Summary
De mogelijkheid om doelbetrokkenheid door kandidaat-remmers in intacte cellen te beoordelen is cruciaal voor de ontdekking van geneesmiddelen. Dit protocol beschrijft een 384 goed formaat cellulaire thermische verschuiving test die betrouwbaar detecteert cellulaire doel betrokkenheid van remmers gericht op ofwel wild-type SHP2 of de oncogene varianten.
Abstract
De Src-homologie 2 (SH2) domein-bevattende fosfatase 2 (SHP2), gecodeerd door de PTPN11 proto-oncogeen, is een belangrijke bemiddelaar van receptor tyrosine kinase (RTK)-gedreven cel signalering, het bevorderen van celoverleving en proliferatie. Daarnaast wordt SHP2 aangeworven door immuuncontrolepuntreceptoren om de activering van B- en T-cellen te remmen. Afwijkende SHP2 functie is betrokken bij de ontwikkeling, progressie, en metastase van vele vormen van kanker. Inderdaad, kleine molecuul SHP2 remmers zijn onlangs opgenomen klinische proeven voor de behandeling van vaste tumoren met Ras / Raf / ERK route activering, met inbegrip van tumoren met een aantal oncogene Ras mutaties. Echter, de huidige klasse van SHP2 remmers is niet effectief tegen de SHP2 oncogene varianten die vaak voorkomen in leukemie, en de ontwikkeling van specifieke kleine moleculen die zich richten op oncogene SHP2 is het onderwerp van het huidige onderzoek. Een veel voorkomend probleem met de meeste drug discovery campagnes waarbij cytosolische eiwitten zoals SHP2 is dat de primaire tests die chemische ontdekking rijden zijn vaak in vitro testen die niet de cellulaire doel betrokkenheid van kandidaat-verbindingen verslag. Om een platform te bieden voor het meten van cellulaire doelbetrokkenheid, ontwikkelden we zowel wild-type als mutant SHP2 cellulaire thermische verschuivingstesten. Deze tests detecteren betrouwbaar doel betrokkenheid van SHP2 remmers in cellen. Hier bieden we een uitgebreid protocol van deze test, die een waardevol instrument biedt voor de beoordeling en karakterisering van SHP2-remmers.
Introduction
Tyrosine fosforylatie speelt een belangrijke rol bij signaaltransductie in cellen1,2. Deze post-translationele modificatie wordt gekatalyseerd door eiwit tyrosine kinases (PTK's) en omgekeerd door eiwit tyrosine fosfatases (PTPs). Daarom leidt de afwijkende PTK- of PTP-functie tot veel erfelijke of verworven menselijke ziekten3,4,5,6. De Src-homologie 2 (SH2) domein-bevattende fosfatase 2 (SHP2) is een breed uitgedrukte niet-receptor type PTP gecodeerd door de proto-oncogene PTPN117 en is een belangrijke regulator van tal van fysiologische processen die signaal transductie te betrekken door activering van de Ras / Raf / ERK, PI3K / Akt, of JAK / STAT signalering trajecten8. Normaal gesproken is SHP2-activiteit strak geregeld om afwijkende signalering te voorkomen. Onder basale omstandigheden wordt SHP2 autoinhibited door zijn N-terminal SH2-domein, dat de toegang tot de actieve site binnen het katalytische fosfatasedomein blokkeert (figuur 1A)9,10. Bij celactivering rekruteren tyrosine fosforylated bindende eiwitten SHP2, waardoor het zijn actieve conformatie overneemt, waarbij de actieve site nu toegankelijk is voor zijn substraten. Bij veel vormen van kanker is de SHP2-activiteit verhoogd. Somatische gain-of-function (GOF) mutaties in PTPN11 zijn vooral geïdentificeerd in leukemie en voorkomen dat het N-SH2-domein wordt verbonden aan het fosfatasedomein, wat resulteert in constitutief actieve SHP2 (figuur 1B)11. Germline GOF mutaties in PTPN11 zijn verantwoordelijk voor ~50% van de gevallen van het Noonan syndroom, een ontwikkelingsstoornis met een verhoogd risico op maligniteit12. Bij vaste tumoren, waar PTPN11 mutaties zeldzaam zijn, leiden grotere niveaus van fosforgeyleerde bindende eiwitten tot verbeterde SHP2-activiteit(figuur 1C). SHP2 is ook belangrijk voor immuun checkpoint signalering, als checkpoint receptoren zoals BTLA of PD-1 werven SHP2 om key signaling moleculen dephosphorylaat dephosphorylaat dephosphorylaat, het voorkomen van immuuncel activering13,14,15.
Het aanpakken van PTPs met kleine moleculen is een uitdaging geweest, omdat de actieve site van PTP's zeer behouden en zeer geladen is; remmers die zich richten op de actieve site zijn vaak krachtig, maar vertonen een slechte selectiviteit en orale biologische beschikbaarheid16,17,18,19,20,21,22. Inderdaad, veel gemelde SHP2-remmers lijden aan slechte selectiviteit en gebrek aan werkzaamheid in cellen23. Onlangs zijn allosterische remmers van SHP2 met een goede potentie en uitstekende selectiviteit gemeld (bijvoorbeeld SHP09924 en RMC-455025) en hebben hernieuwde interesse gewekt in SHP2-remmers. Verbindingen op basis van SHP099 en RMC-4550 zijn momenteel in fase I klinische proeven voor de behandeling van vaste tumoren met receptor tyrosine kinase (RTK) route activering26,27. Hoewel baanbrekend, deze verbindingen zijn niet effectief tegen veel van de SHP2 oncogene mutanten die leukemogenese rijden bij een aanzienlijk aantal bloedkanker patiënten28,29,30. Dit gebrek aan potentie van SHP099-achtige verbindingen in de richting van de SHP2 oncogene varianten komt voort uit hun unieke allosterische mechanisme, omdat ze de SHP2-activiteit remmen door de inactieve, gesloten conformatie te binden en te stabiliseren, die wordt verstoord in SHP2-mutanten. Verder, op basis van een recent rapport31, adaptieve weerstand mechanismen bij patiënten behandeld met SHP099-achtige remmers zijn heel denkbaar. Bijgevolg is de ontwikkeling van de volgende generatie SHP2-remmers die zich richten op zijn actieve, open staat een onderwerp van intensief onderzoek.
De karakterisering van nieuwe SHP2-remmers in cellen is een essentieel aspect van het leadoptimalisatieproces. Kritisch, bewezen doel betrokkenheid van de remmer onder fysiologische omstandigheden biedt een extra niveau van vertrouwen dat middelen voor medicinale chemie efficiënt worden ingezet op verbindingen met veelbelovende cellulaire werkzaamheid. In het verleden zijn verschillende methoden ontwikkeld om de binding van kleine molecuulremmers aan hun doelen te beoordelen, voornamelijk voor eiwitkinases32. Voor de ontwikkeling van een SHP2 cellulaire doel engagement test, gebruikten we een cellulaire thermische verschuiving test33. Deze test, vergelijkbaar met de in vitro thermal shift (PTS) test voor eiwitten34,bewaakt het doel eiwit thermische stabiliteit, die meestal wordt veranderd door de binding van kleine moleculen. De oorspronkelijke test is een lage doorvoertest die antilichamen gebruikt om doeleiwitniveaus te kwantificeren. Als alternatief hebben we gekozen voor een onlangs gerapporteerde variant van de thermische verschuivingstest die gebruik maakt van een β-galactosidase enzymfragmentcomplementatie (EFC) test(figuur 2)35. Voor deze experimenten wordt het eiwit van belang uitgedrukt in cellen als een N- of C-terminale fusie-eiwit met een verbeterde ProLabel-tag (ePL, een 42 aminozuurfragment van β-galactosidase). Cellen worden vervolgens overgebracht naar 384-well PCR compatibele platen en geïncubeerd met verbindingen van belang. Een thermocycler wordt gebruikt om een temperatuurgradiënt toe te passen op de cellen, waarvan de eiwitten zullen denatureren en aggregaat als de temperatuur stijgt op basis van hun thermische stabiliteit. Het vermogen van een kandidaat-verbinding om het eiwit van belang te binden en te stabiliseren zal resulteren in een verhoogde thermische stabiliteit van dat eiwit. Daarom, na de lysis van de cellen, zullen de gelabelde eiwitten die zijn gestabiliseerd door een kandidaat-verbinding in oplossing blijven bij hogere temperaturen dan gelabelde eiwitten van cellen die zijn geïncubeerd met voertuigcontrole. Reporter enzym acceptor (EA) is in staat om de oplosbare ePL-gelabelde eiwitten aan te vullen, wat resulteert in detecteerbare β-galactosidase activiteit met behulp van een luminescentie substraat.
We hebben onlangs een robuuste cellulaire thermische shift test ontwikkeld voor wild-type SHP2 (SHP2-WT) en een frequente SHP2 oncogenic variant (SHP2-E76K) in een geminiaturiseerde 384-well formaat36. Hier rapporteren we een gedetailleerd protocol van deze test, die op betrouwbare wijze detecteert doel betrokkenheid door SHP2-remmers in cellen en toont een hoge mate van correlatie tussen remmer potentie en cellulaire thermische verschuiving gegevens. De algemene testworkflow wordt geïllustreerd in figuur 3. Ons platform maakt gebruik van N-terminaal gelabelde full-length ePL-SHP2 fusion eiwitten. Voor de generatie van de overeenkomstige pICP-ePL-N-SHP2-WT en pICP-ePL-N-SHP2-E76K expressie plasmids, verwijzen wij u naar onze recente publicatie36. Deze test kan worden uitgevoerd met behulp van een thermische gradiënt om SHP2 thermische profielen vast te stellen en SHP2 smelttemperaturen te bepalen in de aanwezigheid of afwezigheid van remmer. Zodra thermische profielen zijn vastgesteld, kan het ook worden uitgevoerd onder isothermale omstandigheden, waardoor remmer dosis-respons beoordeling. Beide soorten experimenten worden hieronder beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van celkweek en reagentia
- Formuleer een fles groeimedia van 500 mL met 10% foetaal runderserum, 1x antibioticum/antimicotisch, 20 mM HEPES en 1 mM natriumpyruvaat. Bewaar bij 4 °C.
- Dooi cellulaire thermische verschuiving reagentia (EA reagens, lysis buffer, en substraat) van bevroren originele voorraad flessen.
- Geef reagentia en buffer af als 2 mL aliquots en bewaar bij -20 °C.
OPMERKING: Vermijd bevriezing/dooi voor reproduceerbaarheid en gebruik alleen dat volume van het reagens dat nodig is voor de testprocedure.
2. Groei en onderhoud van HEK293T cellen
- Verkrijg laagpassageaanhanger HEK293T cellen uit cryo-opslag.
- Houd HEK293T cellen in groeimedia op 37 °C, 5% CO2.
- Splits cellen elke 4 dagen in een verhouding van 1:14.
OPMERKING: Voor de beste prestaties mogen HEK293T-cellen niet groter dan 25 keer doorsnee.
3. HEK293T-celvoorbereiding voor tijdelijke transfectie
- Maak HEK293T-cellen los van 16 mL-platen met behulp van 3 mL van het cellossagereagens.
- Verdun met 12 mL groeimedia. Verzamel cellen door centrifugatie op 1.400 x g gedurende 4 minuten.
- Resuspend de pellet in 10 mL groeimedia. Meet de concentratie en levensvatbaarheid van cellen met behulp van trypan blauw en een cel teller.
- Plaat 7.0 x 105 exponentieel groeiende HEK293T cellen per put in een 6 goed celkweekplaat ongeveer 24 uur vóór transfectie.
LET OP: Reserveer een goed voor elke plasmid te worden doorgetransfecteerd. - Incubeer voor 24 uur bij 37 °C, 5% CO2.
4. Transfectie van HEK293T-cellen
- Uit een gezuiverde plasmid voorraad pICP-ePL-N-SHP2-WT of pICP-ePL-N-SHP2-E76K (~200 ng/μL) verdun 2 μg plasmide DNA tot 200 μL transfectiebuffer.
- Vortex voor 10 s en centrifuge bij 1.400 x g gedurende 4 minuten.
- Voeg 4 μL transfectiereagens toe aan het verdunde DNA. Vortex voor 10 s en centrifuge bij 1.400 x g gedurende 4 minuten.
- Incubeer bij 23 °C gedurende 10 minuten.
- Verwijder de 6 putplaat met groeiende HEK293T cellen uit de couveuse. Voeg het transfectiemengsel toe aan de bijgevoegde cellen in de 6-putplaat. Incubeer voor 24 uur bij 37 °C, 5% CO2.
5. Bereiding van de testplaten
- Bereid 10 mM voorraadoplossingen voor in DMSO van te testen verbindingen.
- Doseeroplossingen in een 384-put lage dode volumebronplaat voor onmiddellijk gebruik.
- Spot het gewenste volume van remmers of voertuig (DMSO) met behulp van een vloeistofafhandelaar in 384-goed real-time PCR-platen op een doel eindvolume van minder dan 0,5% DMSO (v/v). Verzegel de plaat met een plaatafdichter met inert gaszuivering.
OPMERKING: Voor inhibitor dosis-respons testen, zorg ervoor dat DMSO dienovereenkomstig te vullen, zodat gelijke hoeveelheden DMSO worden gebruikt voor elke remmer concentratie. Bewaar voor het beste resultaat platen op 23 °C en gebruik platen binnen 24 uur.
6. Transfected cell detachement and preparation
- Preincubate groeimedia en cellossvul reagens in een waterbad van 37 °C. Verwijder transfected cellen uit de couveuse. Voorzichtig aanzuigen media uit de putten van de plaat.
LET OP: Gebruik een nieuwe aspirator voor elke put die een andere transfected plasmide bevat. - Voeg 0,3 mL van het reagens van de celloslating toe. Wieg de plaat voorzichtig heen en weer om het oppervlak van de plaatbodem grondig af te dekken. Incubeer bij 23 °C gedurende 2 min.
- Voeg 1 mL groeimedia toe aan elke put. Voorzichtig pipette media en cellen in de put en breng over naar een 15 mL Falcon centrifuge buis. Verzamel cellen door centrifugatie op 1.400 x g gedurende 4 minuten.
- Voorzichtig maar grondig aspirate uit de media.
OPMERKING: Restfolrood in het reagens van het cellossement kan de test verstoren. - Zorgvuldig resuspend celpellet in 2 mL van groeimedia. Meet de concentratie en levensvatbaarheid van cellen met behulp van trypan blauw en een cel teller.
OPMERKING: De levensvatbaarheid van de cel moet > 90% zijn voor de beste resultaten. - Verdun cellen tot een concentratie van 125 cellen/μL. Voor een 5 μL-test is dit bijvoorbeeld ~625 cellen/μL. Voor een optimale levensvatbaarheid houden cellen in suspensie voor niet meer dan 2 uur.
7. Incubatie van cellen met SHP2-remmers
- Breng cellen in een steriele eenkanaalsoplossing.
- Centrifuge 384-well real-time PCR plaat die is vooraf voorbereid door SHP2 remmer depositie op 2.500 x g gedurende 5 min bij 23 °C.
- Verwijder de afdichting van de samengestelde plaat. Voeg met behulp van een 125 μL multichannel pipet 5 μL van de verdunde cellen toe aan de gewenste putten.
- Centrifugeren de plaat op 42 x g voor 30 s zonder deksel op de plaat. Bevestig een dekselafdichting aan de plaat nadat de plaat is gedraaid en broed de testplaat uit op 37 °C, 5% CO2 gedurende 1 uur.
8. Bereiding van chemiluminescent reagenscent reagens master mix
- Verwijder de benodigde hoeveelheid detectiereagentia (EA-reagens, lysisbuffer en substraat) uit -20 °C-opslag na beplating van cellen. Dooireagentia bij 23 °C.
OPMERKING: Voor het gemak bij de overdracht, bereid een volume dat is 1,5x het totale volume van de cellen die zijn afgezet op de plaat. Gebruik reagentia niet opnieuw na gebruik. - Bereid een mastermix van de reagentia voor met behulp van voorwaarde EA-10, die als volgt bestaat uit component- en volumefractie: EA-reagens (0,17), lysisbuffer (0,17), substraat (0,67).
OPMERKING: Reagensratio's zijn gebaseerd op optimalisatie-experimenten die zijn uitgevoerd zoals gespecificeerd in de handleiding van de leverancier.
9. Isothermale of thermische profiel gradiënt warmtepuls
- Programmeer de gradiënt geschikt thermocycler voor de levering van warmtepuls.
- Voor experimenten met thermische profielgradiënt, de thermocycler voorprogrammeren met de volgende voorbeeldspecificaties:
- Hittepuls: 3 min gewenste smelttemperatuur (verticale of horizontale gradiënt +/- 15 °C; bijvoorbeeld 38-68 °C verspreid over 24 putten levert temperatuurschommelingen van 1,25 °C op).
- Equilibration recovery step: 3 min 20 °C met hellingssnelheid = 1 °C/s
- Voor isothermale experimenten is het protocol ingesteld als volgt:
- Hittepuls: 3 min 55 °C. Equilibration recovery step: 3 min 20 °C met hellingssnelheid = 1°C/s
OPMERKING: Voor verhoogde reproduceerbaarheid, omdat het moeilijk kan zijn om de plaat precies te plaatsen op het moment dat de thermocycler de gewenste temperatuur bereikt, stel het programma in om 15 s af te tellen voordat de 3 min puls begint. Voor de thermocycler die in dit experiment wordt gebruikt zie Tabel van Materialen, wordt het deksel omhoog gehouden tijdens de hittepuls.
10. Lysisdetectie en -meting
- Supplement testplaten met lysis detectie master mix door toevoeging van gelijke volumes (5 μL) aan elke put te analyseren met behulp van een multichannel pipet.
- Centrifuge de plaat 42 x g voor 30 s. Bewaar op 23 °C in het donker gedurende 30-60 min.
- Meet chemiluminescentie met behulp van een microplatelezer die luminescentie in 384-put formaat kan detecteren. Voer luminescentiemeting uit met het plaattype en de integratietijd geoptimaliseerd (integratietijd 1000 ms, afrekentijd 0 s). Meet waarden als tellingen/s en output voor verdere analyse.
11. Gegevensanalyse
- Analyseer de luminescentiegegevens met behulp van een wetenschappelijke 2D-grafiek- en statistiekensoftware.
- Genereer thermische profielen door het analyseren van de genormaliseerde luminescentie gegevens (genormaliseerd naar de controle van het voertuig) met behulp van niet-lineaire regressie en een Boltzmann sigmoidal model.
OPMERKING: In thermische profiel experimenten, de berekende V50, de temperatuur die het halverwege punt tussen de bodem en de bovenkant van de curve, definieert de smelttemperatuur van SHP2. In isothermale experimenten definieert EC50 de concentratie van de remmer die half-maximale respons geeft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het thermische gradiëntexperiment voor SHP2-WT resulteerde in een sigmoïdaal cellulair thermisch thermisch profiel met een smalle smeltovergang die typisch en consistent is voor een gevouwen eiwit(figuur 4A). SHP2 bestaat uit drie onafhankelijke domeinen: twee SH2-domeinen en het katalytische domein (figuur 1). In de autoinhibited gesloten conformatie deze domeinen zelf-associate; de smeltovergang die werd waargenomen in het thermische profiel experiment weerspiegelde vermoedelijk deze toestand in de cel. Incubatie van SHP2-WT met de allosterische remmer SHP099 op 10 μM stabiliseerde het SHP2-WT thermisch profiel in significante en meetbare mate (figuur 4A). Dit weerspiegelt de bekende bindingsmodus van SHP099-achtige remmers die fungeren als "moleculaire lijm"37 tussen de regulerende bindende SH2-domeinen en de katalytische subunit. Belangrijk is dat onze cellulaire thermische verschuiving test bevestigd dat SHP099 kan de cel penetreren en binden aan het gelabelde SHP2-WT. De stabilisatie van SHP2 ook bijgehouden met de potentie van SHP099-achtige allosterische verbindingen. Bij 10 μM produceerde de krachtigere RMC-4550 (gerapporteerde IC50 = 0,6 nM) een grotere mate van stabilisatie dan SHP099 (gerapporteerde IC50 = 70 nM) voor SHP2-WT (figuur 4B).
We observeren een ander gedrag in het thermische profiel van de target engagement test met de oncogene mutant SHP2-E76K (Figuur 4C). Het thermische profiel voor SHP2-E76K heeft een smeltovergang die minder smal is, als gevolg van de destabilisatie die wordt doorgeschoven naar de tertiaire structuur van SHP2 door de E76K-mutatie, waarvan bekend is dat het de interacties tussen de SH2-domeinen en de katalytische subunit verstoort. Daarom werd de waargenomen smelttemperatuur verlaagd in vergelijking met het WT-eiwit. Belangrijk is dat bij het uitbroeden met de allosterische remmer SHP099 bij 10 μM slechts marginale thermische stabilisatie werd waargenomen, in overeenstemming met de bekende eigenschappen van SHP099 en soortgelijke remmers28,29,30.
Het expressieniveau van het ePL-gelabelde eiwit dat moet worden onderzocht, kan de signaalintensiteit drastisch beïnvloeden. Getoond (Figuur 4D) zijn thermische profielen voor voorbijgaande en stabiel geïntegreerde SHP2-WT cellen onder identieke testomstandigheden. Normalisatie van deze uiteenlopende krommen biedt vergelijkbare thermische profielen(figuur 4E), die het brede scala van het EFC-detectiesysteem aangeven. Het is belangrijk op te merken dat we zowel tijdelijke transfectie en stabiele integratie SHP2 uitdrukken cellen met vergelijkbare resultaten hebben gebruikt. Voor de generatie van stabiele cellijnen moet worden opgemerkt dat HEK293-cellen in plaats van HEK293T-cellen moeten worden gebruikt, aangezien HEK293T-cellen al een neomycineresistentiemarker hebben die de selectie van cellen met geïntegreerde pICP-ePL-N-SHP2 plas zou voorkomen, dat een neomycine/kanamycineresistentiegen bevat voor selectie in zoogdiercellen.
Om inhibitor dosis-responsmetingen te verkrijgen, kan men samengestelde titraties uitvoeren op cellen onder isothermale omstandigheden. Om dit te doen, raden we aan om eerst het temperatuuroptimum voor deze metingen te bepalen. Door gebruik te maken van het thermocyclervermogen om thermische gradiënten te produceren op de "korte" as van een 384-putplaat, kan een reeks isothermale titraties op één plaat worden uitgevoerd. Figuur 5A toont representatieve resultaten van deze optimalisatie voor SHP2-WT met behulp van een beperkte dosisrespons van vijf punten van RMC-4550. Temperaturen die te laag waren om het eiwit te denatureren, produceerden een hoog signaal dat onafhankelijk was van het medicijn. Ook temperaturen die te hoog waren, boden weinig capaciteit voor de verbinding om het eiwit te stabiliseren. Echter, bij een optimale temperatuur, zoals bepaald door dit experiment, een isothermale titratie met behulp van een volledige 10-punts dosis-respons leverde een nuttige EC50 voor RMC-4550 (Figuur 5B). Naast de representatieve gegevens die hier worden getoond, hebben we vastgesteld dat experimenten met geoptimaliseerde isothermale omstandigheden kunnen worden gebruikt om nieuwe SHP2-remmers efficiënt te screenen op hun vermogen om celmembranen over te steken en hun doel in cellen36te betrekken.
Figuur 1: Regulering van de SHP2-activiteit.
(A) SHP2 activiteit is strak geregeld in normale cellen. Onder basale omstandigheden, de N-terminal SH2 domein occludes de actieve site binnen de fosfatase (PTP) domein, wat resulteert in autoinhibition. RTK groeifactor en cytokine stimulatie leidt tot tyrosine fosforylatie van adapter eiwitten, die vervolgens binden aan de SH2 domeinen, waardoor een conformatieverandering waardoor de SHP2 actieve site toegankelijk wordt voor de substraten. (B) Somatische SHP2-mutaties, die vaak in leukemie worden aangetroffen, bevinden zich op de interface tussen de N-SH2- en fosfatasedomeinen en verhinderen dat SHP2 de gesloten, automatisch geïnde conformatie overneemt, wat resulteert in een constitutief actieve fosfatase. (C) Bij vaste tumoren, versterking of overexpressie van groeifactoren, RTK's of steigeradapters resulteren in afwijkende activering van SHP2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: SHP2 cellulaire thermische verschuiving principes.
Onze cellulaire target engagement test is gebaseerd op een β-galactosidase (β-gal) enzym fragment complementatie (EFC) test. Cellen (HEK293T), die SHP2 over de volledige lengte uitdrukken met een ePL-fusietag (42 aminozuurfragment van β-gal), worden behandeld met een sondeverbinding en worden onderworpen aan een korte warmtepuls die ervoor zorgt dat SHP2 ontaardt en onoplosbare onoplosbare aggregaten vormt, waardoor de ePL-tag ontoegankelijk wordt. Specifieke binding van de sonde verbinding aan SHP2 kan de thermische stabiliteit te verbeteren. Thermische stabilisatie biedt meer oplosbaar doeleiwit met de ePL-tag voor complementatie in het reporter enzym chemiluminescentiesysteem. Aggregaten resulteren in verminderde complementatie en luminescentie. Dit cijfer is gewijzigd van ref.36. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Miniaturized SHP2 apparatuur workflow.
Routinematige prestaties van de test maken gebruik van de aangegeven apparatuur. Testplaten worden bereid met behulp van een akoestische vloeistofhandler die nanolitervolumes van verbindingen levert. Celoverdracht kan handmatig worden uitgevoerd, met behulp van een meerkanaals pipet, of met behulp van een automatische vloeistofdispenser. Warmtepuls denaturatie maakt gebruik van een thermocycler die thermische hellingen kan leveren aan een 384-put plaat. Een microplate lezer wordt gebruikt om de β-gal EFC test chemiluminescentie te detecteren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Cellular target engagement of allosteric SHP2 inhibitors with SHP2-WT and SHP2-E76K proteins.
(A) Het SHP2-WT-eiwit in aanwezigheid van het voertuig (DMSO, red) produceerde een goed gedragen cellulair thermisch thermisch profiel met een smalle smeltovergang in overeenstemming met een gevouwen eiwit in de autoinhibiteerde toestand. Incubatie van SHP2-WT uitdrukkende cellen met 10 μM SHP099 stabiliseerde het eiwit in de gebonden toestand (blauw). (B) Cellular target engagement thermal profiles of SHP2-WT in the absence (red) or presence of the SHP099-like allosteric inhibitor RMC-4550 (10 μM, blauw). RMC-4550 produceerde een verhoogde cellulaire stabilisatie van SHP2-WT dan die waargenomen voor SHP099. Deze verhoogde doelgroep engagement tracks met zijn grotere biochemische potentie. (C) De SHP2-E76K mutant had een minder uitgesproken smeltcurve in overeenstemming met een toestand die grotendeels in de "open" actieve vorm (rood). SHP099 op 10 μM slechts marginaal verhoogde de SHP2-E76K smelttemperatuur (blauw), die in overeenstemming is met biochemische remming en cellulaire werkzaamheid gegevens. (D) Het waargenomen chemiluminescentiesignaal komt overeen met het expressieniveau van ePL-SHP2. In vergelijking met tijdelijk voorbijgaande HEK293T cellen hadden HEK293-cellen waarin de ePL met de label SHP2-WT stabiel in het genoom werd geïntegreerd, een verlaagd niveau van ePL-SHP2-expressie. Bijgevolg vertoonden de ruwe ongenormaliseerde thermische profielen van chemiluminesence een sterk verminderd luminescentiesignaal voor de stabiel uitdrukkende HEK293-cellen (blauw) in vergelijking met de van voorbijgaande dwarse HEK293-cellen (rood). E) Normalisatie van de ruwe chemiluminescence gegevens voor stabiel (HEK293) en voorbijgaand transiënte (HEK293T) geproduceerd vergelijkbare thermische profielen, waaruit de gevoeligheid van de metingen. Gegevenspunten en foutbalken (±SD) vertegenwoordigen dubbele metingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Cellular target engagement isothermale dosis-respons test voor SHP2-WT.
(A) Om optimale isothermale omstandigheden vast te stellen om de dosisafhankelijke doelbetrokkenheid van SHP2-remmers te evalueren, wordt eerst een thermische helling over de korte as van een plaat met 384 put uitgevoerd. Dit maakt een efficiënte beoordeling mogelijk van vijfpuntsdosis-reacties van remmers (RMC-4550; 0,08–10 μM) om de optimale temperatuur te identificeren. (B) Een volledige cellulaire isothermale dosisrespons (10-punts) voor RMC-4550 bij een optimale temperatuur van 56°C. De EC50 bij deze temperatuur is aangegeven. Gegevenspunten en foutbalken (± SD) vertegenwoordigen viervoudige metingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben een doel betrokkenheid test die kan bevestigen directe binding van kleine moleculen aan de SHP2 fosfor in cellen. De test kan onderscheid maken tussen lage en hoge affiniteitsremmers en, belangrijker nog, een gebrek aan potentie bevestigen door de allosterische remmers van het SHP099-type voor de GOF oncogeen SHP2-E76K mutant. Een kracht van deze geminiaturiseerde test is het vermogen om te worden geïntegreerd in een SHP2 remmer screening campagne. Het vermogen van de test om intracellulaire binding aan SHP2 te bevestigen door onbekende chemische stoffen is een belangrijke capaciteit om ervoor te zorgen dat screeningmiddelen efficiënt kunnen worden ingezet. Over het algemeen is het geminiaturiseerde protocol robuust en betrouwbaar.
Een kritiek aspect van de test is timing; de beste resultaten worden 24 uur na transfectie van de HEK293T cellen verkregen. De SHP2-WT en SHP2-E76K eiwitten lijken niet giftig; Echter, hoge expressie op lange termijn kan de gevoeligheid van het experiment verminderen en zou opnieuw optimalisatie vereisen. Zorgvuldige behandeling van cellen om los te maken en voor te bereiden op de test is een extra kritische overweging. Standaard celkweekmethoden zijn echter voldoende om gegevens van hoge kwaliteit te produceren. We hebben een aantal centrifugatiestappen in de workflow opgenomen vanwege de kleine volumes die in deze test worden gebruikt. Deze stappen hebben het doel om kwantitatieve menging te verzekeren, dus naleving van de versnelling en tijd van centrifugatie wordt aanbevolen. Van nota, kunnen de testreagentia na slechte behandeling lijden. Daarom raden we aan dat ze worden aliquoted en opgeslagen bevroren tot gebruik.
Het meest voorkomende probleem in de uitvoering van deze test is een grillig (luidruchtig) of laag luminescentiesignaal. Om de bron van dit probleem te bepalen, is het routine om westerse deslot-analyse uit te voeren op transfected HEK293T-cellen met behulp van anti-ePL-antilichamen om een betrouwbaar expressieniveau van SHP2-WT en SHP2-E76K te garanderen. We hebben de beste resultaten behaald met behulp van het reagensprotocol dat in stap 4 wordt beschreven. Zodra transfectie voorwaarden zijn vastgesteld, en een enkele voorraad van SHP2 expressie plasmid wordt verkregen, hebben we gevonden de test zeer betrouwbaar.
Test ontwikkeling vereist optimalisatie van de chemiluminescent signaal venster om betrouwbare resultaten te verzekeren worden verkregen. Om het testvenster te optimaliseren, is de belangrijkste parameter de formulering van de detectiereagensmodelmix zoals beschreven in de handleiding van de leverancier. Deze optimalisatie wordt uitgevoerd door de EA-reagens-substraatverhouding in de mastermix systematisch te veranderen, terwijl de lysisbuffercomponent constant wordt gehouden (vier verschillende omstandigheden zijn meestal voldoende voor deze meting). Een voorwaarde met nul EA reagens dient als achtergrond. De test wordt uitgevoerd zoals hierboven beschreven en de verhouding tussen het waargenomen signaal en de achtergrond (S/B) wordt berekend. Betrouwbare resultaten worden verkregen wanneer de S/B-verhouding >50 is. Master mix voorwaarden die resulteren in buitengewoon hoog signaal moeten worden vermeden, omdat ze zullen resulteren in uitputting van de chemiluminescentie substraat.
Een mogelijke beperking van de test is de gevoeligheid. In onze ervaring zijn remmers met ten minste een lage micromolarpotentie in SHP2-fosfataseremmingstesten vereist voor het produceren van meetbare effecten in de cellulaire thermische verschuivingstest. Als algemene richtlijn raden we aan om kandidaat-verbindingen in in vitro PTS-tests eerst te beoordelen met behulp van recombinant SHP236. Op basis van de resultaten van onze lopende SHP2 remmer ontdekking programma, een verbindingen vermogen om de SHP2 smelttemperatuur te verschuiven in vitro tracks goed met zijn vermogen om te stabiliseren (of soms destabiliseren) de SHP2 eiwit in cellen. Interessant is dat de relatieve stabilisatie van SHP2-WT door SHP099-achtige allosterische remmers groter lijkt te zijn dan die veroorzaakt door even krachtige SHP2 actieve site-gerichte remmers, waarschijnlijk als gevolg van het vermogen van de allosterische remmers om effectief te stabiliseren een fysiologisch relevante conformatie van de SHP2-WT eiwit.
Naast de SHP2-fosfatase hebben we ervaring opgedaan in het ontwikkelen van cellulaire target engagement-tests voor andere fosfatases en kinases. Een primaire overweging met een ander eiwitdoel is om een combinatie van positieve en negatieve controleexperimenten te gebruiken om de geldigheid van de test vast te stellen, alvorens middelen volledig te committeren aan de interpretatie van ligandbindende gegevens. Verder zijn er andere technologieën beschikbaar voor het beoordelen van cellulaire doelbetrokkenheid. We hebben een aantal alternatieven voor de SHP2 phosphatase onderzocht, maar vonden deze test zeer nuttig in onze inspanningen. Ten slotte is deze test onafhankelijk van SHP2 enzymatische activiteit en maakt het daarom mogelijk voor de evaluatie en optimalisatie van kleine moleculen zonder rekening te houden met hun bindingsmodus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten met de inhoud van dit artikel hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (aan L.T.), Epstein Family Foundation Award (aan N.D.P.C.), en NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199. Bovendien is dit project geheel of gedeeltelijk gefinancierd met federale fondsen van het National Cancer Institute, National Institutes of Health, onder Chemical Biology Consortium Contract No. HHSN261200800001E. De inhoud van deze publicatie weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de standpunten of het beleid van het Ministerie van Volksgezondheid en Human Services, noch vermeldt het van handelsnamen, commerciële producten, of organisaties goedkeuring door de Overheid van de V.S. impliceert. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well gradient equipped thermocycler | Eppendorf AG | X50h | |
| 384-well low dead volume microplate Echo qualified | Beckman Coulter, Inc. | LP-0200 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner Bio-One | 657 160 | Sterile with lid |
| Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | |
| Cell counter | Thermo Fisher Scientific | Countess II FL | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566-016 | 500 mL |
| Echo acoustic liquid handler | Beckman Coulter, Inc. | Echo 550 | |
| Electronic multichannel pipette | Thermo Fisher Scientific | E1 ClipTip | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140-079 | 500 mL |
| HEPES buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630-680 | 100 mL |
| InCell Pulse starter kit | Eurofins DiscoverX Corp. | 94-4007 | Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate |
| Microplate reader | Tecan Trading AG | Spark | |
| Single channel solution trough | Thermo Fisher Scientific | S253012005 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-010 | 100 mM |
| Thermal microplate sealer | Agilent Technologies, Inc. | PlateLoc | |
| Transfection reagents | Polyplus Transfection | jetPRIME | |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| TrypLE Express reagent | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | |
| Twin.tec 384 real-time PCR plates | Eppendorf AG | 30132734 |
References
- Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
- Alonso, A., et al.
- Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).
- Ferguson, F. M., Gray, N. S.
- Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
- Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
- Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
- Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
- Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
- Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
- Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, Academic Press. Amsterdam. 771-809 (2010).
- Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
- Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
- Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
- Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T.
- Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
- Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
- Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
- He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
- Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
- Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
- Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
- Clinical Trial NCT03114319. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019).
- Clinical Trial NCT03634982. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019).
- Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
- LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).
- Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).
- Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
- Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
- McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
- Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
- Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).
