Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Superoppløsningsavbildning for å studere samtidig lokalisering av proteiner og synaptiske markører i primære nevroner

Published: October 31, 2020 doi: 10.3791/61434
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 2,3, 1
1Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 2Department of Neuroscience, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 3Dulbecco Telethon Institute, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS

Summary

Denne protokollen viser hvordan du bruker superoppløsningsmikroskopi for å studere proteinkon-lokalisering i primære nevronale kulturer.

Abstract

Synapser er de funksjonelle elementene i nevroner og deres defekter eller tap er på grunnlag av flere nevrodegenerative og nevrologiske lidelser. Imaging studier er mye brukt til å undersøke deres funksjon og plastisitet i fysiologiske og patologiske forhold. På grunn av deres størrelse og struktur krever lokaliseringsstudier av proteiner høyoppløselige bildeteknikker. I denne protokollen beskriver vi en prosedyre for å studere i primære nevroner samtidig lokalisering av målproteiner med synaptiske markører på et superoppløsningsnivå ved hjelp av strukturert belysningmikroskopi (SIM). SIM er en mønstret lys belysning teknikk som dobler romlig oppløsning av bredfelt mikroskopi, nå en detalj på rundt 100 nm. Protokollen angir de nødvendige kontrollene og innstillingene for robuste sam lokaliseringsstudier og en oversikt over de statistiske metodene for å analysere bildedataene riktig.

Introduction

Forståelsen og synet av synapse har endret seg enormt siden den første beskrivelsen av Foster og Sherrington i 18971. Siden da har vår kunnskap om nevronal kommunikasjon og de molekylære prosessene bak den vokst eksponentielt2. Det har blitt klart at synapser kan tenkes som et to-roms system: et pre-synaptisk rom som inneholder vesikler for frigjøring av nevrotransmittere og et postsynaptisk rom medreseptorer 3. Dette forenklede synet har de siste tjue årene utviklet seg til et komplekst nettverk av proteinene som kreves for å transdusere senderbinding til å signalisere4.

Gevinsten i forståelsen skyldes delvis superoppløsningsteknikker som overvant diffraksjonsgrensen for konvensjonell lett mikroskopi som passer dimensjonen av synapser bedre5,,6,,7,,8,,9,,10. På grunn av diffraksjonsgrensen kan ikke et optisk mikroskop nå en oppløsning over 200 nm side11,,12. For å omgå denne grensen ble det opprettet superoppløsningsteknikker ved hjelp av ulike tilnærminger og når forskjellige sub-diffraksjonsgrenseoppløsninger: SIM, STED (Stimulert utslippsdeplesjonsmikroskopi), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) og STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM dobler den romlige oppløsningen av laserbaserte bredfelts mikroskopisystemer ved å sette inn en diffraksjonsrist i eksitasjonsstrålebanen15. Den bevegelige risten diffracts laserstrålene for å skape et kjent belysningsmønster, vanligvis striper. Dette med hensikt strukturerte lysmønsteret er lagt over til den ukjente romlige fordelingen av fluorescerende fargestoff (av prøven). Interferenskantene dannet av de to mønstrene koder for ellers umulige fine detaljer med normal bredfeltmikroskopi. Det endelige super-løst bildet oppnås ved å kombinere og dekoding med matematiske metoder flere råbilder av samme prøve oppnådd av oversettelser og rotasjoner av diffraksjonsristet. Oppløsningen av super-løst bilder når 100 nm i lateral og 500 nm i aksial retninger for 2D-SIM15 eller 100 nm i sideveis og 250 nm i aksial retninger for 3D-SIM16.

Den nye forståelsen av synapsen er enda viktigere i lys av de mange nevrologiske lidelsene der synaptisk dysfunksjon spiller en viktig rolle i utbruddet ogprogresjon 17,18. Alzheimers sykdom, Down syndrom, Parkinsons sykdom, prion sykdommer, epilepsi, autisme spektrum lidelser og skjøre X syndrom blant annet har vært knyttet til abnormiteter i synaptisk sammensetning, morfologiog funksjon 19,20,21,22.

Nylig, ved hjelp av et sett med SUMO-spesifikke antistoffer, brukte vi SIM til å vise co-lokalisering i primære hippocampal nevroner av SUMO proteiner med pre- og post-synaptiske markører synaptophysin og PSD95 på superoppløsningnivå 23. Dette gjorde oss i stand til å bekrefte biokjemisk og konfokal mikroskopi bevis på SUMO lokalisering i nevroner.

Her beskriver vi en protokoll for å studere lokalisering av proteiner i mus hippocampal primære nevroner. Samtidig kan denne protokollen tilpasses ulike typer primære nevronale kulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Primærkulturer

  1. Kultur mus hippocampal primære nevroner i kamret dekkerlips (som Ibidi μ-Slide 8 Vel eller Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) som samsvarer med det objektive kravet for #1,5 (0,17 mm) dekkslip tykkelse.
  2. Coat kamret dekkslips med 100 μL poly-L-lysin (100 μg / ml).
  3. Neste dag vasker du de kamrede dekkglassene to ganger med steril fosfatbufret saltvann (PBS).
  4. For å oppnå musen primære nevroner, isolere hippocampi fra P1-P4 valper23.
  5. Plasser dissekert hippocampi i 10 ml disseksjonsmedier (tabell 1) og la dem deponere nederst på røret.
  6. Bruk en steril pipette til å forsiktig fjerne Dissection Media, slik at hippocampi uforstyrret på bunnen av røret.
  7. Tilsett 10 ml Media 1 (tabell 1) i hippocampi og inkuber i 30 minutter ved 37 °C.
  8. Bruk en steril pipette til å forsiktig fjerne Media 1, slik at hippocampi ikke er uforstyrret nederst på røret.
  9. Tilsett 10 ml Media 2 (tabell 1) og la (avkortet) sentrifugerøret under panseret stå horisontalt i 45 minutter.
  10. La sentrifugerøret stå vertikalt slik at vevet kan bosette seg på bunnen av røret.
  11. Bruk en steril pipette til å forsiktig fjerne Media 2, slik at hippocampi uforstyrret på bunnen av sentrifugerøret.
  12. Legg til 2 ml Media 3 (Tabell 1).
  13. Ved hjelp av en p1000 pipette med en filtrert spiss, mekanisk dissosiere celler fra vevet.
  14. Overfør det overnaturante, der de isolerte nevronene ligger, til et 15 ml sentrifugerør.
  15. Sentrifuger cellefjæringen i 2 min ved 300 x g ved romtemperatur (RT).
  16. Etter sentrifugering er cellene plassert på bunnen av sentrifugerøret. Ved hjelp av en steril pipette kast supernatanten.
  17. Resuspend celler i 1 ml Media 4.
  18. Bruk et 70 μm filter for å eliminere uavslørte celler.
  19. Telle levedyktige celler i et Bürker-kammer ved å tilsette 1 μL på 0,4 % Trypan blå oppløsning til 19 μL av cellefjæringen.
  20. Plateceller ved 70 000 celler/brønn i et volum på 200 μL per brønn.
  21. La cellene festes i 2 timer i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
  22. Ta ut de kamretde dekkglassene fra inkubatoren og erstatt forsiktig mediet med 200 μL kulturmedier.
  23. La de kamret dekkglassene stå i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
  24. Erstatt en tredjedel av mediet med friske kulturmedier hver 5-7 dager.
  25. Vent til hippocampal primære nevroner er fullt modnet (12-14 dager etter plating) for å utføre co-lokalisering studier.

2. Immunofluorescence flekker

  1. Ta de kamret dekkglassene fra inkubatoren.
  2. Fjern mediet.
  3. Vask brønnene raskt med 200 μL PBS.
  4. Tilsett 4 % paraformaldehyd (PFA) i PBS (200 μL/brønn) til nevroner for å fikse dem raskt.
  5. Inkuber cellene i 15 min ved RT.
  6. Fjern PFA-løsningen.
  7. Permeabilize cellene ved å legge PBS med 0,2% Triton X-100 (200 μL / brønn).
  8. Inkuber i 1 min ved RT.
  9. Fjern løsningen og inkuber prøvene med 1 % storfe serumalbumin (BSA) i PBS (200 μL/brønn) i 1 time ved RT for passivt å dekke alle frittbindingsoverflater av platen med et irrelevant protein for analysen. En BSA-basert blokkeringsbuffer uten Triton X-100 reduserer antistoffbakgrunnen mer effektivt enn samme buffer med 0,2 % Triton X-100.
  10. Fjern løsningen.
  11. Tilsett det primære antistoffet som er valgt fortynnet i en PBS-løsning som inneholder 1 % BSA og 0,2 % Triton X-100 (120-200 μL/brønn, avhengig av antistofffortynning og tilgjengelighet). Inkuber prøvene i 2 timer.
    1. Som en negativ kontroll, ikke legg til noen primære antistoff til en av brønnene. Flere antistoffer av forskjellige arter mot forskjellige mål kan brukes samtidig. Bruk et antistoff mot MAP2 (en nevronal markør) oppvokst i kylling, et antistoff mot enten PSD95 eller synaptophysin hevet i mus, og et antistoff mot et målprotein oppvokst i kanin. Dette tillater tre-farge SIM-analyser.
  12. Vask brønnene raskt tre ganger med PBS (200 μL/brønn).
  13. Tilsett sekundære antistoffer (dyLight og Alexa sekundære antistoffer kan begge brukes) fortynnet i en PBS-løsning som inneholder 1% BSA og 0,2% Triton X-100 (200 μL / brønn). Inkuber prøvene i 1 t ved RT.
  14. Vask brønnene raskt tre ganger med PBS (200 μL/brønn).
  15. Tilsett Hoechst fargestoff i en konsentrasjon på 1 μg/ml fortynnet i PBS (200 μL/brønn) for å flekkekjerner. Inkuber prøvene i 10 minutter ved RT.
  16. Vask brønnene raskt to ganger med PBS.
  17. Monter celler ved hjelp av et SIM-kompatibelt monteringsmiddel. Bruk 10 μL/brønn av ProLong Glass Antifade Mountant.
  18. Dekk og beskytt cellene med et dekkglass (f.eks. et rundt dekkglass med en diameter på 8 mm). Firkantede kan også brukes.
  19. Oppbevar de kamret dekkglassene ved RT og vent minst 48 timer før du anskaffer bilder. Diamond Glass krever minst to dager med herding før superoppløsningsoppkjøp.

3. Antistoff spesifisitet kontroll

MERK: Bruk to strategier for å sikre antistoffspesifisitet. Den første strategien er å bruke minst to forskjellige antistoffer rettet mot samme substrat. Den andre strategien er antistoffnøytrasjon ved inkubasjon med det rensede proteinmålet eller epitopen som brukes til å heve antistoffet.

  1. Inkuber det perfekte antistoffet med fem ganger overskytende av det rekombinante målet eller epitopen i 1 time ved RT i 1 % BSA i PBS.
  2. Etter inkubasjonen, bruk det nøytraliserte antistoffet ved vanlig konsentrasjon for farging som beskrevet ovenfor fra 2,11.

4. Kalibrering av mikroskop

MERK: Vi bruker rutinemessig et N-SIM Super-Resolution Microscope System produsert av Nikon for superoppløsningsstudiene. Men flere andre selskaper tilbyr også mikroskoper med super oppløsning i katalogene sine. Selv om spesifikke indikasjoner for Nikons N-SIM-system er beskrevet, kan instruksjonene som følger generaliseres til andre systemer. Før oppkjøpet av SIM-bilder krever systemet en riktig kalibrering med spesifikke sub-oppløsning størrelse fluorescerende perler. Et eksempel er TetraSpeck mikrosfærer. Disse perlene er farget med forskjellige fluorescerende fargestoffer for å tillate kalibrering av forskjellige lasere med en prøve.

  1. I et vannbad sonikere rundt 1,8 x 108 fluorescerende mikrosfærer i 10 minutter. Nikons N-SIM-system krever en tynt befolket flerfarget perler prøve for kalibreringen. Dette kan variere for andre systemer som krever et tett enkelt lag med sub-oppløsning størrelse fluorescerende perler. Juster antall fluorescerende partikler tilsvarende.
  2. Fortynn de fluorescerende mikrosfærene 1:500 i dobbelt destillert vann.
  3. Sonicate en gang til i ytterligere 10 minutter.
  4. Pipet 15 μL av fortynnede perler i en brønn av en kamret dekkslip.
  5. La oppløsningen tørke i 5 minutter ved RT.
  6. Tilsett 10 μL av monteringsløsningen og plasser en 8 mm dekkslipp på toppen.
  7. Vent i minst 48 timer for å tillate riktig herding.
  8. Slå på mikroskopet og lasere.
  9. La systemet varme opp for å nå den termiske likevekten til alle mikroskopkomponenter. N-SIM Super-Resolution Microscope System krever minst 3 timer.
  10. Velg målsettingen 100x.
  11. Start kalibreringen ved å justere laserne til midten av diffraksjonsgitterblokken. I N-SIM-systemet tillater en mikrometerknott og et dedikert kamera sentrering av lysstrålene til målet.
  12. Sett inn den kamret dekkslippen i mikroskopet for visning. Sett systemet på den kamret dekkglasstykkelsen ved å justere objektiv korreksjonskrage. NIS-programvaren, den proprietære programvaren som leveres med N-SIM Super-Resolution Microscope-systemer, har en automatisk funksjon for å regulere korreksjonskrager.
  13. Juster risteblokkfokus for hver kanal for å sikre fokusert strukturert mønsterbelysning på prøven. NIS-programvaren gir en automatisk funksjon for denne oppgaven.
  14. Deretter får du rå 3D-SIM-bilder av flerfarget mikrosfærer. Rekonstruere rå bilder for å få et super-løst bilde ved hjelp av mikroskop programvare eller åpen kildekode programvareplattform for analyse av biologiske bilder ImageJ24 og plugin fairSIM25.
  15. Beregn, for hver separert bølgelengde, Fourier-transformeringen av det super-løste bildet oppnådd i 4,14. Hvis det transformerte bildet ikke får et riktig blomsterlignende mønster, starter du kalibreringen på nytt fra 4,11 siden superoppløsning ikke er oppnådd.
  16. I det superoppsvede bildet velger du én enkelt mikrosfære og beregner intensitetsprofilen for hver kanal for å måle oppløsningen som er oppnådd. Det skal nå være nær 100 nm lateralt.
  17. Deretter utfører du kanalregistrering ved å over legge over et flerkanals oppkjøp av mikrosfærene. Målet er å kollidere alle kanalsignaler sidealt og aksialt. Dette vil eliminere kromatiske avvik på grunn av feiljustering av de ulike kanalene og hjelpe co-lokaliseringsanalysen.
  18. Bekreft kvaliteten på kalibreringen ved hjelp av funksjonene "Illumination Phase Steps" og "Illumination Pattern Focus" av SIMcheck26, en pakke med plugins for åpen kildekode-programmet ImageJ. For dette formål, forberede en kamret coverslip for å få et tett enkelt lag av TetraSpeck mikrosfærer og skaffe seg et 3D-SIM-bilde av prøven. Analyser bildet i ImageJ, og hvis avvik oppdages, starter du mikroskopkalibrering fra trinn 4.11.

5. Oppkjøp

  1. Begynn å analysere eksemplet ved hjelp av et 40x mål i konfokal eller widefield-modus. Dette gjør det mulig å navigere til eksemplet, opprettholde gode detaljer og et stort synsfelt.
  2. Bruk MAP2 antistoffsignal til å identifisere et område som representerer nevronale prosesser.
  3. Få bilder av prøven i konfokal modus for å bestemme kvaliteten på fargingen. Dårlig konfokal kvalitet vil reflektere i dårlig SIM-kvalitet, og krever derfor at prøvene kastes.
  4. Hvis området og kvaliteten på bildene er tilfredsstillende, bytter du målet til 100x.
  5. Påfør olje på 100x målet.
  6. Skaff deg et widefield- eller konfokalbilde som senere brukes til å vurdere kvaliteten på det super-løste bildet (figur 1A,B).
  7. Bytt til 3D-SIM-modus.
  8. Bruk dialogbokser til å angi parametere for anskaffelse, og velg den høyeste bitdybdeinnstillingen som er tilgjengelig for å maksimere fargeinformasjonen. Vanligvis er 16-biters standardvalget. For å forbedre signal-til-støy-forholdet velger du også en lavfrekvent verdi for anskaffelse, for eksempel 1 MHz.
  9. Ved hjelp av histogrammet vinduer, sette lasere makt for å få en lineær respons av signal. For å unngå tap av informasjon, begrens mettede piksler i bildene. N-SIM-systemet bruker et Andor iXon3-kamera. Når du arbeider på 16-biters, velger du en målintensitet på 16 000 for å sikre kameraets lineære respons. Alternativt kan du velge et område mellom 30.000-45.000 for å maksimere det dynamiske området av oppkjøpet.
  10. Still inn lasereffekt mellom 0,1 % og 50 % når du avskriver prøvene og eksponeringstidene mellom 50 ms og 2 s. Laserkrefter over 50% kan forårsake rask fotobleking av fluoroforene i bruk.
  11. Begynn å anskaffe bildene i 3D-SIM-modus.
  12. Bruk SIMcheck, en pakke med gratis plugins for ImageJ, for å vurdere kvaliteten på oppkjøpet av råbildene.
  13. Hvis SIMCheck ikke oppdager artefakter eller kvalitetsproblemer, kan du hente minst 10 bilder fra 4 tekniske repliker for å tillate statistisk analyse.

6. Etterproduksjon: bilderekonstruksjon

MERK: 3D-SIM-anskaffede bilder er råbilder som må behandles for å få rekonstruerte supers løste bilder. Feil rekonstruksjon av råbilder kan føre til artefakter som vil påvirke analysen av prøvene. Stor oppmerksomhet bør derfor gis til riktig valg av rekonstruksjonsparametere.

  1. Behandle råbildene ved hjelp av programvaren for rekonstruksjon av mikroskop for å få et superopp løst bilde (figur 1C). Alternativt kan du bruke den fritt tilgjengelige ImageJ plugin fairSIM til å rekonstruere rå bilder.
  2. Beregn Fourier-transformeringen av de superopps løste bildene ved hjelp av mikroskoprekonstruksjonsprogramvaren eller ImageJ-plugin-SIMCheck. Et godt rekonstruert bilde skal returnere, for hver kanal, et blomsterlignende bilde. Hvis de rekonstruerte bildene ikke klarer å gjenskape en blomsterlignende form, starter du på nytt fra de rå bildene og rekonstruerer dem ved å endre rekonstruksjonsparametrene som Wiener-filtrering, apodisering og nullordreundertrykkelse27. I NIS-programvare, ved hjelp av forhåndsvisningen for å overvåke hvordan endring av parametrene påvirker det endelige løste bildet, endrer du parametrene i) Illumination Modulation Contrast, ii) Høyoppløselig støyundertrykkelse og iii) Ut av fokusundertrykkelse.
  3. Deretter analyserer du det rekonstruerte bildet for å objektivt oppdage gjenstander ved hjelp av NanoJ-SQUIRREL28, en ImageJ-basert plugin for å vurdere kvaliteten på superoppdagede bilder.
  4. Hvis NanoJ-SQUIRREL oppdager artefakter, starter du på nytt fra råbildene og rekonstruerer dem ved å endre rekonstruksjonsparametrene som Wiener-filtrering, apodisering og nullordreundertrykkelse. I NIS-programvare, ved hjelp av forhåndsvisningen for å overvåke hvordan endring av parametrene påvirker det endelige løste bildet, endrer du parametrene Illumination Modulation Contrast, High Resolution Noise Suppression og Out of Focus Suppression.
  5. Bruk de super-løste bildene til å beregne ko lokaliseringsprofilen og/eller Pearsons og Manders koeffisienter.

7. Sam lokalisering med profilanalyse

MERK: Som et første skritt for å studere sam lokalisering mellom synaptiske markører og et protein av interesse, ta et super-løst bilde og analyser en enkelt locus for å bestemme signaloverlapping.

  1. Identifiser ett enkelt gress på det super-løste bildet.
  2. Få intensitetsprofilene til de fluorescerende signalene fra interesselocus.
  3. Eksportere dataene.
  4. Bruk GraphPad Prism, eller en lignende analyseprogramvare, for å normalisere alle signaltopper og oppnå sammenlignbare signalintensiteter for hver kanal med det endelige målet om å bestemme locus spesifikk co-lokalisering.

8. Kvantifisering av Pearsons og Manders koeffisienter

MERK: Hvis profilanalyse har foreslått enkelt locus co-lokalisering, kan en mer generell analyse av hele bildet utføres ved å beregne Pearsons og Manders koeffisienter29,30.

  1. Bruk JACoP31, en ImageJ-plugin-modul, til å bestemme de to parameterne for sam lokalisering: Pearsons og Manders.

9. Statistisk analyse

  1. Bruk GraphPad Prism, eller en lignende analyse- og grafprogramvare, til å behandle data samlet inn med JACoP.
  2. Bruk minst 40 SIM-bilder for hver betingelse som analyseres for å få grafer og statistisk relevans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi presenterer her standard arbeidsflyt for å studere nevronale proteiner co-lokalisering. Vi kalibrerte først mikroskopet, og deretter utførte vi SIM-analyse av prøvene. For å kalibrere systemet brukte vi fluorescerende mikrosfærer med 0,1 μm diameter. Ved å skaffe super-løst 3D-SIM-bilder av perlene, de underliggende bildedataene er Fourier-forvandlet for å konvertere dem til en romlig frekvens representasjon. I figur 2Apresenteres det distinkte blomstermønsteret som en indikasjon på detaljnivåer med superoppløsning. Vi målte deretter oppløsningen oppnådd ved å beregne hele bredden på halv maksimum (FWHM) av toppen av en enkelt perleintensitetsprofil (figur 2B, C). Til slutt korrigerte vi kromatisk avvik ved kanalregistrering, igjen ved hjelp av fluorescerende mikrosfærer (figur 3A, B). Deretter begynte vi å analysere prøven med et mål på 100 x, og vi kjøpte 3D-SIM-bilder. Vi brukte SIMCheck til å vurdere jevnhet av feltbelysning eller bevegelse under oppkjøpet (figur 4A). Vi sjekket forskjeller i intensitet mellom belysningsmønstervinkler (figur 4B) og vi beregnet forholdet mellom modulasjonskontrasten til støy for å måle den lokale stripekontrasten (figur 4C). Til slutt estimerte vi den effektive oppløsningen av rekonstruksjonen (figur 4D).

Vi bekreftet deretter kvaliteten på de super-løste bildene ved hjelp av NanoJ-SQUIRREL. I det første rekonstruerte bildet (figur 5A)oppdaget NanoJ-SQUIRREL tilstedeværelsen av gjenstander (figur 5C). Vi endret rekonstruksjonsparametrene for å få et nytt super-løst bilde (Figur 5B) og NanoJ-SQUIRREL bekreftet mangelen på artefakter (Figur 5D). Etter å ha kalibrert systemet og vurdert kvaliteten på de rekonstruerte bildene, begynte vi deretter å analysere de primære nevronale kulturene farget med et antistoff mot MAP2, en nevronal markør, PSD95, en postsynaptisk markør og målproteinet SUMO1. Vi analyserte først prøven som utførte firekanals konfokal mikroskopi med et 40x mål (figur 6A). Ved å velge et område som representerer nevronale prosesser, byttet vi til et 100x mål. Vi kjøpte både konfokale og SIM-bilder av samme område for å vurdere kvaliteten på gjenoppbyggingen med NanoJ-SQUIRREL og utføre co-lokaliseringsanalyse. I figur 6Bviser vi det superoppløsede 3D-SIM-bildet av nevroner farget for SENP1 og drebrin. Sam lokalisering i super-løste bilder kan analyseres med profilanalyse (Figur 7A) og kvantifisering av Pearsons og Manders koeffisienter (figur 7B).

Figure 1
Figur 1: Sammenligning av widefield, confocal og SIM oppkjøp. (A)Widefield bilde av primære hippocampal nevroner immunostained for SENP1 (grønn), drebrin (rød) og MAP2 (mauve). DAPI ble brukt til å flekke kjerner. Vektlinje 5 μm. (B) Konfokalbilde av samme utvalg av panel A. (C) SIM-bilde av samme eksempel på panel A og B. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Analyse av et 3D-SIM-bilde av mikrosfærer for mikroskopkalibrering. (A) Fast Fourier forvandle et oppkjøp av mikrosfærer med sin blomsterlignende form. (B) Valg av en enkelt mikrosfære for å bestemme lateral romlig oppløsning. (C) Intensitetsprofil for enkeltmikrosfæren i B med måling av FWHM. Verdiene representerer oppløsningen som instrumentet oppnår. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Tre kanalregistreringer. (A) Oppkjøp av flerfarget (bølgelengder 488nm, 555nm og 647nm) TetraSpeck mikrosfærer før registrering. (B) Anskaffelse av samme prøve etter kalibrering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Kvalitetsvurdering av rå og rekonstruerte bilder ved hjelp av SIMcheck. (A) Bevegelses- og belysningsvariasjonsanalyse ved hjelp av SIMCheck. Signalgrå til hvit representerer homogen belysning og fravær av bevegelse under oppkjøpet. (B) Kanalintensitetsprofil oppnådd ved å analysere råbildet. I dette eksemplet er intensitetsvariasjonen minimal, noe som tyder på mangel eller bleking eller svingninger. (C) Rå modulasjon kontrast for å beregne forholdet mellom modulasjon kontrast-til-støy i bildet. Varmekartet viser kontrastvariasjoner for modulering. (D) Rekonstruert Fourier Plot for å analysere amplitude Fourier spekteret for å bestemme den effektive oppløsningen av gjenoppbyggingen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Vurdering av bildekvalitet med super oppløsning ved hjelp av NanoJ-SQUIRREL. (A) Referanse superoppløsning bilde med gjenstander. (B) Referanse super oppløsning bilde av god kvalitet. (C) Bilde som representerer NanoJ-SQUIRREL feilkart over A. Lettere områder representerer store gjenstander, mens mørkere representerer riktig rekonstruksjon. (D) NanoJ-SQUIRREL feil kart over B. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: EKSEMPEL PÅ SIM-bilde. (A)Konfokal mikroskopi av primære nevroner. Et 40X-mål ble valgt for å få en oversikt over utvalget samtidig som det opprettholdes god oppløsning. Cellene ble immunostained for SUMO1 (grønn), PSD95 (rød) og MAP2 (mauve). DAPI ble brukt til å flekke kjerner. Vektstangen 50 μm. Bilder ble vist som Z-projeksjon. (B) SIM-bilder for SUMO1 og PSD95 på området uthevet i den grønne boksen i panel A ved hjelp av et 100X-mål. Røde pilhoder angir posisjonen til inntasten som vises i A som brukes til å beregne intensitetsprofilen. Skala bar 5 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Analyse av sam lokalisering. (A)Super-løst bilde av primære nevroner farget med et antistoff mot SENP1 (i grønt) og drebrin (i rødt), skala bar 0,5 μm, og dens intensitet profil. Verdiene i diagrammet ble normalisert for hver kanal til 100 (vilkårlig enhet) og tilsvarer pikselintensiteten som vises av den blå pilen. (B)Analyse ved hjelp av JACoP for å beregne Pearsons korrelasjonskoeffisient og Manders koeffisient mellom SENP1 og drebrin. Windows i plugin-modulen som er konfigurert og visuell terskel, vises. Manders koeffisient uttrykkes med to verdier – SENP1-brøk som samenes med drebrin (M1) og drebrinfraksjonen som samenes med SENP1 (M2). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Belyse strukturen og sammensetningen av synapsen er avgjørende for å forstå de fysiologiske og patologiske prosessene som regulerer hukommelse og kognisjon. Mens de er i normal tilstand, synapser er byggesteinene i minnet, de ligger også til grunn for komplekse nevrologiske lidelser som Alzheimers sykdom32. Protokollen som er beskrevet her tjener til å studere co-lokalisering av nevronale proteiner med en superoppløsning mikroskopi teknikk kalt SIM. Ved hjelp av et bestemt belysningsmønster kan SIM-kortet nå en oppløsning på ca. 0,1 μm, som er egnet for studiet av synapser, som normalt måler mellom 0,03 og 0,15 μm. For enda større detaljer, andre super-oppløsning teknikker som STED (Stimulert utslipp uttømming mikroskopi), PALM (PhotoActivated lokalisering mikroskopi) eller STORM (Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi), som kan nå en oppløsning på 10-20 nm, kan brukes33.

Her beskriver vi analysen av sam lokalisering av målproteiner med synaptiske markører i primære nevroner. Protokollen kan brukes på enhver primær kultur av nevronale celler, som hippocampal, cerebellar eller kortikale nevroner og til og med til kulturer av primære nevroner som ikke tilhører sentralnervesystemet, for eksempel enteriske nervesystemnevroner. Nøkkelen til analysen på superoppløsningsnivå er imidlertid reagensene som brukes under oppkjøpet, for eksempel kamret dekkslips og monteringsløsninger som er kompatible med diffraksjonsindeksen for målet. Vi brukte kamret dekkglass for deres brukervennlighet, men den klassiske, billigere metoden for å dyrke primære nevroner på belagt dekkglass er likevel gyldig, spesielt med høy presisjon #1,5H (0,17 mm) dekkglass. I tillegg bør et monteringsmedie som kan nå en brytningsindeks så nært som mulig til brytningsindeksen for glass (1,52) og en nedsenkingsolje for 100x-målet med en brytningsindeks på 1,515 brukes. Konstant romtemperatur og stabiliserte bord er også obligatoriske for å garantere nøyaktigheten av oppkjøpene.

Vi bruker både dyLight og Alexa sekundære antistoffer i SIM-studiene. På grunn av sine smale topper av eksitasjon og utslipp og god kvanteutbytte, er de indikert for superoppløsningsteknikker som krever det beste signal-til-støyforholdet. Dempsey et al. sammenlignet Alexa, dyLight og andre fluoroforer for superoppløsningsavbildning34.

Under oppkjøpet setter vi rutinemessig kameraet på 1 MHz over 10 MHz. 1 MHz, takket være en langsommere oppkjøpshastighet, gir bildene mer nøyaktighet og mindre støy enn 10 MHz. 1 MHz innleggelsesmodus kan også ta opp med litt dybde på 16 bit (sammenlignet med maksimalt 14-biters 10 MHz), noe som gir mer fargeinformasjon og en mer presis fargegradient til bildene. Men 10 MHz, med sin hastighet, er nyttig for levende bilder. For å unngå bleking og bevare fluorofor, setter vi også laserkraft så lavt som mulig. For å forbedre signalintensiteten kan gevinstverdiene økes. Det er verdt å legge til at lavere gevinst garanterer renere bilder uten å øke støy. Generelt oppnås de beste resultatene mens de bildes av innen 7 μm fra bunnen av den kamret dekkslipsen. Dette er spesielt viktig når du bruker et 100x mål med olje nedsenking. Hvis dypere oppkjøp på tvers av cellene / vev er nødvendig, kan et bedre valg være bruk av et 60x mål med vann nedsenking.

En av de viktigste utfordringene med å utføre SIM-studier er bilderekonstruksjon35. Å skaffe super-løste bilder uten gjenstander og avvik krever ikke bare bruk av ad hoc eksperimentelle forhold, men også forsiktig kalibrering av systemet og parameteroptimalisering for å få de endelige bildene. I protokollen beskriver vi hvordan vi kan unngå noen av de vanligste feilene ved å vurdere kalibrering av systemet og kvalitetsanalyse av rå og rekonstruerte bilder. Spesielt beskriver vi bruken av ImageJ plugins SIMCheck og NanoJ-SQUIRREL for å sikre riktige instrumentinnstillinger for å forhindre vanlige artefakter av super-løste bilder. Søknadene åpner for en objektiv kvalitetsvurdering av de endelige bildene som ikke er basert på subjektiv benchmarking resultatene mot forkunnskaper om studiestrukturene.

Vi foreslår at du bruker synaptophysin og PSD95 eller drebrin som pre- og post-synaptiske markører, selv om andre markører også er gyldige. En stor mengde litteratur beskriver proteiner som fagott som synaptiske markører36,37. Det er verdt å merke seg at pre- og postsynaptiske markører er imidlertid tilstede i hele cellen, unntatt kjernen. Mye av signalet deres er ikke-synaptisk, men representerer proteiner i transport eller nedbrytning, bakgrunn eller andre gjenstander. Det er derfor viktig å nøye velge analyseområdet. Vi bruker MAP2 antistoffsignal til å velge axon og dendrittiske terminaler.

I analysen av sam lokalisering bruker vi to tilnærminger. Den første er en visuell tilnærming, basert på profilanalyse som viser enkelthendelser av sam lokalisering og identifiserer bidraget fra hver kanal. En påminnelse om denne tilnærmingen er imidlertid den dårlige statistiske kraften. Av denne grunn bestemte vi oss også for å bruke en annen metode basert på analyse av et større antall hendelser som er representative for hele feltet for hvert bilde. Denne metoden er basert på beregning av Pearsons korrelasjonskoeffisient og Manders M1- og M2-koeffisienter. Vi bruker Pearsons korrelasjonskoeffisient til å beskrive overlappingen av signaler i bildet og Manders M1 og M2 for å beskrive gjensidig samlokalisering mellom signaler av interesse38. For beregningen bruker vi ImageJ plugin JACoP, siden den har en funksjon som lar deg sette en manuell terskel for å forkaste ethvert bakgrunnsbidrag til analysen, spesielt kritisk for Manders analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Edoardo Micotti for konstruktiv kritikk av manuskriptet. Denne studien ble støttet av BrightFocus A2019296F, av Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), av Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) og av Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (JK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan blue solution  Thermo Fisher Scientific 15250061 Chemical
70 µm filter  Corning 352350 Equiment
Alexa Thermo Fisher Scientific - Antibody
Antibody SENP1 Santa Cruz sc-271360 Antibody
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Chemical
Bovine serum albumin  Merck 5470 Chemical
CaCl2 Merck Life Science 21115 Chemical
Chambered coverslips Ibidi 80826 Equiment
DyLight Thermo Fisher Scientific - Antibody
FBS (Hyclone) GIBCO SH3007002 (CHA1111L) Serum
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent Thermo Fisher Scientific F8803 Equiment
Glucose Merck Life Science G8769 Chemical
Glutamax GIBCO 35050061 Chemical
HEPES Merck Life Science H3537 Chemical
L-Cystein  Merck Life Science  C6852-25g Chemical
MAP2 Merck AB15452 Antibody
MEM  Life Technologies 21575022 Medium
MgCl Merck Life Science M8266 Chemical
NaOH VWR International 1,091,371,000 Chemical
Neurobasal A Life Technologies 10888022 Medium
N-SIM Super Resolution Microscope Nikon - Instrument
Papain Merck Life Science  P-3125 Chemical
paraformaldehyde  Thermo Fisher Scientific 28908 Chemical
Pen/Strep 10x Life Technologies 15140122 Chemical
phosphate-buffered saline  Gibco 10010023 Chemical
Poly-L lysine Sigma P2636 Chemical
ProLong Diamond Glass Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970 Chemical
PSD95  NeuroMab K28/43 Antibody
Round coverglass Thermo 12052712 Equiment
SUMO1 Abcam ab32058 Antibody
Synaptophysin  Merck S5768  Antibody
Triton X-100  Merck T8787 Chemical
Trypsin inhibitor  Merck Life Science  T9003-500MG Chemical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foster, M., Sherrington, C. S. A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , MacMillan & Co Ltd. London. (1897).
  2. Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
  3. McAllister, A. K. Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).
  4. Yuzaki, M. Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System. Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).
  5. Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
  6. Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
  7. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
  8. Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
  9. Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy. Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).
  10. Yang, X., Specht, C. G. Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).
  11. Monro, T. Beyond the diffraction limit. Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).
  12. Won, R. Eyes on super-resolution. Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).
  13. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).
  14. Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
  15. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  16. Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  17. Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P. Synaptopathy: dysfunction of synaptic function. Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).
  18. Tyebji, S., Hannan, A. J. Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington's disease. Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).
  19. Won, H., Mah, W., Kim, E. Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).
  20. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. The State of Synapses in Fragile X Syndrome. The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).
  21. Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability. Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).
  22. Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem. International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).
  23. Colnaghi, L., et al. Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).
  26. Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
  27. Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach. Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).
  28. Culley, S., et al. NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts. Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
  29. Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images. Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).
  30. Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
  31. Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
  32. Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
  33. Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
  34. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  35. Karras, C., et al. Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide. Optics Communications. 436, 69-75 (2019).
  36. Bereczki, E., et al. Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach. Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).
  37. Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila. Science. 324 (5923), 109-112 (2009).
  38. Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).

Tags

Nevrovitenskap utgave 164 Nevrovitenskap Hjerne Primær nevronal kultur mikroskopi Superoppløsning
Superoppløsningsavbildning for å studere samtidig lokalisering av proteiner og synaptiske markører i primære nevroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Russo, L., Natale, C., Conz, A.,… More

Russo, L., Natale, C., Conz, A., Kelk, J., Restelli, E., Chiesa, R., Salmona, M., Fioriti, L., Colnaghi, L. Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons. J. Vis. Exp. (164), e61434, doi:10.3791/61434 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter