Vurdering af cellulære målengagement ved SHP2 (PTPN11) Fosfatasehæmmere
Summary
Evnen til at vurdere målet engagement af kandidathæmmere i intakte celler er afgørende for lægemiddel opdagelse. Denne protokol beskriver en 384 godt format cellulære termisk skift assay, der pålideligt registrerer cellulære mål engagement af hæmmere rettet mod enten vilde type SHP2 eller dens onkogene varianter.
Abstract
Den Src-homologi 2 (SH2) domæne-holdige fosfatase 2 (SHP2), kodet af PTPN11 proto-oncogene, er en vigtig mægler af receptor tyrosin kinase (RTK)-drevet celle signalering, fremme celle overlevelse og spredning. Desuden rekrutteres SHP2 af immunkontrolpunktreceptorer for at hæmme B- og T-celleaktivering. Afvigende SHP2 funktion har været involveret i udvikling, progression, og metastase af mange kræftformer. Faktisk, små molekyle SHP2 hæmmere har for nylig indgået kliniske forsøg til behandling af faste tumorer med Ras/Raf/ERK vej aktivering, herunder tumorer med nogle onkogen Ras mutationer. Men, den nuværende klasse af SHP2 hæmmere er ikke effektiv mod SHP2 onkogen varianter, der forekommer ofte i leukæmi, og udviklingen af specifikke små molekyler, der er målrettet onkogene SHP2 er genstand for aktuel forskning. Et fælles problem med de fleste drug discovery kampagner, der involverer cykliske proteiner som SHP2 er, at de primære analyser, der driver kemiske opdagelse er ofte in vitro assays, der ikke rapporterer cellulære mål engagement kandidat forbindelser. For at give en platform til måling af cellulære mål engagement, vi udviklet både vilde-type og mutant SHP2 cellulære termisk skift analyser. Disse analyser registrerer pålideligt målengagementet af SHP2-hæmmere i celler. Her giver vi en omfattende protokol af denne analyse, som giver et værdifuldt værktøj til vurdering og karakterisering af SHP2-hæmmere.
Introduction
Tyrosinphosphorylation spiller en vigtig rolle i signaltransduktion i celler1,2. Denne post-translationelle modifikation er katalyseret af protein tyrosin kinaser (PTKs) og vendt af protein tyrosin fosfataser (PtPs). Derfor, afvigende PTK eller PTP funktion fører til mange arvelige eller erhvervede menneskeligesygdomme 3,4,5,6. Den Src-homologi 2 (SH2) domæne-holdige fosfatase 2 (SHP2) er en bredt udtrykt ikke-receptor type PTP kodet af proto-oncogene PTPN117 og er en central regulator af mange fysiologiske processer, der involverer signal transduktion ved aktivering af Ras / Raf / ERK, PI3K / Akt, eller JAK / STAT signalering veje8. Normalt er SHP2-aktivitet stramt reguleret for at forhindre afvigende signalering. Under basale forhold er SHP2 automatisk fanget af sit N-terminal SH2-domæne, som blokerer adgangen til det aktive sted inden for det katalytiske fosfatasedomæne (Figur 1A)9,10. Ved celleaktivering rekrutterer tyrosinfosforholdige bindende proteiner SHP2, hvilket får det til at vedtage sin aktive kropsbygning, hvor det aktive sted nu er tilgængeligt for dets underlag. I mange kræftformer SHP2 aktivitet er forhøjet. Somatiske gain-of-function -mutationer (GOF) i PTPN11 er hovedsageligt blevet identificeret i leukæmi og forhindrer binding af N-SH2-domænet til fosfatasedomænet, hvilket resulterer i konstituerende aktiv SHP2 (Figur 1B)11. Kønsskifte GOF mutationer i PTPN11 er ansvarlige for ~ 50% af tilfælde af Noonan syndrom, en udviklingsforstyrrelse med en øget risiko for malignitet12. I faste tumorer, hvor PTPN11 mutationer er sjældne, fører større niveauer af fosforylerede bindende proteiner til øget SHP2-aktivitet (Figur 1C). SHP2 er også vigtigt for immun checkpoint signalering, som checkpoint receptorer såsom BTLA eller PD-1 rekruttere SHP2 til dephosphorylate nøgle signalering molekyler, forhindrer immuncelleaktivering13,14,15.
Målretning af PtPs med små molekyler har været en udfordring, fordi det aktive sted for PtPs er stærkt bevaret og stærkt opladet; hæmmere, der er målrettet mod det aktive sted, er ofte potente , men udviser dårlig selektivitet og oral biotilgængelighed16,17,18,19,20,21,22. Faktisk lider mange rapporterede SHP2-hæmmere af dårlig selektivitet og manglende effekt icellerne 23. For nylig er der rapporteret allosteriske hæmmere af SHP2 med god styrke og fremragende selektivitet (f.eks.24 25 Forbindelser baseret på SHP099 og RMC-4550 er i øjeblikket i fase I kliniske forsøg til behandling af faste tumorer med receptor tyrosin kinase (RTK) pathway aktivering26,27. Mens banebrydende, disse forbindelser er ineffektive mod mange af de SHP2 onkogene mutanter, der driver leukemogenese i et betydeligt antalblodkræftpatienter 28,,29,30. Denne mangel på styrken af SHP099-lignende forbindelser mod SHP2 oncogenic varianter stammer fra deres unikke allosteriske mekanisme, da de hæmmer SHP2 aktivitet ved at binde og stabilisere den inaktive, lukkede kropsbygning, som forstyrres i SHP2 mutanter. Yderligere, baseret på en nyligrapport 31, adaptive resistens mekanismer hos patienter behandlet med SHP099-lignende hæmmere er ganske tænkeligt. Derfor er udviklingen af næste generation af SHP2-hæmmere, der er målrettet sin aktive, åbne tilstand, genstand for intens forskning.
Karakteriseringen af nye SHP2-hæmmere i celler er et væsentligt aspekt af blyoptimeringsprocessen. Kritisk, bevist mål engagement af inhibitor under fysiologiske forhold giver en ekstra grad af tillid til, at ressourcer til medicinsk kemi er effektivt indsat på forbindelser med lovende cellulære effekt. Tidligere er der udviklet flere metoder til vurdering af bindingen af små molekylehæmmere til deres mål, primært for proteinkinaser32. For at udvikle en SHP2 cellulære mål engagement assay, vi udnyttede en cellulær termisk skiftassay 33. Denne analyse, svarende til in vitro termisk skift (PTS) analyse for proteiner34, overvåger målet protein termisk stabilitet, som typisk ændres ved binding af små molekyler. Den oprindelige analyse er en lav throughput assay, der udnytter antistoffer til at kvantificere mål proteinniveauer. Alternativt valgte vi en nyligt rapporteret variant af den termiske skiftanalyse, der anvender en β-galactosidase enzymfragment komplementering (EFC) assay(Figur 2)35. For disse eksperimenter udtrykkes det interesseprotein, der er af interesse, i celler som et N- eller C-terminal fusionsprotein med et forbedret ProLabel-mærke (ePL, et 42 aminosyrefragment af β-galactosidase). Celler overføres derefter til 384-brønd PCR-kompatible plader og inkuberes med interesseforbindelser. En termocykmager anvendes til at anvende en temperaturgradient på cellerne, hvis proteiner vil protese og samle som temperaturen stiger baseret på deres termiske stabilitet. En kandidatforbindelses evne til at binde og stabilisere proteinet af interesse vil resultere i en øget termisk stabilitet af dette protein. Derfor, efter lysis af cellerne, de mærkede proteiner, der er blevet stabiliseret af en kandidat sammensatte vil forblive i opløsning ved højere temperaturer end mærkede proteiner af celler inkuberet med køretøjet kontrol. Reporter enzym acceptor (EA) er i stand til at supplere de opløselige ePL-mærkede proteiner, hvilket resulterer i påviselige β-galactosidase aktivitet ved hjælp af en luminescens substrat.
Vi har for nylig udviklet en robust cellulær termisk skift assay for wild-type SHP2 (SHP2-WT) og en hyppig SHP2 onkogene variant (SHP2-E76K) i en miniaturiseret 384-godt format36. Her rapporterer vi en detaljeret protokol for denne analyse, som pålideligt registrerer målengagement fra SHP2-hæmmere i celler og viser en høj grad af korrelation mellem inhibitor-styrke og cellulære termiske skiftdata. Den generelle analysearbejdsgang er illustreret i figur 3. Vores platform bruger N-terminalt mærkede fuld længde ePL-SHP2 fusion proteiner. For generering af de tilsvarende pICP-ePL-N-SHP2-WT og pICP-ePL-N-SHP2-E76K udtryk plasmider, henvises til vores seneste publikation36. Denne analyse kan udføres ved hjælp af en termisk gradient til at etablere SHP2 termiske profiler og bestemme SHP2 smeltetemperaturer i tilstedeværelse eller fravær af inhibitor. Når termiske profiler er blevet etableret, kan det også udføres under isotermiske forhold, så inhibitor dosis-respons vurdering. Begge typer af eksperimenter er beskrevet nedenfor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har præsenteret et mål engagement assay, der kan bekræfte direkte binding af små molekyler til SHP2 fosfatase i celler. Analysen kan diskriminere mellem lav- og højaffinitetshæmmere og, hvad der er vigtigt, bekræfte en mangel på styrke fra de allosteriske hæmmere af SHP099-typen for den gof onkogenic SHP2-E76K-mutant. En styrke af denne miniaturiseret analyse er dens evne til at blive integreret i en SHP2-hæmmer screening kampagne. Analysens evne til at bekræfte intracellulær binding til SHP2 af ukendt kem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (til L. T.), Epstein Family Foundation Award (til N. D. P.C.), og NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199. Derudover er dette projekt blevet finansieret helt eller delvist med føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Chemical Biology Consortium Contract No. HHSN261200800001E. Indholdet af denne publikation afspejler ikke nødvendigvis de synspunkter eller politikker Department of Health and Human Services, heller ikke omtale af handelsnavne, kommercielle produkter eller organisationer indebærer godkendelse af den amerikanske regering. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra de nationale sundhedsinstitutter.
Materials
| 384-well gradient equipped thermocycler | Eppendorf AG | X50h | |
| 384-well low dead volume microplate Echo qualified | Beckman Coulter, Inc. | LP-0200 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner Bio-One | 657 160 | Sterile with lid |
| Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | |
| Cell counter | Thermo Fisher Scientific | Countess II FL | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566-016 | 500 mL |
| Echo acoustic liquid handler | Beckman Coulter, Inc. | Echo 550 | |
| Electronic multichannel pipette | Thermo Fisher Scientific | E1 ClipTip | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140-079 | 500 mL |
| HEPES buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630-680 | 100 mL |
| InCell Pulse starter kit | Eurofins DiscoverX Corp. | 94-4007 | Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate |
| Microplate reader | Tecan Trading AG | Spark | |
| Single channel solution trough | Thermo Fisher Scientific | S253012005 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-010 | 100 mM |
| Thermal microplate sealer | Agilent Technologies, Inc. | PlateLoc | |
| Transfection reagents | Polyplus Transfection | jetPRIME | |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| TrypLE Express reagent | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | |
| Twin.tec 384 real-time PCR plates | Eppendorf AG | 30132734 |
References
- Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
- Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
- Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).
- Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
- Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
- Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases–from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
- Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
- Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
- Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
- Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
- Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. . Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, 771-809 (2010).
- Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
- Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
- Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
- Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. Targeting the PTPome in human disease. Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).
- Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
- Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
- Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
- He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
- Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
- Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
- Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
- . Clinical Trial NCT03114319 Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019)
- . Clinical Trial NCT03634982 Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019)
- Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
- LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).
- Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).
- Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
- Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
- McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
- Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
- Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).
