In vitro og in vivo levering af magnetisk nanopartikelhypertermi ved hjælp af et specialbygget leveringssystem

Summary

Denne protokol præsenterer teknikker og metoder, der er nødvendige for nøjagtig levering af magnetisk nanopartikelhypertermi ved hjælp af et sofistikeret leverings- og overvågningssystem.

Abstract

Hypertermi har længe været brugt til behandling af kræft. Teknikkerne har varieret fra intratumoral indsættelse af varme jernstænger til systemisk leverede tumorantistofmålrettede magnetiske nanopartikler ved temperaturer fra 39 °C (feberniveau) til 1.000 °C (elektrokauteri) og behandlingstider fra sekunder til timer. Forholdet mellem temperatur og tid (termisk dosis) dikterer effekten med høje termiske doser, der resulterer i vævsablation og lavere termiske doser, der resulterer i subletale virkninger såsom øget blodgennemstrømning, akkumulering af lægemidler og immunstimulering. En af de mest lovende nuværende medicinske terapier er magnetisk nanopartikelhypertermi (mNPH). Denne teknik involverer aktivering af magnetiske nanopartikler, der kan leveres systemisk eller intratumoralt med et ikke-invasivt, ikke-toksisk alternerende magnetfelt. Størrelsen, konstruktionen og associeringen af de magnetiske nanopartikler og magnetfeltets frekvens og feltstyrke er vigtige opvarmningsdeterminanter. Vi har udviklet sofistikerede instrumenter og teknikker til at levere reproducerbar magnetisk nanopartikelhypertermi i store og små dyremodeller og dyrkede celler. Denne tilgang, der bruger kontinuerlig temperaturovervågning i realtid flere steder, giver mulighed for levering af veldefinerede termiske doser til målvævet (tumor) eller celler, samtidig med at ikke-målvævsopvarmning begrænses. Præcis styring og overvågning af temperaturen på flere steder og brug af industristandardalgoritmen (kumulative ækvivalente minutter ved 43 °C /CEM43) muliggør en nøjagtig bestemmelse og kvantificering af termisk dosis. Vores system, som giver mulighed for en bred vifte af temperaturer, termiske doser og biologiske effekter, blev udviklet gennem en kombination af kommercielle opkøb og intern ingeniør- og biologiudvikling. Dette system er blevet optimeret på en måde, der muliggør hurtig konvertering mellem ex vivo-, in vitro- og in vivo-teknikker. Målet med denne protokol er at demonstrere, hvordan man designer, udvikler og implementerer en effektiv teknik og et effektivt system til levering af reproducerbar og nøjagtig magnetisk nanopartikelterapi (mNP) hypertermi.

Introduction

Hypertermi har historisk været anvendt i kræftbehandling, enten alene eller i kombination med andre behandlinger. Selvom det har en lang brugshistorie, diskuteres den mest fordelagtige metode til levering af denne behandling stadig og afhænger af sygdomsstedet og placeringen. Metoder til hypertermi levering omfatter mikrobølge, radiofrekvens, fokuseret ultralyd, laser og metalliske nanopartikler (såsom guld eller jernoxid)1,2,3,4. Disse leveringsmetoder kan føre til en række behandlingstemperaturer fra feberniveau til hundreder af grader C. Den biologiske virkning af hypertermi afhænger primært af de anvendte temperaturer og varigheden af behandlingen⁵. Til dette manuskript og formål fokuserer vi på magnetisk nanopartikelhypertermi (mNPH). Denne metode giver mulighed for fokuserede, lokaliserede, godt overvågede og kontrollerede temperaturændringer ved hjælp af ikke-giftige, FDA-godkendte, jernoxidnanopartikler.

En faldgrube ved andre hypertermi-modaliteter er mangel på præcis cellulær målretning; Hypertermi har ikke et iboende højt terapeutisk forhold, derfor er omhyggelig termometri og målretning nødvendig⁶. mNPH giver mulighed for systemisk eller intratumoral injektion af mNP'er, hvor varme kun genereres, hvor mNP'erne er placeret, og dermed målretter behandlingen direkte mod tumoren. mNPH kan være effektiv, når de magnetiske nanopartikler er placeret inde i eller uden for cellen. For kræftbehandling er det generelle overblik over mNPH, at de magnetiske nanopartikler injiceres (intratumoralt eller intravenøst), hvorefter der påføres et vekslende magnetfelt, hvilket får nanopartiklens magnetiske poler til konstant at justere, hvilket fører til en lokaliseret opvarmning af cellerne og vævet forbundet med nanopartiklerne ^7,8 . Ved at justere mængden af nanopartikler og frekvensen/styrken af det vekslende magnetfelt (AMF) er det muligt omhyggeligt at kontrollere den temperatur, der genereres i vævet.

Denne behandling fungerer godt i tumorer, der er nær kropsoverfladen, da dybere tumorer kræver stærkere AMF, så risikoen for hvirvelstrømsopvarmning øges⁹. Der er tegn på, at hypertermi anvendes klinisk som monoterapi, men ofte kombineres hypertermi med strålebehandling eller kemoterapi, hvilket fører til en mere målrettet anti-cancer effekt^10,11,12. Kliniske beviser for hypertermi, der virker i kombination med strålebehandling, gennemgås i en tidligere publikation¹³. Vores laboratorium har med succes behandlet en række dyr, fra mus til svin og spontan hundekræft, ved hjælp af mNPH-metoden^12,14,15. Denne protokol er designet til dem, der er interesseret i at undersøge virkningerne af lokaliseret hypertermibehandling, enten alene eller i kombination med andre terapier.

En af de vigtigste faktorer i hypertermi er at kunne måle og forstå, i realtid, den termiske dosis, der leveres til målet / tumorvævet. En standardmetode til beregning og sammenligning af dosis er ved påvisning af de kumulative ækvivalente minutter af opvarmning ved 43 °C; Denne algoritme gør det muligt at sammenligne doser, der er uafhængige af leveringssystemet, maksimums- og minimumstemperaturer (inden for et bestemt interval) og opvarmnings-/nedkølingsparametre ^5,16. CEM-beregningen fungerer bedst ved temperaturer mellem 39-57 °C⁵. For eksempel har vi i nogle af de undersøgelser, vi har udført, valgt en termisk dosis på CEM43 30 (dvs. 30 min ved 43 °C). Ved at vælge denne dosis kunne vi se på en sikker, effektiv, immungenetisk effekt in vitro, både alene og i kombination med en enkelt dosis stråling¹⁷.

Med magnetisk nanopartikelhypertermi er der flere faktorer, der skal overvejes ved opbygning af et passende leveringssystem. Instrumenteringsdesignet inkluderer vigtige sikkerhedsfaktorer, såsom brugen af en køler for at sikre, at magnetfeltleveringsudstyret forbliver køligt, selv når det betjenes med høj effekt, og fejlsikre procedurer, der forhindrer systemet i at blive tændt, hvis alle temperatur-, effektvurderings- og kontrolsystemer ikke er aktiveret. Derudover er der vigtige biologiske faktorer, der skal overvejes i både in vivo- og in vitro-situationer. Ved anvendelse af dyrkede celler er det nødvendigt at behandle i vækstmedier og opretholde en konstant levedygtig temperatur for at undgå fysiologiske ændringer, der kan påvirke resultaterne. For individuelle nanopartikeltyper er det vigtigt at kende den specifikke absorptionshastighed (SAR) ved beregning af AMF-baserede opvarmningsparametre. På samme måde er det vigtigt at kende mNP / Fe-koncentrationen i celler og væv, der er nødvendig for at opnå den ønskede opvarmning. In vivo-metoder kræver endnu mere opmærksomhed på detaljer, da dyret skal holdes under bedøvelse under behandlingen, og dyrets kropstemperatur skal holdes på et normalt niveau under hele behandlingen. At tillade dyrets kropstemperatur at falde, som det sker under anæstesi, kan påvirke de samlede resultater med hensyn til den termiske dosis af det væv, der behandles.

I dette manuskript diskuterer vi de metoder, der bruges til at designe og konstruere et alsidigt magnetisk nanopartikelhypertermisystem, samt vigtige brugsfaktorer, der skal overvejes. Det beskrevne system giver mulighed for robust, konsistent, biologisk passende, sikker og velkontrolleret levering af magnetisk nanopartikelhypertermi. Endelig skal det bemærkes, at de mNPH-undersøgelser, vi udfører, ofte involverer andre terapier såsom stråling, kemoterapi og immunterapi. For at disse resultater skal være meningsfulde, er det vigtigt at bestemme, hvordan den leverede varme kan påvirke effektiviteten og/eller sikkerhedstoksiciteten af andre metoder (eller omvendt) og dyrets velfærd. Af denne grund og de tidligere nævnte dosimetri- og terapeutiske situationer er det vigtigt at være meget opmærksom på den magnetiske nanopartikelhypertermidoseringsnøjagtighed og de kontinuerlige kerne- og måltemperaturmålinger. Målet med denne protokol er at give en ligetil, konsistent metode og beskrivelse til levering af sikker og effektiv magnetisk nanopartikelhypertermi.

Protocol

Dartmouth College Animal Care and Use Program er akkrediteret af American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) og overholder alle UDSA og NIH (Office of Laboratory Animal Welfare) retningslinjer og regler. Alle in vivo undersøgelser blev godkendt af Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Eutanasi-proceduren overholder AVMA-retningslinjerne for eutanasi af dyr fra 2020.

1. Instrumentering/design af systemet

1. Design brugerdefineret AMF-antenne (spole) til at være en lukket sløjfe, vælg former for at skabe det ønskede magnetfelt. Brug induktansformler og egenskaber fra valg af effektgenerator til at designe kompatible spoler til at generere det ønskede felt. Brug forskellige designs til in vitro- og in vivo-forsøg.
2. Sørg for, at AMF-antennens induktans falder inden for det acceptable område for strømgeneratoren. Tilføj eller træk kondensatorer for at matche (indstille) antennen til strømgeneratoren.
3. Til in vitro-forsøg skal du designe en spiralformet spole med 14 drejninger, indvendig diameter 2 cm og længde 14 cm, der kan indeholde 1,5 ml rør, hvilket giver mulighed for behandling af flere prøver samtidigt. Isoler spolen med en vinylpolymer, og brug en polystyrenafstandsstykke til at adskille spolen fra rørene. Nærmere oplysninger om konstruktionsspecifikationer og overvejelser findes i det supplerende dossier 1.
4. Til in vivo-eksperimenter skal du erhverve en specialbygget helkropsspiralspiral fra en producent med proprietær designinformation. Brug 8 mm firkantede slanger (da det skaber et mere ensartet felt inden for spolens boring) og en koncentrator ved det målrettede behandlingsområde. Gør koncentratoren 5,0 cm lang, med i alt 5 omdrejninger, der resulterer i en indvendig diameter på 3,6 cm, 5,2 cm udvendig diameter, og har dens placering på det målrettede behandlingsområde. Omgiv spolen med en polycarbonatskal.
5. Brug en AMF-generator med justerbar effekt og frekvens, nominel til 10 kW eller mere som strømkilde. Induktans matcher strømkilden og antennerne/spolerne til et område på 0,62 til 1,18 μHenries (μH), hvilket giver mulighed for frekvenser mellem 30-300 kHz. Afkøl generatoren ved hjælp af genbrugsvand gennem en centrifugalboostpumpe, tryk reguleret til 50 psi.
6. Afkøl spolerne med en 5,6 ton kølekapacitetskøler, der pumper 25% ethylenglycolbaseret varmeoverførselsvæske fortyndet med vand gennem AMF-antennen. Indstil kølerens temperatur til en sådan grad, at antennen ikke opvarmer eller afkøler prøven.
7. Til dyreindeslutning konstrueres en rørformet holder, der kan suspenderes i midten af spolen med et 0,5 cm luftgab mellem holderen og spoleoverfladen. Tilslut en justerbar konditioneret luftpumpe, der cirkulerer luft gennem skallen omkring spolen, og indstil den til at opretholde en normal dyrekernetemperatur. Tilslut anæstesimaskinen til den rørformede dyreholder nær dyrets hoved for at sikre korrekt levering af anæstesi.
8. Til celleindeslutning oprettes et apparat, der cirkulerer vand fra et vandbad gennem afstandsstykket, hvor rørene er placeret. Vandbadets temperatur indstilles således, at rørene omgives af vand ved 37 °C.
9. Brug fiberoptiske sonder til at overvåge temperaturer i tumoren, dyrets kerne og dyremiljøet eller til in vitro-undersøgelser, overvågning af cellepillens temperatur og vandet omkring rørene.
10. Brug magnetiske jernoxid nanopartikler, der er 100 nm i størrelse til alle eksperimenter.
    BEMÆRK: Koncentration og specifik absorptionshastighed (SAR) er to egenskaber, der skal overvejes ved valg af nanopartikler, da de direkte påvirker den mulige opvarmning og termiske dosis¹⁸.

2. Hypertermi in vitro

1. Kultur B16F10 murine melanom celler i RPMI medier med 10% FBS og 1% Pen / STREP. Plade 150.000 celler/brønd i 6-brønds plader, med 2 ml komplet medium.
2. Bestem den passende behandling for hver brønd, dvs. celler uden mNP'er og ingen AMF, celler med mNP'er og ingen AMF, celler uden mNP'er og AMF, celler med mNP'er og AMF.
   BEMÆRK: Sørg desuden for, at der er passende kontroller, hvis du kombinerer hypertermi med en anden terapi. AMF udføres i et standard forskningsbænklaboratorium, der er eftermonteret med de nødvendige kraft- og kølefunktioner.
3. 24 timer efter plettering tilsættes mNP'er til de relevante brønde som bestemt i det foregående trin. Der tilsættes mNP'er til en koncentration på 3 mg jern/ml. Sørg for, at mNP'erne fordeles i hele brønden, enten ved at oprette en lagermedie / mNP-løsning (fjerne gamle medier, tilføje denne løsning) eller ved at tilføje mNP'erne direkte og forsigtigt hvirvle plader til homogen fordeling.
4. Start behandlingen, 48 timer efter tilsætning af mNP'er, når brønde er ~ 80% sammenflydende, ved at fjerne medierne og vaske brønde med friske medier. Fjern mediet.
5. Tilsæt 0,5 ml trypsin til hver brønd, der behandles, og hvirvl forsigtigt. Brug et mikroskop til at kontrollere, at cellerne er løsrevet.
6. Tilsæt 1 ml medier til hver brønd for at samle cellerne i 1,5 ml rør. Saml alle cellerne fra brønden (~ 1 x 10⁶ celler). Brug et tydeligt mærket separat rør til hver brønd.
7. Spin rør ved 60 x g i 2-3 min for at tillade celler at pellet. Behold pelleten i mediet.
8. Placer rør i afstandsstykket fyldt med vand inde i spolen. Vandbadets temperatur indstilles således, at mediet og cellepillen holdes på 37 °C. Overvåg temperaturen i røret og vandbadet ved hjælp af separate fiberoptiske temperaturprober.
9. Tænd for køleren, kontroller, at kølevæsken strømmer gennem spolen. Tænd for strømkilden, og juster procentdelen af maksimum til det ønskede felt. Betjen magnetspolen med 14 drejninger, der drives af 10 kW generator, ved 165 kHz og 23,87 kA/m (300 Oe).
10. Anbring en separat fiberoptisk temperatursonde i et af rørene. Cellerne behandles indtil den tidligere bestemte protokol termiske dosis. Et eksempel er 30 min ved 43 °C (CEM43 af 30).
11. Resuspender celler i mediet, der er i deres rør, og genplade i nye 6 brøndplader. Mærk tydeligt de nye plader. Målet er at omlægge alle de indsamlede celler (~ 1 x 10⁶ celler).
    BEMÆRK: Nye 6 brøndplader skal bruges for at sikre, at cellerne, der dyrkes, behandles behandling. Hvis de gamle plader bruges, kan der stadig være celler tilbage på pladerne, der ikke blev trypsiniseret med succes.
12. Om nødvendigt lyser cellerne til RNA- eller proteinekspressionsanalyse til den næste eksperimentelle procedure.

3. Hypertermi in vivo

1. Cellekultur og podning
   1. Kultur B16F10 murine melanom celler i RPMI medier med 10% FBS og 1% Pen / STREP. Brug tallerkener / skåle, der giver nok celler til podning af det ønskede antal dyr. For eksempel vil 10, 100 mm skåle, belagt ved 100.000 celler være sammenflydende med nok celler til 20 mus injektioner inden for 48 timer.
   2. Trypsinize celler og indsamle ved hjælp af rene RPMI medier (ingen FBS eller pen / strep).
   3. Tæl celler, og opret en løsning til den ønskede koncentration af celler baseret på podningsvolumen og musetal.
   4. Bedøv 6 uger gamle C57Bl/6-hunmus ved hjælp af fordampet isofluran og ilt. Anbring dyrene i en plexiglaskasse med 5% isofluran og 95% ilt, indtil de induceres. Når dyret er induceret, fjernes det, og der anvendes en ansigtskegle med 2 % isofluran til at fuldføre trin 3.1.5-3.1.7 og 3.3.3-3.3.6.
      BEMÆRK: Til anæstesi under behandlingen skal du bruge en indbygget anæstesiindeslutning. Følg standard institutionelle protokoller for musebedøvelse. Før dyreforsøg skal der sikres en passende IACUC-godkendelse. Efter anæstesi skal du returnere dyret til bur og overvåge genopretning for at sikre ingen komplikationer.
   5. Kontroller for manglende reaktion på de oprettende reflekser.
   6. Barber højre flanke ved hjælp af en elektrisk barbermaskine.
   7. Rengør injektionsområdet med en spritserviet. Injicer 1-2 x 10⁶ celler ved hjælp af en 100 μL glassprøjte med en 28 G nål, dispergeret i 50 μL medier intradermalt på den barberede højre flanke af bedøvet.
2. Tumorvækst / nanopartikelinjektion
   1. Mål tumorer i 3 dimensioner ved hjælp af kalibre (længde, bredde og dybde), og beregn volumener efter (længde x bredde x dybde x π) / 6.
   2. Når tumorvolumener når 120 mm 3 (+/- 20 mm³), skal du placere dyrene på undersøgelse. Design undersøgelsen, og sørg for, at der er passende kontrol- og behandlingsgrupper, herunder kombinationsterapikohorter (dvs. kontrol, mNPH, stråling og kombinationen).
   3. Bedøv mus, der skal modtage mNP'er som beskrevet i 3.1.4.
   4. Rengør området med en alkoholserviet. Injicer mNP'er i tumoren 3 timer før AMF-behandling. Injicer et volumen, således at dosis er 7,5 mg jern /^cm3 tumor.
      BEMÆRK: Upublicerede data fra laboratoriet tyder på, at maksimal mNP-optagelse sker ved 3-6 timer.
3. AMF behandling
   1. Bedøv musen og læg den på en varmepude for at opretholde kernetemperaturen.
   2. Kontroller for manglende reaktion på de oprettende reflekser. Fjern øremærket eller andre metalgenstande på musen.
   3. Placer forsigtigt en smurt fiberoptisk temperatursonde i musens endetarm.
   4. Placer et kateter i tumoren, fjern nålen. Skær kateteret sådan, at det ikke stikker ud af tumoren for meget.
      BEMÆRK: De fiberoptiske temperaturkatetre placeres og fjernes, mens musene er under generel anæstesi, dvs. katetrene er kun på plads under tumoropvarmningsproceduren. Mus får en enkelt subkutan dosis af en NSAID analgesi medicin, ketoprofen (5 mg / kg), på tidspunktet for proceduren. Vi har ikke observeret kort- eller langtidsubehag eller sygelighed forbundet med placeringen af katetrene.
   5. Indsæt en fiberoptisk temperatursonde med 3 sensorer i kateteret. Kateteret beskytter de fiberoptiske temperatursondesensorer.
   6. Tape den rektale og intratumorale sonde til dyrets hale for at sikre, at de forbliver på plads.
   7. Placer musen i et 50 ml rør, hoved til bunden. Røret skal have et hul nær hovedet, hvor anæstesien vil blive forbundet og leveret.
   8. Placer røret i spolen, der er spole, og tilslut bedøvelsen igen.
   9. Placer en fiberoptisk temperatursonde løst i røret for at måle miljøtemperaturen.
   10. Tænd for køleren, og sørg for, at kølevæsken cirkuleres.
   11. Kontroller og sørg for, at computersoftwaren viser de forskellige temperaturer, og begynd at optage, så en CEM43-beregning kan vises i realtid. Den krævede CEM43 er den tidligere bestemte dosis.
       BEMÆRK: Før magneten tændes, skal du sikre dig, at der ikke er fastgjort metalgenstande til dyret, da disse opvarmes hurtigt. Sørg desuden for, at alle i rummet ikke har en pacemaker, og at det er sikkert for dem at være der.
   12. Tænd magneten med en lav effektprocent.
   13. Sørg for, at de fiberoptiske temperatursonder registrerer temperaturændringer. Temperaturerne vil stige, når AMF aktiveres, når feltet øges. Sørg for, at dyrets kernetemperatur forbliver på 38 °C. Reguler kernetemperaturen ved hjælp af den konditionerede luftkappe.
   14. Juster magnetfeltets styrke ved at ændre strømmen på generatoren ved hjælp af det indbyggede kontrolhjul, som igen styrer temperaturniveauet i tumoren.
   15. Sluk for AMF, når den ønskede dosis, som tidligere bestemt af brugeren (for eksempel CEM43 40), opnås inden for tumoren.
   16. Når AMF er lukket ned, skal du fjerne røret fra spolen.
   17. Fjern musen fra røret, ekstraher de forskellige sonder og kateteret. Mærk om nødvendigt dyret med et nyt øremærke af metal.
   18. Når behandlingerne er afsluttet, skal du lukke køleren ned.
   19. Gendan dyrene fra anæstesi, og sørg for ingen komplikationer. Overvåg deres adfærd for at sikre tilbagevenden til normal.

Representative Results

In vitro-undersøgelser
Celler vil kun opnå og opretholde den ønskede temperatur og termiske dosis, hvis mængden og koncentrationen af de magnetiske nanopartikler/jern og AMF er passende matchet. Når magnetiske nanopartikler anvendes til opvarmning af celler in vitro (og in vivo), skal det bemærkes, at for at opnå hypertermi i celler med internaliserede magnetiske nanopartikler, vil et specifikt niveau af intracellulær mNP / Fe være nødvendigt, og antal og nærhed af mNP-belastede celler til hinanden vil være nødvendigt. Hvis niveauet af mNP/Fe i målcellerne/vævet er tilstrækkeligt til at opnå en opvarmningseffekt, kan magnetfeltfrekvensen og -styrken justeres for at opnå den ønskede temperatur og effekt. Hvis de er belagt korrekt, kan yderligere undersøgelser, der ser på genetiske og molekylære forskelle mellem forskellige doser og tidspunkter, forfølges¹⁷. Figur 1 viser et skema over in vitro-metoderne.

Disse in vitro metoder kan bruges til at undersøge cellulær mRNA og proteinekspressionsændring. Et nyligt eksempel fra vores laboratorium bestemte immungenetiske forskelle efter CEM43 30 mNPH-behandling, en 8 Gy-strålebehandling og kombinationen. Vi var i stand til at identificere ligheder og forskelle i ekspression på tværs af immun- og cytotoksiske veje for at få en bedre forståelse af mekanismen bag virkningerne, og hvordan de kombineres synergistisk¹⁷. Hvert eksperiment anvender en række miljømæssige og opvarmede kontrolprøver. Kontrollerne vil have forskellige mRNA- og proteinekspressionsniveauer sammenlignet med dem, der modtager hypertermibehandling.

In vivo-undersøgelser
I in vivo-undersøgelser er der yderligere overvejelser. Uanset den termiske måldosis er det absolut nødvendigt at opretholde en fysiologisk acceptabel kernetemperatur hos det dyr, der behandles. Dette kan være udfordrende med gnavere under anæstesi, da kernetemperaturen hurtigt kan gå tabt (kernetemperaturmodulerende teknikker såsom varmepuder er ofte nødvendige). Lavere end normale kropstemperaturer kan nødvendiggøre behovet for at skubbe AMF-mNPH for langt, når man forsøger at opnå en specifik termisk dosis i tumoren, hvilket resulterer i uacceptable virkninger i ikke-målvævet (ikke-målvævs hvirvelstrømopvarmning er en sådan mulighed). Selv mindre afvigelser i kropstemperaturen kan føre til uønskede fysiologiske komplikationer i tumoren eller normalt væv. Som tidligere nævnt, men værd at gentage, er det vigtigt at opnå en overensstemmelse mellem mNP/Fe-vævskoncentrationen, AMF-frekvensen og feltstyrketemperaturovervågningsparametrene og målvævets størrelse og dybde for nøjagtig, reproducerbar opvarmning. Der skal være en baseline koncentration af mNP'er i tumoren for at muliggøre målbar opvarmning. Varmens niveau/evne afhænger ikke kun af mNP-vævskoncentration (mg Fe/g væv) og deres relative fordeling i tumoren, men også hyppigheden af AMF og efterfølgende feltstyrke. Ændringer i nogen af ovenstående kan føre til forskellige områder af opnåelige temperaturer i vævet. Gennem mange års erfaring har vi optimeret den koncentration, vi bruger til prækliniske tumorbehandlinger, og hyppigheden og feltstyrken af AMF-systemet for at muliggøre sikker og effektiv aktivering. Da det er umuligt at måle temperaturen/den termiske dosis på alle vævssteder, er det også vigtigt at placere så mange fiberoptiske temperatursonder som muligt på strategiske steder, der giver mulighed for effektivitets- og sikkerhedsvurdering i realtid, som det ses i figur 2. Disse sonder giver mulighed for registrering af temperaturer under hele eksperimentet, hvilket giver mulighed for nøjagtig dosimetri og termisk historie af eksperimentet. Figur 3 viser kurver genereret under et in vivo-eksperiment, hvilket fremhæver evnen til nøje at overvåge temperaturen og justere systemet for at opretholde tumortemperaturer inden for det ønskede område. Figur 4 opsummerer in vivo-metoderne.

Disse in vivo-metoder, der ligner in vitro-metoderne, kan bruges til at undersøge forskellige kræfttyper, forskellige hypertermidoser og med forskellige kombinationsbehandlinger. For eksempel har tidligere undersøgelser i vores laboratorium undersøgt kombinationen af hypertermi og kemoterapi¹². Vi har også gennemført adskillige hypertermi- og strålingseksperimenter til bestemmelse af effektivitet og molekylære mekanismer. Kontrolmusene til disse eksperimenter gennemgår alle procedurer undtagen den faktiske generering af hypertermi. Figur 5 indeholder to vulkanplot, der viser differentielt udtrykte gener efter in vitro og in vivo mNP hypertermibehandling (mNPH). Disse tal er eksempler på, hvordan vi bruger molekylære teknikker til at overvåge hypertermieffekterne.

Figur 1: In vitro mNP hypertermi skematisk. Dette skema demonstrerer metoden til in vitro magnetisk nanopartikelhypertermi. For at sikre, at opvarmning finder sted, skal cellerne have tilstrækkelige partikler og tid til tilstrækkelig mNP-optagelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Placering af katetre til temperaturovervågning. Denne figur viser placeringen af katetre, der huser de fiberoptiske temperatursonder for at registrere temperaturer på forskellige steder i tumoren og / eller tumorområdet. Dette tal er tilpasset fra ^ref.19. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Temperaturovervågning i realtid under behandling af en musetumor. Denne graf viser temperaturaflæsningerne i realtid, der giver mulighed for overvågning af kropstemperaturen, miljøtemperaturerne og flere temperaturer i tumoren under et in vivo-eksperiment. Kontrollen af temperaturer i tumoren demonstreres gennem de minimale store variationer på den zoomede del af figuren. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: In vivo mNP hypertermi skematisk. Dette skema demonstrerer metoden til in vivo magnetisk nanopartikelhypertermi. Injektion af tilstrækkelige nanopartikler samt tilstrækkelig tid til distribution og absorption sikrer evnen til at levere den ønskede termiske dosis. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Differentiel genekspression. Differentiel genekspression efter in vitro (A) og in vivo (B) mNP hypertermibehandling. Disse vulkanplots repræsenterer genetiske ændringer på en log 2 x-akse, med betydning på y-aksen, for både in vitro og in vivo mNPH metoder. Hver cirkel repræsenterer et andet gen med de 20 mest signifikante differentielt udtrykte gener mærket. Jo længere genet er fra nul på x-aksen, jo større er foldændringen, og jo højere genet er på y-aksen, jo lavere er p-værdien. Selvom begge havde den samme termiske dosis, førte in vivo hypertermi til større genekspressionsændringer end in vitro. Disse plots er eksempler på de biologiske data, der kan genereres ved hjælp af den beskrevne protokol. In vitro vulkanplottet er blevet tilpasset fra ^ref.17. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende dossier 1. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Design og implementering af dette system giver mulighed for at udføre nøjagtige og reproducerbare in vitro og in vivo magnetiske nanopartikelhypertermieksperimenter. Det er afgørende, at systemet er designet således, at AMF-frekvensen og feltstyrken er tilstrækkeligt tilpasset den magnetiske nanopartikeltype, koncentration og vævets placering og temperatur, der ønskes. Derudover er nøjagtig overvågning af temperaturen i realtid afgørende for sikkerheden og beregningen af en nøjagtig termisk dosis (kumulative ækvivalente minutter ved 43 °C/CEM). Placeringen af sonder som vist i figur 1 giver mulighed for realtidsovervågning af termisk dosis og kernekropstemperatur som vist i figur 2.

Det første skridt i nøjagtig levering af magnetisk nanopartikelhypertermi er at opbygge et sikkert system til dyr og operatører. Alle komponenter i systemet skal også forstås godt ud fra et drifts- og leveringssynspunkt. I denne situation betyder det at forstå potentialet for AMF hvirvelstrømme og vide, hvor magnetiske partikler er placeret. Antennerne eller spolerne er en nøglefaktor i feltets form og styrke, og det anvendte kølesystem er vigtigt for at forhindre overophedning af spolen²⁰. Feltstyrken uden for lederen er direkte proportional med strømstyrken, der strømmer gennem lederen. Magnetfeltstyrken på ethvert punkt i rummet omkring lederen er vektorsummen af felterne produceret af lederne i det omgivende område. Magnetfeltet produceres i en ret vinkel på strømstrømmen, og styrken falder eksponentielt som en funktion af afstanden fra lederen i henhold til Biot-Savart inverse kvadratregel²¹. Således anvendes firkantede rør til in vivo hypertermi for et mere ensartet felt i spolen. Oprettelse af et magnetfelt med den styrke og volumen, der er nødvendig for et potentielt klinisk relevant system, kræver en høj elektrisk strøm. Derfor skal antennedesign være i stand til at rumme betydelige elektriske effektniveauer. AMF-antenner skal også designes, så deres induktans falder inden for det acceptable område for strømgeneratoren. Ved de frekvenser, der typisk anvendes, er det meste af strømstrømmen på antennelederens overflade, hvilket betyder, at overfladen påvirker den resistive opvarmning, som kan minimeres ved at eliminere overfladefejl. Denne resistive opvarmning betyder også, at der er behov for et spolekølesystem for at sikre, at spolen og miljøet ikke overophedes.

En begrænsning ved vores systemdesign er, at det ikke tillader et samlet frekvensområde og magnetfelter, men det gør det muligt at generere felter, der passer til celler, gnavere og store dyr. Specifikt er den maksimale feltstyrke, der er tilgængelig fra ethvert induktionsvarmesystem, direkte relateret til strømstrømmen i antennen (spolen). AMF-generatorer er klassificeret i kilowatt, som beregnes ved at multiplicere den tilgængelige spænding med den tilgængelige strøm (ampere). Så et 10kW-system med en 500 V-grænse ville have en maksimal strømstyrke på 20 A. Spolernes design bestemmer, hvilken grænse der nås først, og dermed systemgrænsen. Magnetfeltstyrken skabt af enhver strøm falder eksponentielt som en funktion af afstanden fra lederen. Derfor ville en spole med større diameter med samme geometri som en spole med mindre diameter, der kører på det samme system, have en lavere feltstyrke i midten af spolen. Således er den krævede magnetfeltstørrelse og styrke begrænset af AMF-generatorens kapacitet. At bygge en større spole og bruge mere strøm fører til yderligere bekymringer, primært hvirvelstrømopvarmning.

Der er flere sikkerhedsproblemer, der skal løses, når du bruger dette system til at beskytte brugere, dyr og selve systemet. For det første skal der opretholdes tilstrækkelig rumventilation under brug af anæstesi. For det andet skal alle områder, der er forbundet med spolen, være fri for metal og/eller ledere, herunder blandinger med højt saltindhold. Brugere skal fjerne ringe og andre smykker, når de arbejder omkring AMF, og prøver bør ikke indeholde nogen form for metal. Af største betydning bør personer med pacemakere eller andre implanterede enheder eller genstande konsultere deres læge, før de arbejder omkring AMF. For at beskytte systemet skal der anvendes et fejlsikkert system, der sikrer, at generator- og spolekølebehovet er opfyldt, før der tilføres strøm. Derudover bør en termisk kameraoversigt bruges til at detektere utilsigtet opvarmning.

For in vitro-undersøgelser er de vigtigste trin, der skal følges, koncentrationen af jern i celler, koncentrationen af celler, AMF-parametre og termisk dosisvurdering. Celler kan behandles/opvarmes med magnetisk nanopartikelhypertermi ved at placere de magnetiske nanopartikler i supernatanten, cellerne eller begge dele. Mængden af magnetisk nanopartikelopvarmning afhænger af niveauet af magnetiske nanopartikler/Fe. Hvis man ønsker kun at behandle celler med internaliseret jern, er vores erfaring, at enkelte kræftceller kun optager et begrænset antal magnetiske nanopartikler, og at cellerne, selv når optagelsen er optimal, skal aggregeres/pelleteres for at skabe celleopvarmningssituation, selv med optimeret AMF. Det er også vigtigt at opretholde mediets og cellernes temperatur på biologisk relevante niveauer (når de ikke opvarmes) for nøjagtig måling af ægte opvarmning. Den 14-drejnings magnetspole, der er beskrevet her, gør det muligt at opretholde biologisk relevante temperaturer ved at nedsænke prøverne i en termisk styret vandsøjle.

For in vivo-undersøgelserne er opretholdelse af dyrets kernetemperatur og nøjagtig måling af temperaturen i tumoren nøglefaktorer. Dette dyreindeslutningssystem og design af spolen eliminerer termisk drift i dyrets miljø på grund af spole / strømindstillinger og hjælper med at opretholde normal kropstemperatur. Opretholdelse af kroppens kernetemperatur er afgørende for meningsfulde eksperimentresultater. Den rektale sonde giver mulighed for realtidsovervågning af dyrets kernetemperatur. Under anæstesi falder et dyrs kernetemperatur i sagens natur. For at løse denne situation udviklede vi et miljøopvarmningssystem, der leverer varm luft omkring dyrenes indeslutningsbeholder, så kernetemperaturen forbliver i det normale område. Opretholdelse af normal kernetemperatur er afgørende for at sikre nøjagtig fortolkning af hypertermibehandlingsresultater og eliminering af miljøfaktorer. Placeringen af temperaturovervågningssonderne flere steder i målvævet / tumoren er vigtig for at få en nøjagtig vurdering af den opnåede temperatur og termiske dosis. Fordi det er ekstremt vanskeligt, hvis ikke umuligt at distribuere magnetiske nanopartikler homogent i en tumor, er det vigtigt at kende opvarmningsparametrene flere steder for at opnå en konsistent og nøjagtig væv / tumor termisk dosis. Det er vigtigt at bemærke, at koncentrationen for in vitro- og in vivo-undersøgelser varierer. Denne variation skyldes, at der er færre grænser i cellekultur, hvor celler har mere adgang til mNP'erne, så en lavere koncentration kan bruges. In vivo er en højere koncentration nødvendig på grund af tumorernes heterogene karakter og den komplicerede 3D-morfologi. Derfor vil brug af den samme koncentration af partikler in vivo og in vitro føre til, at langt færre optages af celler.

Dette manuskript beskriver de parametre og instrumenter, der er nødvendige for at udvikle et effektivt og fleksibelt vekslende magnetfeltgenerator og spolesystem til magnetisk nanopartikelhypertermibehandling. Dette system kan anvendes til både in vitro- og in vivo-undersøgelser. Systemet er effektivt til lokaliseret / målrettet hypertermi og sparing af normalt væv, hvilket gør det tiltalende sammenlignet med andre AMF-mNP hypertermisystemer. Disse hypertermibehandlinger kan ændres for at undersøge virkningerne af forskellige doser med en række nanopartikler eller nanobærere og supplerende behandlinger. Da vævsopvarmning, især magnetisk nanopartikelopvarmning, kan påvirkes af så mange variabler, er det vigtigt at forstå parametrene i en undersøgelse. Hvis disse kriterier er opfyldt, kan magnetisk nanopartikelhypertermi adressere mange molekylære, cellulære og kliniske situationer, herunder uafhængig og adjuverende tumorkontrol. Selvom metoderne beskrevet her kræver betydelig indsats, hvis retningslinjerne følges, kan det fulde potentiale af mNP-hypertermi realiseres.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
.25% Trypsin	Corning	45000-664	available from many companies
1.5 mL tubes	Eppendorf	Eppendorf 22363204	available from many companies
B16F10 murine melanoma cells	American Type Culture Collection	CRL-6475
C57/Bl6 mice	Charles river	027C57BL/6	6-week-old female mice
Chiller	Thermal Care	NQ 5 series	chiller that cools the coil
Coolant fluid	Dow Chemical Company	Dowtherm SR-1	antenna cooling fluid
Fetal Bovine serum	Hyclone	SH30071	available from many companies
fiber optic probes, software and chassis	FISO		FISO evolution software used to read the temperatures
IR camera	Flir		infrared camera to monitor unintentional heating
iron oxide nanoparticles	micromod Partikeltechnologie GmbH	Bionized NanoFerrite	dextran coated iron oxide nanoparticles
mouse coil, solenoid	Fluxtrol	custom built
penicillin/streptomycin	Corning	45000-652	available from many companies
RF generator	Huttinger	TIG 10/300	power source
RPMI media	Corning	45000-396	available from many companies