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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Évaluation de l’engagement des cibles cellulaires par inhibiteurs de la phosphatase SHP2 (PTPN11)

Published: July 17, 2020 doi: 10.3791/61457
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Cancer Metabolism & Signaling Networks Program, NCI-Designated Cancer Center, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

Summary

La capacité d’évaluer l’engagement cible par les inhibiteurs candidats dans les cellules intactes est cruciale pour la découverte de médicaments. Ce protocole décrit un test de décalage thermique cellulaire de format 384 qui détecte de façon fiable l’engagement cellulaire des inhibiteurs ciblant soit le SHP2 de type sauvage, soit ses variantes oncogènes.

Abstract

Le domaine src-homologie 2 (SH2) contenant de la phosphatase 2 (SHP2), codé par le proto-oncogène PTPN11, est un médiateur clé de la signalisation cellulaire axée sur la tyrosine des récepteurs (RTK), favorisant la survie et la prolifération cellulaires. En outre, SHP2 est recruté par les récepteurs de point de contrôle immunitaire pour inhiber l’activation des cellules B et T. La fonction Aberrante de SHP2 a été impliquée dans le développement, la progression, et la métastase de beaucoup de cancers. En effet, de petits inhibiteurs de la molécule SHP2 ont récemment participé à des essais cliniques pour le traitement de tumeurs solides avec activation de la voie Ras/Raf/ERK, y compris des tumeurs avec quelques mutations oncogènes de Ras. Cependant, la classe actuelle des inhibiteurs de SHP2 n’est pas efficace contre les variantes oncogènes de SHP2 qui se produisent fréquemment dans les leucémies, et le développement de petites molécules spécifiques qui ciblent le SHP2 oncogène fait l’objet de recherches actuelles. Un problème commun avec la plupart des campagnes de découverte de drogue impliquant des protéines cytosoliques comme SHP2 est que les analyses primaires qui conduisent à la découverte chimique sont souvent des analyses in vitro qui ne signalent pas l’engagement cible cellulaire des composés candidats. Pour fournir une plate-forme pour mesurer l’engagement cellulaire de la cible, nous avons développé des analyses thermiques cellulaires SHP2 de type sauvage et mutantes. Ces analyses détectent de manière fiable l’engagement cible des inhibiteurs du SHP2 dans les cellules. Ici, nous fournissons un protocole complet de cet essai, qui fournit un outil précieux pour l’évaluation et la caractérisation des inhibiteurs du SHP2.

Introduction

La phosphorylation de la tyrosine joue un rôle important dans la transduction du signal dansles cellules 1,2. Cette modification post-translationnelle est catalysée par des kinases de tyrosine protéique (PTKs) et inversée par des phosphatases de tyrosine protéique (PPR). Par conséquent, la fonction aberrante de PTK ou de PTP mène à beaucoup de maladies humaineshéritées ou acquises 3,,4,,5,,6. Le Src-homology 2 (SH2) contenant du domaine phosphatase 2 (SHP2) est un PTP de type non récepteur largement exprimé codé par le PTPN117 proto-oncogène et est un régulateur clé de nombreux processusphysiologiquesqui impliquent la transduction du signal par activation des voies de signalisation Ras/Raf/ERK, PI3K/Akt ou JAK/STAT. Normalement, l’activité SHP2 est étroitement réglementée afin d’éviter la signalisation aberrante. Dans des conditions basales, SHP2 est autoinhibited par son domaine SH2 N-terminal, qui bloque l’accès au site actif dans le domaine catalytique de phosphatase (Figure 1A)9,10. Lors de l’activation cellulaire, les protéines liant la tyrosine phosphorylatées recrutent le SHP2, ce qui lui fait adopter sa conformation active, dans laquelle le site actif est désormais accessible à ses substrats. Dans de nombreux cancers, l’activité SHP2 est élevée. Des mutations somatiques de gain de fonction (GOF) dans PTPN11 ont été identifiées principalement dans les leucémies et empêchent la liaison du domaine de N-SH2 au domaine de phosphatase, ayant pour résultat le SHP2 constitutif actif (figure 1B)11. Germline GOF mutations dans PTPN11 sont responsables d’environ 50% des cas de syndrome de Noonan, un trouble du développement avec un risque accru de malignité12. Dans les tumeurs solides, où les mutations PTPN11 sont rares, des niveaux plus élevés de protéines liantes phosphorylatées conduisent à une activité SHP2 améliorée (Figure 1C). SHP2 est également important pour la signalisation de point de contrôle immunitaire, car les récepteurs de point de contrôle tels que BTLA ou PD-1 recrutent SHP2 pour déphosphorylate molécules de signalisation clés, empêchant l’activation des cellulesimmunitaires 13,14,15.

Cibler les PNP avec de petites molécules a été un défi, parce que le site actif des PNP est fortement conservé et très chargé; les inhibiteurs qui ciblent le site actif sont souvent puissants, mais présentent une faible sélectivité et biodisponibilité orale16,17,18,19,20,21,22. En effet, beaucoup d’inhibiteurs rapportés de SHP2 souffrent de la sélectivité pauvre et du manque d’efficacité dans lescellules 23. Récemment, des inhibiteurs allosteriques de SHP2 avec la bonne puissance et l’excellente sélectivité ont été rapportés (par exemple, SHP09924 et RMC-455025)et ont suscité l’intérêt renouvelé pour des inhibiteurs de SHP2. Les composés basés sur SHP099 et RMC-4550 sont actuellement en phase I essais cliniques pour traiter les tumeurs solides avec récepteur tyrosine kinase (RTK) activation de la voie26,27. Bien que révolutionnaires, ces composés sont inefficaces contre de nombreux mutants oncogènes SHP2 qui conduisent la leukemogenèse chez un nombre important de patients atteints d’un cancer dusang 28,29,30. Ce manque de puissance des composés de type SHP099 vers les variantes oncogènes SHP2 provient de leur mécanisme allosterique unique, car ils inhibent l’activité SHP2 en liant et en stabilisant la conformation inactive et fermée, qui est perturbée chez les mutants SHP2. En outre, basé sur un rapport récent31, les mécanismes adaptatifs de résistance dans les patients traités avec des inhibiteurs SHP099-like sont tout à fait concevables. Par conséquent, le développement d’inhibiteurs SHP2 de prochaine génération qui ciblent son état actif et ouvert fait l’objet d’intenses recherches.

La caractérisation de nouveaux inhibiteurs du SHP2 dans les cellules est un aspect essentiel du processus d’optimisation du plomb. L’engagement cible éprouvé de l’inhibiteur dans des conditions physiologiques fournit un niveau supplémentaire de confiance que les ressources pour la chimie médicinale sont efficacement déployées sur des composés avec l’efficacité cellulaire prometteuse. Dans le passé, plusieurs méthodes pour évaluer la liaison des inhibiteurs de petites molécules à leurs cibles ont été développées, principalement pour les kinases protéiques32. Pour développer un essai cellulaire d’engagement de cible de SHP2, nous avons utilisé un essai cellulaire de décalage thermique33. Cet essai, semblable à l’analyse in vitro de décalage thermique (PTS) pour les protéines34,surveille la stabilité thermique cible de protéine, qui est typiquement modifiée par la liaison des petites molécules. L’analyse originale est un test de faible débit qui utilise des anticorps pour quantifier les niveaux de protéines cibles. Alternativement, nous avons choisi une variante récemment rapportée de l’essai de décalage thermique qui utilise un essai de complémentation de fragment d’enzyme de β-galactosidase (EFC) essai (figure 2)35. Pour ces expériences, la protéine d’intérêt est exprimée dans les cellules comme une protéine de fusion N- ou C-terminal portant une étiquette prolabel améliorée (ePL, un fragment d’acide aminé de 42 β-galactosidase). Les cellules sont ensuite transférées dans des plaques compatibles PCR de 384 puits et incubées avec des composés d’intérêt. Un thermocycleur est utilisé pour appliquer un gradient de température sur les cellules, dont les protéines dénoaturent et s’agrègent à mesure que la température augmente en fonction de leur stabilité thermique. La capacité d’un composé candidat de lier et de stabiliser la protéine d’intérêt se traduira par une stabilité thermique accrue de cette protéine. Par conséquent, à la suite de la lyse des cellules, les protéines étiquetées qui ont été stabilisées par un composé candidat resteront en solution à des températures plus élevées que les protéines étiquetées des cellules incubées avec le contrôle du véhicule. L’accepteur d’enzymes reporter (EA) est capable de compléter les protéines solubles étiquetées ePL, ce qui entraîne une activité détectable de β-galactosidase à l’aide d’un substrat de luminescence.

Nous avons récemment développé un essai cellulaire robuste de décalage thermique pour le SHP2 sauvage-type (SHP2-WT) et une variante oncogène fréquente de SHP2 (SHP2-E76K) dans un format miniaturisé de 384 puits36. Ici, nous rapportons un protocole détaillé de cet essai, qui détecte de manière fiable l’engagement cible par les inhibiteurs de SHP2 dans les cellules et démontre un degré élevé de corrélation entre la puissance d’inhibiteur et les données cellulaires de décalage thermique. Le flux de travail général d’analyse est illustré à la figure 3. Notre plate-forme utilise des protéines de fusion ePL-SHP2 en phase terminale N. Pour la génération des plasmides d’expression pICP-ePL-N-SHP2-WT et pICP-ePL-N-SHP2-E76K, veuillez consulter notre récente publication36. Cet essai peut être effectué à l’aide d’un gradient thermique pour établir des profils thermiques SHP2 et déterminer les températures de fusion du SHP2 en présence ou en l’absence d’inhibiteur. Une fois que les profils thermiques ont été établis, il peut également être effectué dans des conditions isothermales, permettant l’évaluation de dose-réponse d’inhibiteur. Les deux types d’expériences sont décrits ci-dessous.

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Protocol

1. Préparation de la culture cellulaire et des reagents

  1. Formuler une bouteille de 500 mL de supports de croissance avec 10 % de sérum bovin fœtal, 1x antibiotique/antimicotique, 20 mM HEPES et 1 mM de pyruvate de sodium. Conserver à 4 °C.
  2. Décongeler les reagents cellulaires de décalage thermique (réageni EA, tampon de lyse et substrat) à partir de bouteilles de bouillon d’origine congelées.
  3. Distribuez les reagents et tampons sous forme d’aliquots de 2 mL et stockez-les à -20 °C.
    REMARQUE : Évitez le gel/dégel pour la reproductibilité et n’utilisez que le volume de réaccente requis pour la procédure d’analyse.

2. Croissance et entretien des cellules HEK293T

  1. Obtenez des cellules HEK293T adhérentes à faible passage à partir du stockage cryo.
  2. Maintenir les cellules HEK293T dans les supports de croissance à 37 °C, 5 % de CO2.
  3. Divisez les cellules tous les 4 jours dans un rapport de 1:14.
    REMARQUE : Pour de meilleures performances, les cellules HEK293T ne sont pas autorisées à passer plus de 25 fois.

3. Préparation de cellules HEK293T pour la passation transitoire

  1. Détachez les cellules HEK293T des plaques de 16 mL à l’aide de 3 mL du réagentinement du détachement cellulaire.
  2. Diluer avec 12 mL de supports de croissance. Recueillir les cellules par centrifugation à 1 400 x g pendant 4 min.
  3. Resuspendez la pastille dans un média de croissance de 10 mL. Mesurer la concentration et la viabilité des cellules à l’aide du bleu trypan et d’un compteur cellulaire.
  4. Plaque 7.0 x 105 cellules HEK293T croissance exponentielle par puits dans une plaque de culture cellulaire de 6 puits environ 24 h avant transfection.
    REMARQUE : Réservez un puits pour que chaque plasmide soit transfecté.
  5. Incuber pendant 24 h à 37 °C, 5 % de CO2.

4. Transfection des cellules HEK293T

  1. À partir d’un stock de plasmides purifiés de pICP-ePL-N-SHP2-WT ou pICP-ePL-N-SHP2-E76K (~200 ng/μL) diluer 2 μg d’ADN plasmide en 200 μL de tampon de transfection.
  2. Vortex pour 10 s et centrifugeuse à 1400 x g pendant 4 min.
  3. Ajouter 4 μL de réagencé de transfection à l’ADN dilué. Vortex pour 10 s et centrifugeuse à 1400 x g pendant 4 min.
  4. Incuber à 23 °C pendant 10 min.
  5. Retirez la plaque de 6 puits contenant des cellules HEK293T en croissance de l’incubateur. Ajouter le mélange de transfection aux cellules attachées dans la plaque de 6 puits. Incuber pendant 24 h à 37 °C, 5 % de CO2.

5. Préparation des plaques d’essai

  1. Préparez des solutions de stock de 10 mM en DMSO de composés à tester.
  2. Distribuez des solutions d’inhibiteur dans une plaque source à faible volume mort de 384 puits pour une utilisation immédiate.
  3. Placez le volume désiré d’inhibiteurs ou de véhicule (DMSO) à l’aide d’un gestionnaire liquide dans des plaques PCR en temps réel de 384 puits à un volume final cible inférieur à 0,5 % DMSO (v/v). Sceller la plaque à l’aide d’un scellant à plaque avec une purge inerte au gaz.
    REMARQUE : Pour les analyses dose-réponse des inhibiteurs, assurez-vous de remblayer le DMSO en conséquence afin que des quantités égales de DMSO soient utilisées pour chaque concentration d’inhibiteurs. Pour de meilleurs résultats, conservez les assiettes à 23 °C et utilisez des assiettes à moins de 24 h.

6. Détachement et préparation des cellules transfected

  1. Préincuber les supports de croissance et le réapprovisionnement en détachement cellulaire dans un bain d’eau de 37 °C. Retirer les cellules transfectées de l’incubateur. Aspirez doucement les supports des puits de la plaque.
    REMARQUE : Utilisez un nouvel aspirateur pour chaque puits qui contient un plasmide transfected différent.
  2. Ajouter 0,3 mL du réageni du détachement cellulaire. Bercer délicatement la plaque d’avant en arrière pour bien couvrir la surface du fond de la plaque. Incuber à 23 °C pendant 2 min.
  3. Ajouter 1 mL de supports de croissance à chaque puits. Pipette doucement les supports et les cellules du puits et transférer dans un tube de centrifugeuse Falcon de 15 mL. Recueillir les cellules par centrifugation à 1 400 x g pendant 4 min.
  4. Aspirez doucement mais soigneusement les médias.
    REMARQUE : Le rouge phénol résiduel dans le réaménageur de détachement cellulaire peut interférer avec l’essai.
  5. Resuspendez soigneusement la pastille cellulaire dans 2 mL de supports de croissance. Mesurer la concentration et la viabilité des cellules à l’aide du bleu trypan et d’un compteur cellulaire.
    REMARQUE: La viabilité cellulaire devrait être > 90% pour les meilleurs résultats.
  6. Diluer les cellules à une concentration de 125 cellules/μL. Par exemple, pour un essai de 5 μL, il s’agit de ~625 cellules/μL. Pour une viabilité optimale, gardez les cellules en suspension pour une durée d’au plus 2 h.

7. Incubation de cellules avec inhibiteurs du SHP2

  1. Distribuez les cellules dans un creux stérile de solution à canal unique.
  2. Centrifugeuse 384-bien plaque PCR en temps réel qui a été pré-préparé par le dépôt inhibiteur SHP2 à 2500 x g pendant 5 min à 23 °C.
  3. Retirer le joint de la plaque composée. À l’aide d’une pipette multicanal de 125 μL, ajouter 5 μL des cellules diluées aux puits désirés.
  4. Centrifuger la plaque à 42 x g pendant 30 s sans couvercle sur la plaque. Fixez un joint de couvercle à la plaque après que la plaque est filée vers le bas et incuber la plaque d’essai à 37 °C, 5% de CO2 pendant 1 h.

8. Préparation du mélange maître de reagent chemiluminescent

  1. Retirez la quantité nécessaire de réagenants de détection (réageni EA, tampon de lyse et substrat) de -20 °C de stockage après le placage des cellules. Décongeler les reagents à 23 °C.
    REMARQUE : Pour plus de commodité dans le transfert, préparez un volume qui est 1,5 fois le volume total de cellules qui ont été déposées à la plaque. Ne réutilisez pas les réaménageurs après utilisation.
  2. Préparer un mélange maître des reagents à l’aide de l’état EA-10, qui se compose de composant et fraction de volume comme suit: réageni EA (0,17), tampon de lyse (0,17), substrat (0,67).
    REMARQUE : Les ratios de reagent sont basés sur des expériences d’optimisation effectuées comme spécifié dans le manuel du fournisseur.

9. Impulsion de chaleur de gradient de profil isothermal ou thermique

  1. Programmez le thermocycleur capable de gradient pour la livraison de l’impulsion thermique.
    1. Pour les expériences de gradient de profil thermique, préprogrammer le thermocycleur avec les spécifications d’exemple suivantes :
    2. Impulsion thermique : température de fusion souhaitée de 3 min (gradient vertical ou horizontal +/- 15 °C; exemple 38-68 °C répartis sur 24 puits donne des incréments de température de 1,25 °C).
  2. Étape de récupération de l’équilibrage : 3 min 20 °C avec vitesse de rampe = 1 °C/s
    1. Pour les expériences isothermales mis en place le protocole mis en place comme suit:
    2. Impulsion thermique : 3 min 55 °C. Étape de récupération de l’équilibrage : 3 min 20 °C avec vitesse de rampe = 1 °C/s
      REMARQUE: Pour une reproductibilité accrue, car il peut être difficile de placer la plaque précisément au moment où le thermocycleur atteint la température désirée, configurer le programme pour compter jusqu’à 15 s avant de commencer l’impulsion de 3 min. Pour le thermocycleur utilisé dans cette expérience voir Table of Materials, le couvercle est maintenu pendant l’impulsion thermique.

10. Détection et mesure de la lyse

  1. Compléter les plaques d’analyse avec le mélange maître de détection de lyse par l’ajout de volumes égaux (5 μL) à chaque puits à analyser à l’aide d’une pipette multicanal.
  2. Centrifugeuse de la plaque 42 x g pendant 30 s. Conserver à 23 °C dans l’obscurité pendant 30-60 min.
  3. Mesurer la chimioluminescence à l’aide d’un lecteur de microplaque capable de détecter la luminescence en format 384 puits. Effectuer la mesure de la luminescence avec le type de plaque et le temps d’intégration optimisé (temps d’intégration 1000 ms, temps de régler 0 s). Mesurez les valeurs en tant que nombres/s et extrayant pour une analyse plus approfondie.

11. Analyse des données

  1. Analyser les données de luminescence à l’aide d’un logiciel scientifique de graphique et de statistiques 2D.
  2. Générer des profils thermiques en analysant les données normalisées de luminescence (normalisées au contrôle du véhicule) à l’aide d’une régression non lignenelle et d’un modèle sigmoïde Boltzmann.
    REMARQUE : Dans les expériences de profil thermique, le V50calculé, la température qui est le point à mi-chemin entre le bas et le haut de la courbe, définit la température de fusion de SHP2. Dans les expériences isothermales, EC50 définit la concentration de l’inhibiteur qui donne une réponse demi-maximale.

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Representative Results

L’expérience de gradient thermique pour SHP2-WT a donné lieu à un profil thermique cellulaire sigmoïdal avec une transition de fusion étroite qui est typique et cohérente pour une protéine pliée (Figure 4A). SHP2 se compose de trois domaines indépendants : deux domaines SH2 et le domaine catalytique (Figure 1). Dans la conformation fermée autoinhibited ces domaines s’associent eux-même ; la transition de fusion observée dans l’expérience de profil thermique reflétait vraisemblablement cet état dans la cellule. L’incubation de SHP2-WT avec l’inhibiteur allosterique SHP099 à 10 μM a stabilisé le profil thermique SHP2-WT à un degré significatif et mesurable (figure 4A). Ceci reflète le mode de liaison connu des inhibiteurs de type SHP099 qui agissent comme de la « collemoléculaire » 37 entre les domaines sh2 contraignants réglementaires et la sous-unité catalytique. Fait important, notre analyse de décalage thermique cellulaire a confirmé que SHP099 peut pénétrer dans la cellule et se lier à la SHP2-WT étiquetée. La stabilisation de SHP2 a également suivi avec la puissance des composés allosteric SHP099-like. À 10 μM, le RMC-4550 plus puissant (IC50 déclaré = 0,6 nM) a produit un plus grand degré de stabilisation que le SHP099 (IC50 déclaré = 70 nM) pour le SHP2-WT (figure 4B).

Nous observons un comportement différent dans le profil thermique de l’essai d’engagement cible avec le mutant oncogène SHP2-E76K (Figure 4C). Le profil thermique de SHP2-E76K a une transition de fusion moins étroite, reflétant la déstabilisation de la structure tertiaire de SHP2 par la mutation E76K, connue pour perturber les interactions entre les domaines SH2 et la sous-unité catalytique. Par conséquent, la température de fusion observée a été réduite par rapport à la protéine WT. Fait important, lorsqu’il est incubé avec l’inhibiteur allosterique SHP099 à 10 μM, seule la stabilisation thermique marginale a été observée, compatible avec les propriétés connues de SHP099 et inhibiteurs similaires28,29,30.

Le niveau d’expression de la protéine marquée ePL à sonder peut influencer considérablement l’intensité du signal. La figure4D montreles profils thermiques des cellules SHP2-WT transitoires et stablement intégrées dans des conditions d’analyse identiques. La normalisation de ces courbes disparates offre des profils thermiques comparables(figure 4E),ce qui indique la large gamme du système de détection EFC. Il est important de noter que nous avons employé la pasfection transitoire et l’intégration stable SHP2 exprimant des cellules avec des résultats comparables. Pour la génération de lignées cellulaires stables, il convient de noter que les cellules HEK293 plutôt que les cellules HEK293T devraient être utilisées, car les cellules HEK293T ont déjà un marqueur de résistance à la néomycine qui empêcherait la sélection de cellules avec plasmide pICP-ePL-N-SHP2 intégré, qui contient un gène de résistance à la néomycine/kanamycine pour la sélection dans les cellules mammifères.

Pour obtenir des mesures inhibiteurs dose-réponse, on peut effectuer des titrations composées sur les cellules dans des conditions isothermales. Pour ce faire, nous vous suggérons d’abord de déterminer la température optimale pour ces mesures. Profitant de la capacité du thermocycleur à produire des gradients thermiques sur l’axe « court » d’une plaque de 384 puits, une série de titrations isothermales peuvent être effectuées sur une seule plaque. La figure 5A montre les résultats représentatifs de cette optimisation pour le SHP2-WT à l’aide d’une dose-réponse limitée de cinq points du RMC-4550. Des températures trop basses pour dénoturer la protéine ont produit un signal élevé qui était indépendant du médicament. De même, des températures trop élevées n’ont guère permis au composé de stabiliser la protéine. Toutefois, à une température optimale, telle que déterminée par cette expérience, une titration isothermale à l’aide d’une dose-réponse complète de 10 points a donné un EC50 utile pour RMC-4550 (Figure 5B). En plus des données représentatives montrées ici, nous avons déterminé que des expériences utilisant des conditions isothermales optimisées peuvent être employées pour examiner efficacement de nouveaux inhibiteurs de SHP2 pour leur capacité à traverser des membranes cellulaires et à engager leur cible dans les cellules36.

Figure 1
Figure 1 : Réglementation de l’activité SHP2.
(A) L’activité SHP2 est étroitement régulée dans les cellules normales. Dans des conditions basales, son domaine SH2 n-terminal occluse le site actif dans le domaine de la phosphatase (PTP), ce qui entraîne l’autoinhibition. Le facteur de croissance rtk et la stimulation de cytokine mènent à la phosphorylation de tyrosine des protéines d’adaptateur, qui se lient alors aux domaines de SH2, causant un changement conformationnel par lequel le site actif de SHP2 devient accessible à ses substrats. (B) Les mutations Somatic SHP2, fréquemment trouvées dans les leucémies, sont situées à l’interface entre les domaines N-SH2 et phosphatase et empêchent SHP2 d’adopter la conformation fermée et autoinhibée, ce qui entraîne une phosphatase constitutivement active. (C) Dans les tumeurs solides, l’amplification ou la surexpression des facteurs de croissance, rtks, ou adaptateurs d’échafaudage ont comme conséquence l’activation aberrante de SHP2. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Principes de déplacement thermique cellulaire SHP2.
Notre essai cellulaire d’engagement de cible est basé sur un essai β-galactosidase (β-gal) de fragment d’enzyme (EFC). Les cellules (HEK293T), exprimant sHP2 pleine longueur avec une étiquette de fusion ePL (42 fragments d’acides aminés de β-gal), sont traitées avec un composé de sonde et sont soumises à une impulsion thermique courte qui provoque SHP2 à la dénature et la forme d’agrégats insolubles inaccessibles, rendant l’étiquette ePL inaccessible. Une liaison spécifique du composé de la sonde à SHP2 peut améliorer sa stabilité thermique. La stabilisation thermique fournit une protéine cible plus soluble avec l’étiquette ePL pour la complémentarité dans le système de chemiluminescence enzymatique reporter. Les agrégats entraînent une réduction de la complémentarité et de la luminescence. Ce chiffre a été modifié à partir del’arbitre 36. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Flux de travail miniaturisé de l’équipement SHP2.
Le rendement de routine de l’essai fait usage de l’équipement indiqué. Les plaques d’analyse sont préparées à l’aide d’un gestionnaire de liquide acoustique qui fournit des volumes de composés nanolitres. Le transfert cellulaire peut être effectué manuellement, à l’aide d’une pipette multicanal, ou à l’aide d’un distributeur automatique de liquide. La dénaturation des impulsions thermiques utilise un thermocycleur qui peut fournir des gradients thermiques à une plaque de 384 puits. Un lecteur de microplaque est utilisé pour détecter la β-gal EFC assay chemiluminescence. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Engagement cible cellulaire des inhibiteurs allosteriques du SHP2 avec des protéines SHP2-WT et SHP2-E76K.
(A) La protéine SHP2-WT en présence du véhicule (DMSO, rouge) a produit un profil thermique cellulaire bien élevé avec une transition de fusion étroite compatible avec une protéine pliée dans l’état autoinhibited. L’incubation de cellules exprimant le SHP2-WT avec 10 μM SHP099 a stabilisé la protéine à l’état lié (bleu). (B) Profils thermiques d’engagement cible cellulaire de SHP2-WT en l’absence (rouge) ou présence de l’inhibiteur allosterique de la SHP099 RMC-4550 (10 μM, bleu). RMC-4550 a produit une stabilisation cellulaire accrue de SHP2-WT que celle observée pour SHP099. Cette augmentation de l’engagement cible s’en suit avec sa plus grande puissance biochimique. (C) Le mutant SHP2-E76K avait une courbe de fusion moins prononcée compatible avec un état qui est en grande partie sous la forme active « ouverte » (rouge). SHP099 à 10 μM seulement légèrement augmenté la température de fusion SHP2-E76K (bleu), qui est en accord avec l’inhibition biochimique et les données d’efficacité cellulaire. (D) Le signal de chemiluminescence observé correspond au niveau d’expression d’ePL-SHP2. Comparées aux cellules HEK293T transitoirement transfectées, les cellules HEK293 dans lesquelles l’ePL marqué SHP2-WT a été habilement intégré dans le génome, ont eu un niveau réduit d’expression ePL-SHP2. Par conséquent, les profils thermiques bruts non normalisés de chemiluminesence ont montré un signal de luminescence considérablement réduit pour les cellules HEK293 (bleues) exprimant de façon stable par rapport aux cellules HEK293 transitoirement passagèrement (rouge). E) La normalisation des données brutes de chemiluminescence pour stable (HEK293) et transitoirement transfected (HEK293T) a produit des profils thermiques comparables, montrant la sensibilité des mesures. Les points de données et les barres d’erreur (±DS) représentent des mesures en double. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Essai isothermal de réponse de dose isothermal d’engagement de cible cellulaire pour SHP2-WT.
(A) Afin d’établir des conditions isothermales optimales pour évaluer l’engagement cible dépendant de la dose des inhibiteurs du SHP2, un gradient thermique sur l’axe court d’une plaque de 384 puits est d’abord effectué. Cela permet une évaluation efficace des réponses à la dose en cinq points des inhibiteurs (RMC-4550; 0,08-10 μM) afin d’identifier la température optimale. (B) Une dose-réponse isothermale cellulaire complète (10 points) pour RMC-4550 à une température optimale de 56°C. L’EC50 à cette température est indiqué. Les points de données et les barres d’erreur (± SD) représentent des mesures quadruplicate. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Nous avons présenté un test d’engagement cible qui peut confirmer la liaison directe de petites molécules à la phosphatase SHP2 dans les cellules. L’analyse peut faire la distinction entre les inhibiteurs de faible et de haute affinité et, surtout, confirmer un manque de puissance par les inhibiteurs allosteriques du type SHP099 pour le mutant oncogène SHP2-E76K gof. Une force de cet essai miniaturisé est sa capacité à être intégrée dans une campagne de dépistage des inhibiteurs du SHP2. La capacité de l’essai de confirmer la liaison intracellulaire au SHP2 par des matières chimiques inconnues est une capacité importante pour s’assurer que les ressources de dépistage peuvent être déployées efficacement. Dans l’ensemble, le protocole miniaturisé est robuste et fiable.

Un aspect critique de l’analyse est le moment; les meilleurs résultats sont obtenus 24 h après transfection des cellules HEK293T. Les protéines SHP2-WT et SHP2-E76K ne semblent pas toxiques; toutefois, une expression élevée à long terme pourrait réduire la sensibilité de l’expérience et nécessiterait une ré-optimisation. Une manipulation attentive des cellules pour les détacher et les préparer à l’essai est une considération critique supplémentaire. Cependant, les méthodes standard de culture cellulaire sont suffisantes pour produire des données de haute qualité. Nous avons intégré un certain nombre d’étapes de centrifugation dans le flux de travail en raison des petits volumes utilisés dans cet essai. Ces étapes ont pour but d’assurer le mélange quantitatif, de sorte que l’adhésion à l’accélération et le temps de centrifugation est recommandé. Fait à noter, les réessayants peuvent souffrir après une mauvaise manipulation. Par conséquent, nous recommandons qu’ils soient aliquoted et stockés congelés jusqu’à utilisation.

Le problème le plus fréquemment rencontré dans les performances de cet essai est un signal erratique (bruyant) ou à faible luminosité. Pour déterminer la source de ce problème, il est courant d’effectuer une analyse des taches occidentales sur les cellules HEK293T transfectées à l’aide d’anticorps anti-ePL pour assurer un niveau d’expression fiable de SHP2-WT et SHP2-E76K. Nous avons obtenu les meilleurs résultats en utilisant le protocole de reagent décrit à l’étape 4. Une fois que les conditions de transfection sont établies, et un seul stock de plasmide d’expression SHP2 est obtenu, nous avons trouvé l’essai pour être très fiable.

Le développement de l’essai nécessite l’optimisation de la fenêtre de signal chemiluminescent pour assurer des résultats fiables sont obtenus. Pour optimiser la fenêtre d’analyse, le paramètre le plus significatif est la formulation du mélange maître du réaccente de détection tel que décrit dans le manuel du fournisseur. Cette optimisation est effectuée en modifiant systématiquement le rapport reagent ea/substrat dans le mélange principal, tandis que le composant tampon de lyse est maintenu constant (quatre conditions différentes sont généralement suffisantes pour cette mesure). Une condition avec zéro reagent EA sert d’arrière-plan. L’analyse est effectuée comme décrit ci-dessus, et le rapport entre le signal observé et l’arrière-plan (S/B) est calculé. Des résultats fiables sont obtenus lorsque le ratio S/B est >50. Les conditions de mélange maître qui entraînent un signal extraordinairement élevé doivent être évitées, car elles entraîneront l’épuisement du substrat de chimioluminescence.

Une limitation potentielle de l’analyse est sa sensibilité. Dans notre expérience, des inhibiteurs avec au moins une faible puissance micromolaire dans les analyses d’inhibition de phosphatase de SHP2 sont exigés pour produire des effets mesurables dans l’essai cellulaire de décalage thermique. Comme ligne directrice générale, nous suggérons d’évaluer d’abord les composés candidats dans les tests pts in vitro en utilisant recombinant SHP236. Basé sur les résultats de notre programme continu de découverte d’inhibiteurs du SHP2, une capacité composée à déplacer la température de fusion SHP2 in vitro suit bien avec sa capacité à stabiliser (ou parfois déstabiliser) la protéine SHP2 dans les cellules. Fait intéressant, la stabilisation relative du SHP2-WT par les inhibiteurs allosteriques de la SHP099 semble être supérieure à celle causée par des inhibiteurs actifs du site SHP2 tout aussi puissants, reflétant probablement la capacité des inhibiteurs allosteriques à stabiliser efficacement une conformation physiologiquement pertinente de la protéine SHP2-WT.

En plus de la phosphatase SHP2, nous avons acquis de l’expérience dans le développement d’analyses d’engagement cellulaire cible pour d’autres phosphatases et kinases. Une considération principale avec une cible différente de protéine est d’utiliser une combinaison d’expériences positives et négatives de contrôle pour établir la validité de l’essai, avant d’engager entièrement des ressources à l’interprétation des données de liaison ligand. De plus, d’autres technologies sont disponibles pour évaluer l’engagement des cibles cellulaires. Nous avons exploré un certain nombre d’alternatives pour la phosphatase SHP2, mais nous avons trouvé cet essai très utile dans nos efforts. Enfin, cet essai est indépendant de l’activité enzymatique SHP2 et permet donc l’évaluation et l’optimisation de petites molécules sans tenir compte de leur mode de liaison.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts avec le contenu de cet article.

Acknowledgments

Ces travaux ont été soutenus par national Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (à L. T.), Epstein Family Foundation Award (à N. D. P.C.), et NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199. En outre, ce projet a été financé en tout ou en partie avec des fonds fédéraux de l’Institut national du cancer, National Institutes of Health, dans le cadre du contrat no du Consortium de biologie chimique. HHSN261200800001E. Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les points de vue ou les politiques du ministère de la Santé et des Services sociaux, et la mention de noms commerciaux, de produits commerciaux ou d’organisations n’implique pas nécessairement l’approbation du gouvernement des États-Unis. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des Instituts nationaux de la santé.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well gradient equipped thermocycler Eppendorf AG X50h
384-well low dead volume microplate Echo qualified Beckman Coulter, Inc. LP-0200
6-well cell culture plates Greiner Bio-One 657 160 Sterile with lid
Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X Thermo Fisher Scientific 15240-062
Cell counter Thermo Fisher Scientific Countess II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 10566-016 500 mL
Echo acoustic liquid handler Beckman Coulter, Inc. Echo 550
Electronic multichannel pipette Thermo Fisher Scientific E1 ClipTip
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 26140-079 500 mL
HEPES buffer Thermo Fisher Scientific 15630-680 100 mL
InCell Pulse starter kit Eurofins DiscoverX Corp. 94-4007 Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate
Microplate reader Tecan Trading AG Spark
Single channel solution trough Thermo Fisher Scientific S253012005
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-010 100 mM
Thermal microplate sealer Agilent Technologies, Inc. PlateLoc
Transfection reagents Polyplus Transfection jetPRIME
Trypan blue Thermo Fisher Scientific T10282
TrypLE Express reagent Thermo Fisher Scientific 12605-010
Twin.tec 384 real-time PCR plates Eppendorf AG 30132734

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References

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Évaluation de l’engagement des cibles cellulaires par inhibiteurs de la phosphatase SHP2 (PTPN11)
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