物を5%イソフルランと95%酸素を含むプレキシガラスボックスに入れます。.誘導されたら、動物を取り除き、2%イソフルランでフェイスコーンを使用して、ステップ3.1.5-3.1.7および3.3.3-3.3.6を完了します。
注:治療中の麻酔には、内蔵の麻酔封じ込めを使用してください。マウス麻酔のための標準的な施設プロトコルに従ってください。動物実験の前に、適切なIACUCの承認を確認してください。麻酔後、動物をケージに戻し、回復を監視して合併症がないことを確認します。 - 右反射神経に対する反応の欠如を確認します。
- 電気かみそりを使用して右脇腹を剃ります。
- アルコールワイプで注射部位を清掃します。1〜2 x 106 細胞を注入し、28 G針を備えた100 μLのガラスシリンジを使用して、麻酔をかけた右脇腹の皮内に50 μLの培地に分散させます。
- 腫瘍増殖/ナノ粒子注入
- ノギス(長さ、幅、深さ)を使用して腫瘍を3次元で測定し、(長さx幅x深さx深さx π)/ 6で体積を計算します。
- 腫瘍体積が120 mm 3(+/- 20 mm3)に達したら、動物を研究対象にします。併用療法コホート(すなわち、対照、mNPH、放射線、および組み合わせ)を含む適切な対照群と治療群があることを確認して、研究を設計します。
- 3.1.4で説明されているように、mNPを投与されるマウスを麻酔します。
- アルコールワイプでその領域をきれいにします。AMF治療の3時間前にmNPを腫瘍に注射します。用量が7.5mgの鉄/ cm3 の腫瘍であるような量を注入する。
注:ラボからの未発表データは、最大mNP取り込みが3〜6時間で起こることを示唆しています。
- AMF治療
- マウスを麻酔し、コア温度を維持するために加熱パッドに置きます。
- 右反射神経に対する反応の欠如を確認します。マウスのイヤータグまたはその他の金属物を取り外します。
- 潤滑された光ファイバー温度プローブをマウスの直腸にそっと置きます。
- カテーテルを腫瘍に挿入し、針を取り除きます。腫瘍からあまり突き出ないようにカテーテルを切断します。
注:光ファイバー温度カテーテルは、マウスが全身麻酔下にある間、つまり、腫瘍加熱手順中にのみカテーテルが所定の位置にある間に配置および除去されます。マウスには、手順時にNSAID鎮痛薬であるケトプロフェン(5 mg / kg)の単回皮下投与が与えられます。カテーテルの留置に関連する短期または長期の不快感または罹患率は観察されていません。 - 3センサーの光ファイバー温度プローブをカテーテルに挿入します。カテーテルは、光ファイバー温度プローブセンサーを保護します。
- 直腸および腫瘍内プローブを動物の尾にテープで固定して、それらが所定の位置に留まるようにします。
- マウスを50 mLチューブに入れ、頭を下に向けてください。チューブには、麻酔が接続されて配信される頭の近くに穴が必要です。
- セットアップされたコイル内にチューブを配置し、麻酔を再接続します。
- 光ファイバー温度プローブをチューブに緩く配置して、環境温度を測定します。
- チラーの電源を入れ、クーラントが循環していることを確認します。
- コンピュータソフトウェアがさまざまな温度を表示していることを確認し、CEM43計算をリアルタイムで表示できるように記録を開始します。必要なCEM43は、以前に決定された用量です。
注意: 磁石をオンにする前に、金属物が急速に熱くなるため、動物に金属物が付着していないことを確認してください。さらに、部屋の全員がペースメーカーを持っていないこと、そして彼らがそこにいても安全であることを確認してください。 - 低電力パーセンテージで磁石をオンにします。
- 光ファイバー温度プローブが温度変化を記録していることを確認します。フィールドが増加するにつれてAMFがアクティブになると、温度は上昇します。動物のコア温度が38°Cのままであることを確認してください。 調整されたエアジャケットを使用してコア温度を調整します。
- 腫瘍の温度レベルを制御する内蔵の制御ダイヤルを使用して、発電機の電源を変更することにより、磁場の強さを調整します。
- AMFを一度所望の用量で遮断することは、使用者によって予め決定されるように(例えばCEM43 40)、腫瘍内で達成される。
- AMFがシャットダウンしたら、コイルからチューブを取り外します。
- マウスをチューブから取り外し、さまざまなプローブとカテーテルを抽出します。必要に応じて、新しい金属製の耳タグで動物にタグを付けます。
- 処理が完了したら、チラーをシャットダウンします。
- 動物を麻酔から回復させ、合併症がないことを確認します。彼らの行動を監視して、正常に戻ることを確認します。
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Representative Results
インビトロ研究
細胞は、磁性ナノ粒子/鉄とAMFの量と濃度が適切に一致している場合にのみ、所望の温度と熱線量を達成および維持します。磁性ナノ粒子を使用してin vitro(およびin vivo)で細胞を加熱する場合、内部化された磁性ナノ粒子を有する細胞で温熱を達成するためには、特定のレベルの細胞内mNP / Feが必要であり、mNP負荷細胞の数と近接性が必要になることに注意してください。標的細胞/組織内のmNP / Feのレベルが加熱効果を達成するのに十分である場合、磁場の周波数と強度を調整して、目的の温度と効果を達成できます。適切にメッキされれば、異なる用量とタイミングの間の遺伝的および分子的違いを調べるさらなる研究を追求することができます17。図1は、インビトロ法の概略 図 を表す。
これらのin vitroメソッドは、細胞のmRNAおよびタンパク質発現変化を調べるために使用できます。私たちの研究室の最近の例では、CEM43 30 mNPH処理、8 Gy放射線治療、および組み合わせ後の免疫遺伝学的差異が決定されました。免疫経路と細胞毒性経路の発現の類似点と相違点を特定し、効果の背後にあるメカニズムと、それらがどのように相乗的に組み合わされるかをよりよく理解することができました17。すべての実験では、さまざまな環境および加熱されたコントロールサンプルを利用します。対照は、温熱療法を受けている対照と比較して、異なるmRNAおよびタンパク質発現レベルを有する。
インビボ試験
in vivo研究では、追加の考慮事項があります。目標熱線量に関係なく、治療対象の動物の生理学的に許容可能なコア温度を維持することが絶対に不可欠です。.これは、深部体温がすぐに失われる可能性があるため、麻酔下のげっ歯類では困難な場合があります(加熱パッドなどの深部温度調節技術が必要になることがよくあります)。体温が正常よりも低いと、AMF-mNPHを過度に押し出す必要が生じる可能性があり、腫瘍内で特定の熱線量を達成しようとすると、非標的組織において許容できない影響をもたらす(非標的組織渦電流加熱はそのような可能性の1つである)。深部体温のわずかな偏差でさえ、腫瘍または正常組織に望ましくない生理学的合併症を引き起こす可能性があります。前述のように、繰り返しますが、正確で再現性のある加熱を行うには、mNP / Fe組織濃度、AMF周波数、および電界強度温度モニタリングパラメータと、ターゲット組織のサイズと深さを一致させることが不可欠です。測定可能な加熱を可能にするために、腫瘍内にmNPのベースライン濃度がなければなりません。熱のレベル/能力は、mNP組織濃度(mg Fe / g組織)および腫瘍内のそれらの相対分布だけでなく、AMFの頻度およびその後の電界強度にも依存する。上記のいずれかの変化は、組織内の達成可能な温度の異なる範囲につながる可能性があります。長年の経験を通じて、前臨床腫瘍治療に使用する濃度とAMFシステムの頻度と電界強度を最適化し、安全で効果的な活性化を可能にしました。すべての組織部位の温度/熱線量を測定することは不可能であるため、 図2に示すように、リアルタイムの有効性と安全性の評価を可能にする戦略的な場所にできるだけ多くの光ファイバー温度プローブを配置することも不可欠です。これらのプローブは、実験全体の温度の記録を可能にし、実験の正確な線量測定と熱履歴を可能にします。 図3 は、in vivo実験中に生成された曲線を示しており、温度を綿密に監視し、腫瘍の温度を所望の範囲内に維持するようにシステムを調整する機能を強調しています。 図4 は、in vivoの方法をまとめたものである。
これらのin vivo法は、in vitro法と同様に、異なる癌の種類、異なる温熱療法の用量、およびさまざまな組み合わせ治療を調査するために使用できます。たとえば、私たちの研究室での以前の研究では、温熱療法と化学療法の組み合わせを調査してきました12。また、有効性や分子機構の解明のために、数多くの温熱療法や放射線実験も行っています。これらの実験のための対照マウスは、温熱療法の実際の生成を除くすべての手順を受ける。 図5 には、in vitroおよびin vivo mNPハイパーサーミア処理(mNPH)後に発現差のある遺伝子を示す2つの火山プロットが含まれています。これらの図は、温熱療法の効果を監視するために分子技術を使用する方法の例です。
図1:インビトロmNP温熱療法の概略図。 この回路図は、in vitro磁性ナノ粒子温熱療法の方法を示しています。加熱を確実に行うために、細胞は適切なmNP取り込みのために十分な粒子および時間を提供しなければならない。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:温度監視用のカテーテルの配置。 この図は、腫瘍および/または腫瘍領域のさまざまな場所で温度を記録するために光ファイバー温度プローブを収容するカテーテルの配置を示しています。この図は参考文献19から適応されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウス腫瘍の治療中のリアルタイムの温度モニタリング。 このグラフは、in vivo実験中に、腫瘍内の深部体温、環境温度、および複数の温度を監視できるリアルタイムの温度測定値を示しています。腫瘍内の温度の制御は、図の拡大部分の最小の大規模な変動によって実証されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:インビボmNPハイパーサーミア回路図。 この回路図は、生体内磁性ナノ粒子温熱療法の方法を示しています。十分なナノ粒子の注入、ならびに分布および吸収のための十分な時間は、所望の熱線量を供給する能力を保証する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:遺伝子発現の違い。 インビトロ(A)およびインビボ(B)mNP温熱療法に続く遺伝子発現差。これらの火山プロットは、in vitroおよびin vivo mNPH法の両方について、log2のx軸に遺伝的変化を表し、y軸に有意性を示します。各円は異なる遺伝子を表し、20個の最も重要な発現差のある遺伝子が標識されています。遺伝子がx軸のゼロから離れるほど、倍率の変化が大きくなり、y軸の遺伝子が高いほど、p値は低くなります。どちらも同じ熱線量でしたが、in vivo温熱療法はin vitroよりも大きな遺伝子発現変化をもたらしました。これらのプロットは、記載されたプロトコルを用いて生成することができる生物学的データの例である。in vitro火山プロットは、ref.17から適応されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このシステムの設計と実装は、正確で再現性のあるin vitroおよびin vivo磁性ナノ粒子ハイパーサーミア実験を実施する能力を提供します。AMFの周波数と電界強度が磁性ナノ粒子の種類、濃度、および組織の位置と温度に適切に一致するようにシステムを設計することが重要です。さらに、リアルタイムで温度を正確に監視することは、安全性と正確な熱線量(43°C/ CEMでの累積等価分)の計算にとって非常に重要です。図 1に示すようにプローブを配置することで、 図2に示すように、熱線量と深部体温をリアルタイムで監視できます。
磁性ナノ粒子ハイパーサーミアの正確な送達の最初のステップは、動物とオペレーターにとって安全なシステムを構築することです。システムのすべてのコンポーネントは、運用と配信の観点からもよく理解する必要があります。この状況では、AMF渦電流の可能性を理解し、磁性粒子がどこにあるかを知ることを意味します。アンテナ、またはコイルは、フィールドの形状と強度の重要な要素であり、使用される冷却システムは、コイルの過熱を防ぐために重要です20。導体の外側の電界強度は、導体を流れる電流強度に正比例します。導体の周囲の空間の任意の点での磁場強度は、周囲の領域の導体によって生成される磁場のベクトル和です。磁場は電流の流れに対して直角に生成され、ビオ・サバール逆二乗法則21に従って、導体からの距離の関数として強度が指数関数的に減少します。したがって、正方形のチューブは、コイル内のより均一な磁場のためのin vivo温熱療法に使用されます。潜在的に臨床的に関連するシステムに必要な強度と体積の磁場を生成するには、高い電流が必要です。したがって、アンテナ設計は、かなりの電力レベルに対応できる必要があります。また、AMFアンテナは、インダクタンスが発電機の許容範囲内に収まるように設計する必要があります。通常使用される周波数では、電流の大部分はアンテナ導体の表面に流れるため、表面は抵抗加熱に影響を与えますが、表面の欠陥を排除することで最小限に抑えることができます。この抵抗加熱は、コイルと環境が過熱しないようにするためにコイル冷却システムが必要であることも意味します。
私たちのシステム設計の制限は、周波数と磁場の全範囲を許可しないことですが、細胞、げっ歯類、大型動物に適した磁場を生成することはできます。具体的には、誘導加熱システムから利用可能な最大電界強度は、アンテナ(コイル)に流れる電流に直接関係しています。AMF発電機の定格はキロワットで、利用可能な電圧に利用可能な電流(アンペア)を掛けて計算されます。したがって、500 V制限の10kWシステムの最大アンペア数は20 Aになります。コイルの設計は、どの制限に最初に到達するかを決定し、したがってシステムの制限を決定します。電流によって生成される磁場強度は、導体からの距離の関数として指数関数的に減少します。したがって、同じシステム上で動作する小径コイルと同じ形状の直径の大きいコイルは、コイルの中心での電界強度が低くなります。したがって、必要な磁場のサイズと強度は、AMFジェネレーターの容量によって制限されます。より大きなコイルを構築し、より多くの電力を使用すると、主に渦電流加熱などの追加の懸念が生じます。
このシステムを使用してユーザー、動物、およびシステム自体を保護する場合に対処する必要があるいくつかの安全上の懸念があります。第一に、麻酔の使用中は適切な室内換気を維持しなければならない。第二に、コイルに関連するすべての領域には、高生理食塩水混合物を含む金属や導体がないようにする必要があります。AMFを回避するときは、ユーザーは指輪やその他の宝石を取り外す必要があり、サンプルにはいかなる種類の金属も含まれていてはなりません。最も重要なのは、ペースメーカーやその他の埋め込み型デバイスや物体を使用している人は、AMFを回避する前に医師に相談する必要があります。システムを保護するために、電源が供給される前に発電機とコイルの冷却ニーズが満たされていることを確認するフェイルセーフシステムを使用する必要があります。さらに、赤外線カメラの概要を使用して、意図しない加熱を検出する必要があります。
in vitro研究の場合、従うべき最も重要なステップは、細胞内の鉄の濃度、細胞の濃度、AMFパラメータ、および熱線量評価です。細胞は、磁性ナノ粒子を上清、細胞、またはその両方に配置することにより、磁性ナノ粒子温熱療法で処理/加熱することができます。磁性ナノ粒子の加熱量は、磁性ナノ粒子/ Feのレベルに依存します。細胞のみを内在化した鉄で治療したい場合、私たちの経験では、個々の癌細胞は限られた数の磁性ナノ粒子しか取り込まず、取り込みが最適な場合でも、最適化されたAMFを使用しても、細胞を凝集/ペレット化して細胞加熱状況を作り出す必要があります。培地と細胞の温度を生物学的に関連するレベルに維持することも(加熱されていない場合)、真の加熱を正確に測定するために重要です。ここで説明する14ターンソレノイドコイルは、サンプルを熱制御された水柱に沈めることにより、生物学的に関連する温度を維持することを可能にします。
in vivo研究では、動物の深部温度を維持し、腫瘍内の温度を正確に測定することが重要な要素です。この動物の封じ込めシステムとコイルの設計は、コイル/電力設定による動物の環境の熱ドリフトを排除し、正常な深部体温を維持するのに役立ちます。体深部温度を維持することは、有意義な実験結果を得るために重要です。直腸プローブにより、動物の深部温度をリアルタイムで監視できます。麻酔下にあるとき、動物の深部温度は本質的に低下します。そこで、動物格納容器の周囲に温風を送り込み、コア温度を正常範囲内に維持する環境加熱システムを開発しました。正常なコア温度を維持することは、ハイパーサーミア治療の結果を正確に解釈し、環境要因を排除するために不可欠です。標的組織/腫瘍の複数の部位に温度モニタリングプローブを配置することは、達成された温度と熱線量を正確に評価するために重要です。磁性ナノ粒子を腫瘍内に均一に分布させることは不可能ではないにしても非常に困難であるため、複数の部位の加熱パラメータを知ることは、一貫した正確な組織/腫瘍の熱線量を達成するために不可欠です。インビトロおよびインビボ研究の濃度は可変であることに注意することが重要です。この変動は、細胞がmNPへのアクセスが多い細胞との細胞培養の境界が少ないため、より低い濃度を使用できるためです。in vivoでは、腫瘍の不均一性および複雑な3D形態のために、より高い濃度が必要である。したがって、in vivoとin vitroで同じ濃度の粒子を使用すると、細胞に取り込まれることがはるかに少なくなります。
この原稿では、磁性ナノ粒子温熱療法のための効果的で柔軟な交流磁場発生器およびコイルシステムを開発するために必要なパラメータと機器について説明します。このシステムは、インビトロおよびインビボ研究の両方に使用できます。このシステムは、局所的/標的化された温熱療法と正常組織の温存に効果的であり、他のAMF-mNP温熱療法システムと比較して魅力的です。これらの温熱療法は、さまざまなナノ粒子またはナノキャリアおよび補助治療を使用して、さまざまな用量の効果を調査するために変更することができます。組織の加熱、特に磁性ナノ粒子の加熱は非常に多くの変数の影響を受ける可能性があるため、調査ではパラメータを理解することが不可欠です。これらの基準が満たされれば、磁性ナノ粒子温熱療法は、独立したアジュバント腫瘍制御を含む、多くの分子、細胞、および臨床状況に対処することができる。ここで説明する方法は多大な労力を必要としますが、ガイドラインに従えば、mNP温熱療法の可能性を最大限に引き出すことができます。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、助成金番号(NCI P30 CA023108およびNCI U54 CA151662)によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| .25% Trypsin | Corning | 45000-664 | available from many companies |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Eppendorf 22363204 | available from many companies |
| B16F10 murine melanoma cells | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| C57/Bl6 mice | Charles river | 027C57BL/6 | 6-week-old female mice |
| Chiller | Thermal Care | NQ 5 series | chiller that cools the coil |
| Coolant fluid | Dow Chemical Company | Dowtherm SR-1 | antenna cooling fluid |
| Fetal Bovine serum | Hyclone | SH30071 | available from many companies |
| fiber optic probes, software and chassis | FISO | FISO evolution software used to read the temperatures | |
| IR camera | Flir | infrared camera to monitor unintentional heating | |
| iron oxide nanoparticles | micromod Partikeltechnologie GmbH | Bionized NanoFerrite | dextran coated iron oxide nanoparticles |
| mouse coil, solenoid | Fluxtrol | custom built | |
| penicillin/streptomycin | Corning | 45000-652 | available from many companies |
| RF generator | Huttinger | TIG 10/300 | power source |
| RPMI media | Corning | 45000-396 | available from many companies |
References
- Chen, X., Tan, L., Liu, T., Meng, X. Micro-Nanomaterials for Tumor Microwave Hyperthermia: Design, Preparation, and Application. Current Drug Delivery. 14 (3), 307-322 (2016).
- Luo, W., et al. Effects of radiofrequency ablation versus other ablating techniques on hepatocellular carcinomas: A systematic review and meta-analysis. World Journal of Surgical Oncology. 15 (1), 126 (2017).
- Ter Haar, G. Heat and sound: Focused ultrasound in the clinic. International Journal of Hyperthermia. 31 (3), 223-224 (2015).
- Salunkhe, A. B., Khot, V. M., Pawar, S. H. Magnetic Hyperthermia with Magnetic Nanoparticles: A Status Review. Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (5), 572-594 (2014).
- Dewhirst, M. W., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hanson, M., Hoopes, P. J. Basic principles of thermal dosimetry and thermal thresholds for tissue damage from hyperthermia. International Journal of Hyperthermia. 19 (3), 267-294 (2003).
- Roizin-Towle, L., Pirro, J. P. The response of human and rodent cells to hyperthermia. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 20 (4), 751-756 (1991).
- Hergt, R., Dutz, S., Müller, R., Zeisberger, M. Magnetic particle hyperthermia: Nanoparticle magnetism and materials development for cancer therapy. Journal of Physics Condensed Matter. 18 (38), (2006).
- Kumar, C. S. S. R., Mohammad, F. Magnetic nanomaterials for hyperthermia-based therapy and controlled drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (9), 789-808 (2011).
- Stigliano, R. V., et al. Mitigation of eddy current heating during magnetic nanoparticle hyperthermia therapy. International Journal of Hyperthermia. 32 (7), 735-748 (2016).
- Johannsen, M., et al. Clinical hyperthermia of prostate cancer using magnetic nanoparticles: Presentation of a new interstitial technique. International Journal of Hyperthermia. 21 (7), 637-647 (2005).
- Horsman, M. R., Overgaard, J. Hyperthermia: a Potent Enhancer of Radiotherapy. Clinical Oncology. 19 (6), 418-426 (2007).
- Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Kaufman, P. A., Hoopes, P. J. Magnetic nanoparticle hyperthermia enhancement of cisplatin chemotherapy cancer treatment. International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 845-851 (2013).
- Peeken, J. C., Vaupel, P., Combs, S. E. Integrating hyperthermia into modern radiation oncology: What evidence is necessary. Frontiers in Oncology. 7, 132 (2017).
- Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Trembly, B. S., Hoopes, P. J. Comparison of magnetic nanoparticle and microwave hyperthermia cancer treatment methodology and treatment effect in a rodent breast cancer model. International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 819-827 (2013).
- Stigliano, R. V., Shubitidze, F., Petryk, A. A., Tate, J. A., Hoopes, P. J. Magnetic nanoparticle hyperthermia: predictive model for temperature distribution. Energy-based Treatment of Tissue and Assessment VII. 8584, 858410 (2013).
- Dewhirst, M., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hoopes, P. J., Hanson, M. A. Thermal dose requirement for tissue effect: experimental and clinical findings. Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment II. 4954, 37 (2003).
- Duval, K. E. A., et al. Immunogenetic effects of low dose (CEM43 30) magnetic nanoparticle hyperthermia and radiation in melanoma cells. International Journal of Hyperthermia. 36, 37-46 (2019).
- Giustini, A. J., Petryk, A. A., Cassim, S. M., Tate, J. A., Baker, I., Hoopes, P. J. Magnetic Nanoparticle Hyperthermia in Cancer Treatment. Nano LIFE. 01, 17-32 (2010).
- Hoopes, P. J., et al. Intratumoral iron oxide nanoparticle hyperthermia and radiation cancer treatment. Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment IV. 6440, (2007).
- Semiatin, S. L., Zinn, S. Coil design and fabrication basic design and modifications. Heat Treating. , 32-41 (1988).
- Maxwell, J. C.
