Summary
Sağlam hücrelerde aday inhibitörleri tarafından hedef nişan değerlendirmek için yeteneği ilaç keşfi için çok önemlidir. Bu protokol, vahşi tip SHP2 veya onkojenik varyantlarını hedefleyen inhibitörlerin hücresel hedef etkileşimini güvenilir bir şekilde algılayan 384 iyi biçimli hücresel termal değişim testini tanımlar.
Abstract
PTPN11 proto-onkogen tarafından kodlanmış Src-homology 2 (SH2) etki alanı içeren fosfataz 2 (SHP2), hücre sağkalım ını ve çoğalmasını teşvik eden, reseptör tirozin kinaz (RTK) güdümlü hücre sinyalinin önemli bir aracısıdır. Buna ek olarak, SHP2 B ve T hücre aktivasyonunu inhibe etmek için bağışıklık kontrol noktası reseptörleri tarafından işe. Anormal SHP2 fonksiyonu birçok kanserin gelişimi, ilerlemesi ve metastazında yer almıştır. Nitekim, küçük molekül SHP2 inhibitörleri son ras / Raf / ERK yolu aktivasyonu ile katı tümörlerin tedavisi için klinik çalışmalara girmiştir, bazı onkojenik Ras mutasyonları ile tümörler de dahil olmak üzere. Ancak, SHP2 inhibitörlerinin mevcut sınıf lösemilerde sık görülen SHP2 onkojenik varyantlarına karşı etkili değildir ve onkojenik SHP2'yi hedefleyen spesifik küçük moleküllerin gelişimi güncel araştırmanın konusudur. SHP2 gibi sitosolik proteinleri içeren çoğu ilaç keşif kampanyaları ile ortak bir sorun, birincil tahliller bu sürücü kimyasal keşif genellikle in vitro tahliller aday bileşiklerin hücresel hedef nişan rapor yok olmasıdır. Hücresel hedef etkileşimini ölçmek için bir platform sağlamak için hem vahşi tip hem de mutant SHP2 hücresel termal değişim tahlilleri geliştirdik. Bu tahliller, hücrelerdeki SHP2 inhibitörlerinin hedef katılımını güvenilir bir şekilde algılar. Burada, SHP2 inhibitörlerinin değerlendirilmesi ve karakterizasyonu için değerli bir araç sağlayan bu testin kapsamlı bir protokolünü salıyoruz.
Introduction
Tirozin fosforilasyon hücrelerde sinyal transdüksiyon önemli bir rol oynar1,2. Bu post-translational modifikasyon protein tirozin kinazları (PtKs) tarafından katalize edilir ve protein tirozin fosfatazlar (PtPs) tarafından tersine çevrilir. Bu nedenle, anormal PTK veya PTP fonksiyonu birçok kalıtsal veya edinilmiş insan hastalıkları3yol açar,4,5,6. Src-homology 2 (SH2) etki alanı içeren fosfataz 2 (SHP2) yaygın olarak ifade edilen non-reseptör tipi PTP proto-oncogene PTPN117 tarafından kodlanmış ve Ras / Raf / ERK, PI3K / Akt veya JAK / STAT sinyal yollarıaktivasyonuile sinyal transdüksiyon içeren çok sayıda fizyolojik süreçlerin önemli bir düzenleyici 8 . Normalde, SHP2 aktivitesi anormal sinyalizasyonönlemek için sıkı bir şekilde düzenlenir. Bazal koşullar altında SHP2, katalitik fosfataz etki alanı içinde aktif bölgeye erişimi engelleyen N-terminal SH2 etki alanı tarafından otomatik olarak engellenir (Şekil 1A)9,10. Hücre aktivasyonu üzerine, tirozin fosforlu bağlayıcı proteinler SHP2'yi işe alır ve aktif alan artık alt tabakalarına erişebildiği aktif konformasyonunu benimsemesine neden olur. Birçok kanserde SHP2 aktivitesi yükselir. PTPN11'deki somatik fonksiyon kazanım (GOF) mutasyonları daha çok lösemilerde tespit edilmiştir ve N-SH2 etki alanının fosfataz etki alanına bağlanmasını önleyerek kurucu olarak aktif SHP2(Şekil 1B)11ile sonuçlanmıştır. PTPN11'deki Germline GOF mutasyonları Noonan sendromu olgularının ~%50'si, malignite riski yüksek bir gelişimsel bozukluktan sorumludur12. PTPN11 mutasyonlarının nadir olduğu solid tümörlerde, fosforilasyonlu bağlayıcı proteinlerin daha yüksek düzeyleri gelişmiş SHP2 aktivitesine yol açar(Şekil 1C). SHP2 de bağışıklık kontrol noktası sinyalizasyonu için önemlidir, BTLA veya PD-1 gibi kontrol noktası reseptörleri gibi anahtar sinyal molekülleri defosforilasyon için shp2 işe, bağışıklık hücresi aktivasyonunu önlemek13,14,15.
PtP'lerin aktif alanı yüksek oranda korunmuş ve yüksek oranda şarj edildiği için, PtP'lerin küçük moleküllerle hedeflanması zor olmuştur; aktif site hedef inhibitörleri genellikle güçlü, ama kötü seçicilik ve oral biyoyararlanım sergiler16,17,18,19,20,21,22.18 Nitekim, birçok rapor SHP2 inhibitörleri kötü seçicilik ve hücrelerde etkinlik eksikliği muzdarip23. Son zamanlarda, iyi potens ve mükemmel seçicilik ile SHP2 allosteric inhibitörleri bildirilmiştir (örneğin, SHP09924 ve RMC-455025)ve SHP2 inhibitörleri yenilenen ilgi yol açtı. Bileşikler SHP099 ve RMC-4550 dayalı şu anda faz I klinik çalışmalarda reseptör tirozin kinaz ile katı tümörleri tedavi etmek için (RTK) yolu aktivasyon26,27. Çığır açan iken, Bu bileşikler kan kanseri hastalarının önemli sayıda lökemogenez sürücü SHP2 onkojenik mutantların çoğuna karşıetkisizdir28,29,30. SHP2 onkojenik varyantlarına doğru SHP2 benzeri bileşiklerin bu potens eksikliği, SHP2 mutantlarında bozulan inaktif, kapalı konformasyonu bağlayarak ve stabilize ederek SHP2 aktivitesini inhibe ettikleri için, benzersiz allosterik mekanizmalarından kaynaklanmaktadır. Ayrıca, yeni bir rapora dayanarak31, SHP099 benzeri inhibitörleri ile tedavi hastalarda adaptif direnç mekanizmaları oldukça akla yatkındır. Sonuç olarak, aktif, açık durumunu hedefleyen yeni nesil SHP2 inhibitörlerinin geliştirilmesi yoğun bir araştırma konusudur.
Hücrelerde yeni SHP2 inhibitörlerinin karakterizasyonu kurşun optimizasyon sürecinin önemli bir yönüdür. Kritik, fizyolojik koşullar altında inhibitörü kanıtlanmış hedef nişan tıbbi kimya için kaynakların verimli verici hücresel etkinliği ile bileşikler üzerinde dağıtılan ek bir güven düzeyi sağlar. Geçmişte, küçük molekül inhibitörlerinin hedeflerine bağlanmasını değerlendirmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir, öncelikle protein kinazları için32. Bir SHP2 hücresel hedef nişan analizi geliştirmek için, bir hücresel termal vardiya analizi33kullandı. Bu test, proteinler için in vitro termal shift benzer (PTS) test34, genellikle küçük moleküllerin bağlanması ile değiştirilir hedef protein termal stabilite, izler. Orijinal testi hedef protein düzeylerini ölçmek için antikorlar kullanan düşük bir iş testidir. Alternatif olarak, bir β-galaktosidaz enzim parça tamamlayıcılığı (EFC) analizi(Şekil 2)35kullanan termal kayma analizinin yakın zamanda bildirilen bir varyantını seçtik. Bu deneyler için, ilgi protein gelişmiş bir ProLabel etiketi taşıyan bir N- veya C-terminal füzyon proteini olarak hücrelerde ifade edilir (ePL, β-galaktosidaz bir 42 amino asit parçası). Hücreler daha sonra 384-iyi PCR uyumlu plakalar aktarılır ve ilgi bileşikleri ile kuluçkaya yatırılır. Bir termocycler proteinleri denature ve sıcaklık ısı stabilitesine bağlı olarak arttıkça agrega olacak hücrelere bir sıcaklık gradyan uygulamak için kullanılır. Bir aday bileşiğin ilgi proteinini bağlayıp stabilize edebilme yeteneği, o proteinin termal stabilitesinin artmasına neden olacaktır. Bu nedenle, hücrelerin lysis aşağıdaki, bir aday bileşik tarafından stabilize edilmiş bu etiketli proteinler araç kontrolü ile kuluçka hücrelerinetiketli proteinler daha yüksek sıcaklıklarda çözelti kalacaktır. Muhabir enzim kabul edici (EA) çözünür ePL etiketli proteinleri tamamlayarak, lüminesans substratı kullanılarak saptanabilir β-galaktosidaz aktivitesi ile sonuçlanır.
Yakın zamanda yabani tip SHP2 (SHP2-WT) ve sık shp2 onkojenik varyant (SHP2-E76K) için sağlam bir hücresel termal vardiya tayini geliştirdik minyatür leştirilmiş 384-iyiformat36. Burada, hücrelerdeki SHP2 inhibitörleri tarafından hedef etkileşimini güvenilir bir şekilde algılayan ve inhibitör potens ile hücresel termal değişim verileri arasında yüksek derecede korelasyon gösteren bu testin ayrıntılı bir protokolünü rapor ediyoruz. Genel titreiş akışı Şekil 3'tegösterilmiştir. Platformumuz n-terminally etiketli tam uzunlukta ePL-SHP2 füzyon proteinleri kullanır. İlgili pICP-ePL-N-SHP2-WT ve pICP-ePL-N-SHP2-E76K ifade plazmidleri üretimi için lütfen son yayın36bakın . Bu töz, SHP2 termal profillerini oluşturmak ve inhibitörün varlığında veya yokluğunda SHP2 erime sıcaklıklarını belirlemek için bir termal degrade kullanılarak gerçekleştirilebilir. Termal profiller kurulduktan sonra, aynı zamanda inhibisyon doz-yanıt değerlendirmesi sağlayan, izotermal koşullar altında yapılabilir. Her iki deney türü de aşağıda açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre kültürünün ve reaktiflerinin hazırlanması
- %10 fetal sığır serumu, 1x antibiyotik/antimikotik, 20 mM HEPES ve 1 mM sodyum pirüuvat içeren 500 mL'lik bir büyüme ortamı şişesi formüle edin. 4 °C'de saklayın.
- Dondurulmuş orijinal stok şişelerinden hücresel termal kaydırma reaktiflerini (EA reaktifi, lisis tamponu ve substrat) eritin.
- Reaktifleri ve tamponu 2 mL aliquot olarak dağıtın ve -20 °C'de saklayın.
NOT: Tekrarlanabilirlik için donma/çözülmeden kaçının ve yalnızca hakemprosedürü için gerekli olan reaktif hacmini kullanın.
2. HEK293T hücrelerinin büyümesi ve bakımı
- Kriyo depolamadüşük geçiş li HEK293T hücreleri elde edin.
- 37 °C, %5 CO2'dehek293T hücrelerini büyüme ortamlarında koruyun.
- Hücreleri her 4 günde bir 1:14 oranında bölün.
NOT: En iyi performans için HEK293T hücrelerinin 25 defadan fazla geçmesine izin verilmez.
3. Geçici geçici feksiyon için HEK293T hücre hazırlığı
- HÜCRE kopma reaktifinin 3 mL'sini kullanarak HEK293T hücrelerini 16 mL plakadan ayırın.
- 12 mL büyüme ortamı ile seyreltin. 4 dk için 1.400 x g santrifüj ile hücreleri toplayın.
- 10 mL büyüme medyasında peleti yeniden askıya alın. Trypan mavisi ve hücre sayacı kullanarak hücrelerin konsantrasyonu ve canlılığını ölçün.
- Plaka 7.0 x 105 transfeksiyon dan önce yaklaşık 24 saat 6 kuyulu bir hücre kültür plakası iyi başına katlanarak büyüyen HEK293T hücreleri.
NOT: Her plazmidin transfekte olması için bir kuyu ayırın. - 37 °C'de 24 saat kuluçka, %5 CO2.
4. HEK293T hücrelerinin transfeksiyonu
- PICP-ePL-N-SHP2-WT veya pICP-ePL-N-SHP2-E76K (~200 ng/μL) saflaştırılmış plazmid stokundan 2μg plazmid DNA'yı 200 μL transfeksiyon tamponuna seyreltin.
- 10 s ve santrifüj için girdap 1400 x g için 4 dk.
- Seyreltilmiş DNA'ya 4 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin. 10 s ve santrifüj için girdap 1400 x g için 4 dk.
- 10 dk için 23 °C'de kuluçka.
- Büyüyen HEK293T hücrelerini içeren 6 kuyu plakasını kuvözden çıkarın. Transfeksiyon karışımını 6 kuyuluk plakadaki bağlı hücrelere ekleyin. 37 °C'de 24 saat kuluçka, %5 CO2.
5. Numune plakalarının hazırlanması
- Test edilecek bileşiklerin DMSO'da 10 mM stok çözeltisi hazırlayın.
- Hemen kullanım için 384 kuyulu düşük ölü hacimli kaynak plakaya inhibitör çözeltileri dağıtın.
- İstenilen inhibitörlerin veya aracın (DMSO) sıvı işleyicisini kullanarak 384-iyi gerçek zamanlı PCR plakalarına % 0,5 DMSO'dan (v/v) daha az bir hedef son hacminde yerleştirin. Plakayı, inert gaz temizleme ile bir plaka mühürleyici kullanarak kapatın.
NOT: Inhibitör doz-yanıt tahlilleri için, dmso'nun her inhibitör konsantrasyonu için eşit miktarda DMSO kullanılması için buna göre dmso'nun geri doldurulduğundan emin olun. En iyi sonuçları elde etmek için plakaları 23 °C'de saklayın ve plakaları 24 saat içinde kullanın.
6. Transfected hücre kopması ve hazırlanması
- Preincubate büyüme ortamı ve hücre müfrezeresi 37 °C su banyosunda. Transfected hücreleri kuvözden çıkarın. Plakanın kuyularından hafifçe aspire edin.
NOT: Farklı bir transfected plazmid içeren her kuyu için yeni bir aspiratör kullanın. - Hücre ayırma reaktifinin 0,3 mL'sini ekleyin. Plakanın alt yüzeyini iyice kaplayacak şekilde plakayı hafifçe ileri geri sallayın. 23 °C'de 2 dk kuluçkaya yatırın.
- Her kuyuya 1 mL büyüme ortamı ekleyin. Yavaşça pipet medya ve hücreler kuyuda ve 15 mL Falcon santrifüj tüp aktarın. 4 dk için 1.400 x g santrifüj ile hücreleri toplayın.
- Yavaşça ama iyice medya kapalı aspire.
NOT: Hücre ayırıcısında kalan fenol kırmızısı, tetkikile engel olabilir. - 2 mL büyüme ortamında hücre peletini dikkatlice yeniden askıya alın. Trypan mavisi ve hücre sayacı kullanarak hücrelerin konsantrasyonu ve canlılığını ölçün.
NOT: En iyi sonuçlar için hücre canlılığı > %90 olmalıdır. - Hücreleri 125 hücre/μL konsantrasyonuna seyreltin. Örneğin, 5 μL'lik bir tsede için bu ~625 hücre/μL'dir. Optimum canlılık için hücreleri en fazla 2 saat süreyle süspansiyonda tutun.
7. SHP2 inhibitörleri ile hücrelerin kuluçka
- Hücreleri steril tek kanallı bir çözeltiye dağıtın.
- SHP2 inhibitörü birikimi tarafından 2.500 x g'de 23 °C'de 5 dk için önceden hazırlanmış olan centrifuge 384-iyi gerçek zamanlı PCR plaka.
- Bileşik plakadan mührü çıkarın. 125 μL çok kanallı pipet kullanarak seyreltilmiş hücrelerin 5 μL'sini istenilen kuyulara ekleyin.
- Plakayı 42 x g'de 30 s'lik bir kapak olmadan santrifüj edin. Plaka aşağı döndürüldükten sonra plakaya bir kapak contası takın ve 1 saat için %5 CO2, 37 °C'de ispre plakasını inkübe edin.
8. Kemilüminesanre reaktif ana karışımının hazırlanması
- Hücreleri kaplamadan sonra -20 °C depolamadan gerekli miktarda algılama reaktifini (EA reaktifi, lysis tamponu ve substrat) çıkarın. 23 °C'de çözülme reaktifleri.
NOT: Aktarımkolaylığı için, plakaya yatırılan hücrelerin toplam hacminin 1,5 katını içeren bir hacim hazırlayın. Kullanımdan sonra reaktifleri tekrar kullanmayın. - EA-10 koşulu kullanılarak reaktiflerin ana karışımını hazırlayın, bileşen ve hacim fraksiyonu aşağıdaki gibidir: EA reaktifi (0.17), lysis tampon (0.17), substrat (0.67).
NOT: Reaktif oranları, tedarikçi kılavuzunda belirtildiği şekilde gerçekleştirilen optimizasyon deneylerine dayanır.
9. İzotermal profil gradyan ısı darbesi
- Isı darbesinin teslimi için degrade yeteneğine sahip termocycler'ı programla.
- Termal profil gradyan deneyleri için termocycler'ı aşağıdaki örnek özelliklerle önceden programlatın:
- Isı darbesi: 3 dk istenilen erime sıcaklığı (dikey veya yatay degrade +/- 15 °C; örnek 38-68 °C 24 kuyuya yayılmış 1,25 °C sıcaklık artışları verir).
- Denge geri kazanım adımı: rampa hızı = 1 °C/s 3 dk 20 °C
- İzotermal deneyler için protokolü aşağıdaki gibi ayarlayın:
- Isı darbesi: 3 dk 55 °C. Denge geri kazanım adımı: rampa hızı = 1°C/s ile 3 dk 20 °C
NOT: Daha fazla tekrarlanabilirlik için, termocycler istenilen sıcaklığa ulaştığında plakayı tam olarak yerleştirmek zor olabileceğinden, 3 dk darbeye başlamadan önce programı 15 s'yi saymak üzere ayarlayın. Bu deneyde kullanılan termocycler için Bkz. Malzeme Tablosu, kapak ısı darbesi sırasında tutulur.
10. Lysis algılama ve ölçümü
- Çok kanallı pipet kullanılarak analiz edilecek her kuyuya eşit hacimler (5°L) ekleyerek lysis detection master karışımı ile ek test plakaları.
- 30 s için plaka 42 x g santrifüj. 30-60 dakika karanlıkta 23 °C'de saklayın.
- 384-iyi formatta parlaklık algılama yeteneğine sahip bir mikroplaka okuyucu kullanarak kemilüminesans ölçün. Plaka tipi ve entegrasyon süresi optimize edilmiş (entegrasyon süresi 1000 ms, yerleşme süresi 0 s) ile parlaklık ölçümü yapın. Değerleri daha fazla analiz için sayım/s olarak ölçün.
11. Veri analizi
- Bilimsel bir 2B grafik ve istatistik yazılımı kullanarak parlaklık verilerini analiz edin.
- Doğrusal olmayan regresyon ve Boltzmann sigmoidal modeli kullanarak normalleştirilmiş lüminesans verilerini (araç kontrolüne göre normalleştirilmiş) analiz ederek termal profiller oluşturun.
NOT: Termal profil deneylerinde, hesaplanan V50, eğrinin alt ve üst arasındaki yarım noktası olan sıcaklık, SHP2'nin erime sıcaklığını tanımlar. İnisotermal deneylerde, EC50 yarı maksimal yanıt veren inhibitörün konsantrasyonu tanımlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SHP2-WT için termal gradyan deneyi, katlanmış bir protein için tipik ve tutarlı olan dar bir erime geçişine sahip sigmoidal hücresel termal profille sonuçlandı(Şekil 4A). SHP2 üç bağımsız etki alanından oluşur: iki SH2 etki alanı ve katalitik etki alanı(Şekil 1). Otomatik inhibe kapalı konformasyon bu etki alanları kendi kendine ilişkilendirmek; Termal profil deneyinde gözlenen erime geçişi muhtemelen hücredeki bu durumu yansıtmaktadır. SHP2-WT'nin allosterik inhibitörü SHP099 ile 10 μM'de inkübasyonu SHP2-WT termal profilini önemli ve ölçülebilir bir dereceye kadar stabilize etti(Şekil 4A). Bu, düzenleyici bağlayıcı SH2 etki alanları ve katalitik alt birim arasında "moleküler tutkal"37 olarak hareket SHP099 benzeri inhibitörlerin bilinen bağlama modunu yansıtmaktadır. Daha da önemlisi, hücresel termal vardiya analizimiz SHP099'un hücreye girebileceğini ve etiketli SHP2-WT'ye bağlanabileceğini doğruladı. SHP2'nin stabilizasyonu, SHP099 benzeri allosterik bileşiklerin gücüyle de izlendi. 10 μM'de, daha güçlü RMC-4550 (rapor edilen IC50 = 0,6 nM) SHP2-WT için SHP2-WT(Şekil 4B)için SHP099'dan (rapor edilen IC50 = 70 nM) daha fazla stabilizasyon derecesi üretti.
Onkojenik mutant SHP2-E76K(Şekil 4C)ile hedef nişan analizinin termal profilinde farklı bir davranış gözlemliyoruz. SHP2-E76K'nın termal profili, SH2 etki alanları ile katalitik alt birim arasındaki etkileşimleri bozduğu bilinen E76K mutasyonu ile SHP2'nin üçüncül yapısında verilen bozulmayı yansıtan, daha az dar bir erime geçişine sahiptir. Bu nedenle, gözlenen erime sıcaklığı WT proteinine göre düşürüldü. Daha da önemlisi, allosteric inhibitörü SHP099 ile 10 μM'de kuluçkaya yattığında, SHP099 ve benzeri inhibitörlerin bilinen özellikleri ile tutarlı olarak sadece marjinal termal stabilizasyon gözlenmiştir28,29,30.
Incelenecek ePL etiketli proteinin ifade düzeyi sinyal yoğunluğunu önemli ölçüde etkileyebilir. Gösterilen(Şekil 4D)aynı istinat koşullarında geçici ve stably entegre SHP2-WT hücreleri için termal profillerdir. Bu birbirinden farklı eğrilerin normalleştirilmesi, EFC algılama sisteminin geniş yelpazesini gösteren karşılaştırılabilir termal profiller(Şekil 4E)sağlar. Hem geçici transfeksiyon hem de kararlı entegrasyon SHP2 hücreleri karşılaştırılabilir sonuçlarla ifade eden istihdam ettik dikkat etmek önemlidir. Kararlı hücre hatlarının üretimi için HEK293T hücreleri yerine HEK293t hücrelerinin kullanılması gerektiği unutulmamalıdır, çünkü HEK293T hücreleri zaten memeli hücrelerinde seçim için neomisin/kanamisin direnci geni içeren entegre pICP-ePL-N-SHP2 plazmidli hücrelerin seçilmesini engelleyecek bir neomisin direnç belirtecine sahiptir.
Inhibitör doz-yanıt ölçümleri elde etmek için, bir isothermal koşullar altında hücrelerüzerinde bileşik titrasyonlar gerçekleştirebilirsiniz. Bunu yapmak için, öncelikle bu ölçümler için optimum sıcaklığı belirlemenizi öneririz. 384 kuyulu bir plakanın "kısa" ekseninde termocycler üretme yeteneğinden yararlanarak, tek bir plaka üzerinde bir dizi izothermal titrasyon yapılabilir. Şekil 5A, RMC-4550'nin sınırlı beş noktalı doz yanıtı kullanılarak SHP2-WT için bu optimizasyonun temsili sonuçlarını göstermektedir. Proteinden denatüre edilemeyecek kadar düşük sıcaklıklar, ilaçtan bağımsız yüksek bir sinyal üretti. Benzer şekilde, çok yüksek sıcaklıklar protein stabilize etmek için bileşik için çok az kapasite sağlar. Ancak, bu deneytarafından belirlenen en uygun sıcaklıkta, tam 10 noktalı doz yanıtı kullanılarak bir izotermal titrasyon RMC-4550 için yararlı bir EC50 verdi(Şekil 5B). Burada gösterilen temsili verilere ek olarak, eniyimis otomal koşulları kullanarak deneylerin hücre zarlarını çapraz ve hedeflerini hücrelere dahil etme yetenekleri için yeni SHP2 inhibitörlerini verimli bir şekilde taramak için kullanılabilir olduğunu belirledik36.
Şekil 1: SHP2 faaliyetinin düzenlenmesi.
(A) SHP2 aktivitesi normal hücrelerde sıkı bir şekilde düzenlenir. Bazal koşullar altında, Onun N-terminal SH2 etki phosphatase içinde aktif site tıkabas (PTP) etki alanı, otoinhibition ile sonuçlanan. RTK büyüme faktörü ve sitokin stimülasyonu adaptör proteinlerinin tirozin fosforilasyonuna yol açar, bu da daha sonra SH2 etki alanlarını bağlar ve SHP2 aktif alanının alt tabakalarına erişebileceği bir konformasyonel değişime neden olur. (B) Sormatik SHP2 mutasyonları, sıklıkla lösemilerde bulunur ve N-SH2 ve fosfataz etki alanları arasındaki arabirimde yer alır ve SHP2'nin kapalı, otoinlatan konformasyonu benimsemesini önler ve bu da bir kurucu aktif fosfataz ile sonuçlanır. (C) Solid tümörlerde, büyüme faktörlerinin, RTK'ların veya iskele adaptörlerinin amplifikasyonu veya aşırı ekspresyonu SHP2'nin anormal aktivasyonuile sonuçlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: SHP2 hücresel termal kayma prensipleri.
Hücresel hedef nişan testimiz β-galaktosidaz (β-gal) enzim parça tamamlayıcısı (EFC) testini temel alınarak yapılır. Hücreler (HEK293T), bir ePL füzyon etiketi ile tam uzunlukta SHP2 ifade (β-gal 42 amino asit parçası), bir sonda bileşik ile tedavi edilir ve SHP2 denature ve çözünmez agregalar oluşturmak için neden olan kısa bir ısı darbesi tabi tutulur, ePL etiketi erişilemez hale. Prob bileşiğinin SHP2'ye özel bağlanması Termal stabilitesini artırabilir. Termal stabilizasyon, muhabir enzim kemilüminesans sisteminde kompleman için ePL etiketi ile daha çözünür hedef protein sağlar. Agregalar daha az tamamlayıcılık ve parlaklık ile sonuçlanır. Bu rakam ref.36'dandeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Minyatür Leştirilmiş SHP2 ekipman iş akışı.
Testin rutin performansı belirtilen ekipmanın kullanımını sağlar. Ataşma plakaları, nanolitre hacimlerde bileşikler sağlayan akustik sıvı işleyicisi kullanılarak hazırlanır. Hücre transferi, çok kanallı bir pipet kullanılarak veya otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak el ile gerçekleştirilebilir. Isı darbeden denatürasyonu, 384 kuyulu bir plakaya termal degradeler sağlayabilen bir termocycler kullanır. Bir mikroplaka okuyucu β-gal EFC ispon kemilüminesans tespit etmek için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Allosterik SHP2 inhibitörlerinin SHP2-WT ve SHP2-E76K proteinleriyle hücresel hedef etkileşimi.
(A) Araç varlığında SHP2-WT protein (DMSO, kırmızı) otoinhibited durumda katlanmış bir protein ile tutarlı dar bir erime geçiş ile iyi davranmış hücresel termal profil üretti. 10 μM SHP099 ile ifade eden SHP2-WT hücrelerinin kuluçka (mavi) bağlı durumda protein stabilize. (B) SHP2-WT'nin SHP2-WT'nin hücresel hedef nişan termal profilleri (kırmızı) veya SHP099 benzeri allosteric inhibitörü RMC-4550 (10 μM, mavi) varlığında. RMC-4550, SHP099'da gözlenenden daha fazla SHP2-WT hücresel stabilizasyonu üretti. Bu artan hedef nişan onun daha büyük biyokimyasal gücü ile izler. (C) SHP2-E76K mutant ı büyük ölçüde "açık" aktif formda (kırmızı) bir durum ile tutarlı daha az belirgin erime eğrisi vardı. SHP099 at 10 μM sadece marjinal Biyokimyasal inhibisyon ve hücresel etkinlik verileri ile uyum içinde Olan SHP2-E76K erime sıcaklığı (mavi) arttı. (D) Gözlenen kemilüminesans sinyali ePL-SHP2 ifade düzeyine karşılık gelir. Geçici olarak transfected HEK293T hücreleri ile karşılaştırıldığında, ePL etiketli SHP2-WT'nin genoma entegre edildiği HEK293 hücreleri, ePL-SHP2 ekspresyonunda azalma düzeyine sahipti. Sonuç olarak, ham normalize edilmiş chemiluminesence termal profilleri, geçici olarak transfected HEK293 hücreleri (kırmızı) ile karşılaştırıldığında, hek293 hücreleri (mavi) ile karşılaştırıldığında, stably ifade eden HEK293 hücreleri için büyük ölçüde azaltılmış bir parlaklık sinyali gösterdi. E) Ham kemilüminesans verilerinin stabil (HEK293) ve geçici transfektasyon (HEK293T) normalizasyonu, ölçümlerin hassasiyetini gösteren karşılaştırılabilir termal profiller üretti. Veri noktaları ve hata çubukları (±SD) yinelenen ölçümleri temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: SHP2-WT için hücresel hedef nişan isothermal doz-yanıt analizi.
(A) SHP2 inhibitörlerinin doza bağlı hedef etkileşimini değerlendirmek için optimal isothermal koşulları niçin belirlemek için ilk olarak 384 kuyuluk bir plakanın kısa ekseninde bir termal degrade yapılır. Bu, en uygun sıcaklığı belirlemek için inhibitörlerin beş noktalı doz yanıtlarının (RMC-4550; 0.08-10 μM) etkin bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. (B) RMC-4550 için 56°C'lik optimum sıcaklıkta tam hücresel isothermal doz yanıtı (10 nokta). Bu sıcaklıktaki EC50 gösterilir. Veri noktaları ve hata çubukları (± SD) dört lü ölçümleri temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Küçük moleküllerin hücrelerdeki SHP2 fosfatazına doğrudan bağlanmasını doğrulayabilecek bir hedef nişan analizi sunduk. Taht, düşük ve yüksek afisite inhibitörleri arasında ayrım yapabilir ve daha da önemlisi GOF onkojenik SHP2-E76K mutantı için SHP099 tipi allosterik inhibitörlerin potens eksikliğini doğrulayabilir. Bu minyatür leştirilmiş tayini bir gücü bir SHP2 inhibitörü tarama kampanyasına entegre edilebilir yeteneğidir. Tdenemenin bilinmeyen kimyasal madde ile SHP2'ye hücre içi bağlanmasını onaylama yeteneği, tarama kaynaklarının verimli bir şekilde dağıtılabilmelerini sağlamak için önemli bir kapasitedir. Genel olarak, minyatürleştirilmiş protokol sağlam ve güvenilirdir.
Tsanın kritik bir yönü zamanlamadır; hek293T hücrelerinin transfeksiyonundan 24 saat sonra en iyi sonuçlar elde edilir. SHP2-WT ve SHP2-E76K proteinleri toksik görünmüyor; ancak, uzun süreli yüksek ekspresyon deneyin hassasiyetini azaltabilir ve yeniden optimizasyon gerektirir. Hücrelerin dikkatli bir şekilde ayrılması ve onları teşkezlik için hazırlanması ek bir kritik husus. Ancak, standart hücre kültürü yöntemleri yüksek kaliteli veri üretmek için yeterlidir. Bu çıktıda kullanılan küçük hacimler nedeniyle iş akışına bir dizi santrifüj adımı dahil ettik. Bu adımlar kantitatif karıştırma sağlamak için amacı var, bu nedenle hızlanma ve santrifüj zaman bağlılık önerilir. Not, asa reaktifler kötü kullanım sonra zarar verebilir. Bu nedenle, kullanıma kadar bunların aliquoted ve dondurulmuş depolanmış olmasını öneririz.
Bu töz performansında en sık karşılaşılan sorun düzensiz (gürültülü) veya düşük parlaklık sinyalidir. Bu sorunun kaynağını belirlemek için, SHP2-WT ve SHP2-E76K'nın güvenilir bir ifade düzeyini sağlamak için anti-ePL antikorları kullanarak transfected HEK293T hücrelerinde Batı leke analizi yapmak rutindir. 4. adımda özetlenen reaktif protokolünü kullanarak en iyi sonuçları elde ettik. Transfeksiyon koşulları oluşturulduktan ve tek bir SHP2 ekspresyonu plazmidi elde edildikten sonra, tözünün son derece güvenilir olduğunu gördük.
Taht geliştirme güvenilir sonuçlar elde sağlamak için kemilüminesans sinyal penceresinin optimizasyonu gerektirir. Arama penceresini optimize etmek için en önemli parametre, tedarikçi kılavuzunda açıklandığı gibi algılama reaktifi ana karışımının formülasyonudur. Bu optimizasyon, ea reaktifinin ana karışımdaki substrat oranına sistematik olarak değiştirilmesi, lysis tampon bileşeni sabit tutularak gerçekleştirilir (genellikle bu ölçüm için dört farklı koşul yeterlidir). Sıfır EA reaktifi olan bir koşul arka plan olarak hizmet vermektedir. Tsurk yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirilir ve gözlenen sinyalin arka plana (S/B) oranı hesaplanır. S/B oranı >50 olduğunda güvenilir sonuçlar elde edilir. Olağanüstü yüksek sinyal ile sonuçlanan ana karışım koşullarından kaçınılmalıdır, çünkü bunlar kemilüminesans substratının tükenmesine neden olacaktır.
Tsanın olası bir sınırlaması duyarlılığıdır. Deneyimlerimize göre, Hücresel termal kayma tahlillerinde ölçülebilir etkiler üretmek için SHP2 fosfataz inhibisyonu tahlillerinde en az düşük mikromolar potense sahip inhibitörler gereklidir. Genel bir kılavuz olarak, ilk rekombinant SHP236kullanarak in vitro PTS tahlillerinde aday bileşikleri değerlendirmek öneririz. Devam eden SHP2 inhibitörü keşif programımızın sonuçlarına dayanarak, shp2 erime sıcaklığını in vitro olarak kaydırma yeteneği, hücrelerdeki SHP2 proteinini dengeleme (veya bazen de dengesini bozma) kapasitesine sahip. İlginçtir, SHP2-WT'nin SHP099 benzeri allosteric inhibitörleri tarafından göreceli stabilizasyonu, shp2-WT proteininin fizyolojik olarak uygun bir konformasyonunu etkili bir şekilde stabilize etme yeteneğini yansıtan, aynı derecede güçlü SHP2 aktif site yönelimli inhibitörlerin neden olduğu ndan daha büyük görünmaktadır.
SHP2 fosfataz'a ek olarak, diğer fosfatazlar ve kinazlar için hücresel hedef nişan tahlilleri geliştirme deneyimi kazandık. Farklı bir protein hedefi ile birincil göz, ligand bağlayıcı verilerin yorumlanması için tam olarak kaynakları taahhüt etmeden önce, test geçerliliğini belirlemek için pozitif ve negatif kontrol deneyleri bir arada kullanmaktır. Ayrıca, hücresel hedef angajman değerlendirmek için kullanılabilir diğer teknolojiler vardır. Biz SHP2 fosfatse için alternatifler bir dizi araştırdık ama çabalarımızda son derece yararlı olduğu bu tsay bulduk. Son olarak, bu tahkikat SHP2 enzimatik aktivitesinden bağımsızdır ve bu nedenle küçük moleküllerin bağlama moduna bakılmaksızın değerlendirilmesini ve optimizasyonuna olanak sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu makalenin içeriği ile çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (L.T.' ye), Epstein Aile Vakfı Ödülü (N.D. P. .C.) ve NCI Kanser Merkezi Destek Hibesi P30CA030199 tarafından desteklendi. Ayrıca, bu proje tamamen veya kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Kimyasal Biyoloji Konsorsiyumu Sözleşme No altında Federal fonlar ile finanse edilmiştir. HHSN261200800001E. Bu yayının içeriği, Sağlık ve İnsan Iúletmeleri Bakanlığı' nın görüşlerini veya politikalarını yansıtmadığı gibi, ticari adlardan, ticari ürünlerden veya kuruluşlardan bahsetmek DE ABD Hükümeti tarafından onaylandığı anlamına gelmez. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well gradient equipped thermocycler | Eppendorf AG | X50h | |
| 384-well low dead volume microplate Echo qualified | Beckman Coulter, Inc. | LP-0200 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner Bio-One | 657 160 | Sterile with lid |
| Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | |
| Cell counter | Thermo Fisher Scientific | Countess II FL | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566-016 | 500 mL |
| Echo acoustic liquid handler | Beckman Coulter, Inc. | Echo 550 | |
| Electronic multichannel pipette | Thermo Fisher Scientific | E1 ClipTip | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140-079 | 500 mL |
| HEPES buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630-680 | 100 mL |
| InCell Pulse starter kit | Eurofins DiscoverX Corp. | 94-4007 | Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate |
| Microplate reader | Tecan Trading AG | Spark | |
| Single channel solution trough | Thermo Fisher Scientific | S253012005 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-010 | 100 mM |
| Thermal microplate sealer | Agilent Technologies, Inc. | PlateLoc | |
| Transfection reagents | Polyplus Transfection | jetPRIME | |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| TrypLE Express reagent | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | |
| Twin.tec 384 real-time PCR plates | Eppendorf AG | 30132734 |
References
- Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
- Alonso, A., et al.
- Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).
- Ferguson, F. M., Gray, N. S.
- Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
- Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
- Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
- Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
- Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
- Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
- Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, Academic Press. Amsterdam. 771-809 (2010).
- Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
- Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
- Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
- Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T.
- Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
- Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
- Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
- He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
- Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
- Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
- Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
- Clinical Trial NCT03114319. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019).
- Clinical Trial NCT03634982. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019).
- Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
- LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).
- Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).
- Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
- Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
- McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
- Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
- Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).
