In vitro- och in vivo-leverans av magnetisk nanopartikelhypertermi med hjälp av ett specialbyggt leveranssystem

Summary

Detta protokoll presenterar tekniker och metoder som är nödvändiga för exakt leverans av magnetisk nanopartikelhypertermi med hjälp av ett sofistikerat leverans- och övervakningssystem.

Abstract

Hypertermi har länge använts vid behandling av cancer. Teknikerna har varierat från intratumörinsättning av heta järnstänger, till systemiskt levererade tumörantikroppsinriktade magnetiska nanopartiklar, vid temperaturer från 39 °C (febernivå) till 1 000 °C (elektrokauteri) och behandlingstider från sekunder till timmar. Temperatur-tidsförhållandet (termisk dos) dikterar effekten med höga termiska doser som resulterar i vävnadsablation och lägre termiska doser som resulterar i subletala effekter såsom ökat blodflöde, ackumulering av läkemedel och immunstimulering. En av de mest lovande nuvarande medicinska terapierna är magnetisk nanopartikelhypertermi (mNPH). Denna teknik innebär aktivering av magnetiska nanopartiklar, som kan levereras systemiskt eller intratumoralt, med ett icke-invasivt, giftfritt alternerande magnetfält. Storleken, konstruktionen och associationen av de magnetiska nanopartiklarna och magnetfältets frekvens och fältstyrka är viktiga uppvärmningsfaktorer. Vi har utvecklat sofistikerade instrument och tekniker för att leverera reproducerbar magnetisk nanopartikelhypertermi i stora och små djurmodeller och odlade celler. Detta tillvägagångssätt, med kontinuerlig temperaturövervakning i realtid på flera platser, möjliggör leverans av väldefinierade termiska doser till målvävnaden (tumören) eller cellerna samtidigt som icke-målvävnadsuppvärmning begränsas. Exakt kontroll och övervakning av temperatur, på flera platser, och användning av industristandardalgoritmen (kumulativa ekvivalenta minuter vid 43 °C / CEM43), möjliggör en exakt bestämning och kvantifiering av termisk dos. Vårt system, som möjliggör en mängd olika temperaturer, termiska doser och biologiska effekter, utvecklades genom en kombination av kommersiella förvärv och intern teknik- och biologiutveckling. Detta system har optimerats på ett sätt som möjliggör snabb omvandling mellan ex vivo-, in vitro- och in vivo-tekniker. Målet med detta protokoll är att demonstrera hur man designar, utvecklar och implementerar en effektiv teknik och ett effektivt system för att leverera reproducerbar och exakt magnetisk nanopartikelterapi (mNP) hypertermi.

Introduction

Hypertermi har historiskt använts i cancerbehandling, antingen ensam eller i kombination med andra behandlingar. Även om det har en lång historia av användning, diskuteras fortfarande den mest fördelaktiga metoden för att leverera denna behandling och är beroende av sjukdomsplatsen och platsen. Metoder för hypertermileverans inkluderar mikrovågsugn, radiofrekvens, fokuserad ultraljud, laser och metalliska nanopartiklar (såsom guld eller järnoxid)1,2,3,4. Dessa leveransmetoder kan leda till en rad behandlingstemperaturer från febernivå till hundratals grader C. Den biologiska effekten av hypertermi beror främst på de temperaturer som används och behandlingens varaktighet⁵. För detta manuskript och ändamål fokuserar vi på magnetisk nanopartikelhypertermi (mNPH). Denna metod möjliggör fokuserade, lokaliserade, väl övervakade och kontrollerade temperaturförändringar, med hjälp av giftfria, FDA-godkända, järnoxidnanopartiklar.

En fallgrop av andra hypertermimodaliteter är bristen på exakt cellulär inriktning; Hypertermi har inte ett i sig högt terapeutiskt förhållande, därför är noggrann termometri och inriktning nödvändig⁶. mNPH möjliggör systemisk eller intratumoral injektion av mNPs, med värme som endast genereras där mNPs är belägna, vilket riktar behandlingen direkt till tumören. mNPH kan vara effektivt när de magnetiska nanopartiklarna är belägna inuti eller utanför cellen. För cancerterapi är den allmänna översikten över mNPH att de magnetiska nanopartiklarna injiceras (intratumoralt eller intravenöst), sedan appliceras ett alternerande magnetfält, vilket får nanopartikelns magnetiska poler att ständigt justeras, vilket leder till en lokaliserad uppvärmning av cellerna och vävnaden associerad med nanopartiklarna ^7,8 . Genom att justera volymen av nanopartiklar och frekvensen/styrkan hos det alternerande magnetfältet (AMF) är det möjligt att noggrant kontrollera temperaturen som genereras i vävnaden.

Denna behandling fungerar bra i tumörer som ligger nära kroppsytan, då djupare tumörer kräver starkare AMF så ökar risken för virvelströmsuppvärmning^9. Det finns tecken på att hypertermi används kliniskt som monoterapi, men ofta kombineras hypertermi med strålbehandling eller kemoterapi, vilket leder till en mer riktad anti-cancereffekt^10,11,12. Kliniska bevis på att hypertermi fungerar i kombination med strålbehandling granskas i en tidigare publikation¹³. Vårt laboratorium har framgångsrikt behandlat en mängd olika djur, från möss till grisar och spontan hundcancer, med hjälp av mNPH-metoden^12,14,15. Detta protokoll är utformat för dem som är intresserade av att undersöka effekterna av lokaliserad hypertermibehandling, antingen ensam eller i kombination med andra terapier.

En av de viktigaste faktorerna vid hypertermi är att i realtid kunna mäta och förstå den termiska dosen som levereras till mål- / tumörvävnaden. Ett standardiserat sätt att beräkna och jämföra dosen är att demonstrera de kumulativa ekvivalenta minuterna av uppvärmning vid 43 °C. Denna algoritm gör det möjligt att jämföra doser oberoende av leveranssystemet, högsta och lägsta temperaturer (inom ett visst intervall) och värme-/nedkylningsparametrar ^5,16. CEM-beräkningen fungerar bäst för temperaturer mellan 39-57 °C⁵. I några av de studier vi har utfört har vi till exempel valt en termisk dos av CEM43 30 (dvs. 30 min vid 43 °C). Att välja denna dos gjorde det möjligt för oss att titta på en säker, effektiv, immunogenetiska effekter in vitro, både ensam och i kombination med en enda dos av strålning¹⁷.

Med magnetisk nanopartikelhypertermi finns det flera faktorer som måste beaktas vid byggandet av ett lämpligt leveranssystem. Instrumenteringsdesignen innehåller viktiga säkerhetsfaktorer, såsom användning av en kylare för att säkerställa att magnetfältleveransutrustningen förblir sval även när den används med hög effekt, och felsäkra procedurer som förhindrar att systemet slås på om alla temperatur-, effektbedömnings- och styrsystem inte har aktiverats. Dessutom finns det viktiga biologiska faktorer som måste beaktas för både in vivo- och in vitro-situationer. Vid användning av odlade celler är det nödvändigt att behandla i tillväxtmedia och upprätthålla vid en konsekvent livskraftig temperatur för att undvika fysiologiska förändringar som kan påverka resultaten. För enskilda nanopartikeltyper är det viktigt att känna till den specifika absorptionshastigheten (SAR) vid beräkning av AMF-baserade uppvärmningsparametrar. På samma sätt är det viktigt att känna till mNP / Fe-koncentrationen, i celler och vävnader, som är nödvändig för att uppnå önskad uppvärmning. In vivo-metoder kräver ännu mer uppmärksamhet på detaljer eftersom djuret måste hållas under anestesi under behandlingen och djurets kärnkroppstemperatur bibehållas på en normal nivå under hela behandlingen. Att tillåta djurets kroppstemperatur att sjunka, som händer under anestesi, kan påverka de totala resultaten med avseende på den termiska dosen av vävnaden som behandlas.

I detta manuskript diskuterar vi de metoder som används för att designa och konstruera ett mångsidigt magnetiskt nanopartikelhypertermisystem, samt viktiga användningsfaktorer som måste beaktas. Det beskrivna systemet möjliggör robust, konsekvent, biologiskt lämplig, säker och välkontrollerad leverans av magnetisk nanopartikelhypertermi. Slutligen bör det noteras att de mNPH-studier vi genomför ofta involverar andra terapier som strålning, kemoterapi och immunterapi. För att dessa resultat ska vara meningsfulla är det viktigt att avgöra hur den levererade värmen kan påverka effekten och/eller säkerhetstoxiciteten hos andra modaliteter (eller vice versa) och djurets välbefinnande. Av denna anledning och de dosimetri och terapeutiska situationer som tidigare nämnts är det viktigt att ägna strikt uppmärksamhet åt den magnetiska nanopartikelhypertermidoseringsnoggrannheten och de kontinuerliga kärn- och måltemperaturmätningarna. Målet med detta protokoll är att tillhandahålla en enkel, konsekvent metod och beskrivning för leverans av säker och effektiv magnetisk nanopartikelhypertermi.

Protocol

Dartmouth College Animal Care and Use Program är ackrediterat av American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) och följer alla riktlinjer och föreskrifter för UDSA och NIH (Office of Laboratory Animal Welfare). Alla in vivo-studier godkändes av Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Eutanasiproceduren följer 2020 års AVMA-riktlinjer för eutanasi av djur. 1. Instrumentering/utformning av systemet Designa…

Representative Results

In vitro-studierCeller kommer endast att uppnå och bibehålla önskad temperatur och termisk dos om mängden och koncentrationen av de magnetiska nanopartiklarna/järnet och AMF matchas på lämpligt sätt. Vid användning av magnetiska nanopartiklar för att värma celler in vitro (och in vivo) bör det noteras att för att uppnå hypertermi i celler med internaliserade magnetiska nanopartiklar kommer en specifik nivå av intracellulär mNP / Fe att vara nödvändig, och antal och närhet av mNP-la…

Discussion

Utformningen och implementeringen av detta system ger möjlighet att genomföra exakta och reproducerbara in vitro- och in vivo magnetiska nanopartikelhypertermiexperiment. Det är viktigt att systemet är utformat så att AMF-frekvensen och fältstyrkan är tillräckligt anpassade till den magnetiska nanopartikeltypen, koncentrationen och vävnadens placering och temperatur som önskas. Dessutom är noggrann övervakning av temperaturen i realtid avgörande för säkerheten och beräkningen av en exakt termisk dos (kumu…

Materials

.25% Trypsin	Corning	45000-664	available from many companies
1.5 mL tubes	Eppendorf	Eppendorf 22363204	available from many companies
B16F10 murine melanoma cells	American Type Culture Collection	CRL-6475
C57/Bl6 mice	Charles river	027C57BL/6	6-week-old female mice
Chiller	Thermal Care	NQ 5 series	chiller that cools the coil
Coolant fluid	Dow Chemical Company	Dowtherm SR-1	antenna cooling fluid
Fetal Bovine serum	Hyclone	SH30071	available from many companies
fiber optic probes, software and chassis	FISO		FISO evolution software used to read the temperatures
IR camera	Flir		infrared camera to monitor unintentional heating
iron oxide nanoparticles	micromod Partikeltechnologie GmbH	Bionized NanoFerrite	dextran coated iron oxide nanoparticles
mouse coil, solenoid	Fluxtrol	custom built
penicillin/streptomycin	Corning	45000-652	available from many companies
RF generator	Huttinger	TIG 10/300	power source
RPMI media	Corning	45000-396	available from many companies