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Cancer Research

SHP2 (PTPN11) द्वारा सेलुलर लक्ष्य सगाई का आकलन फॉस्फेट अवरोधक

Published: July 17, 2020
doi:
10.3791/61457
, , , , ,
1Cancer Metabolism & Signaling Networks Program, NCI-Designated Cancer Center,Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

Summary

अक्षुण्ण कोशिकाओं में उम्मीदवार अवरोधकों द्वारा लक्ष्य सगाई का आकलन करने की क्षमता दवा की खोज के लिए महत्वपूर्ण है । यह प्रोटोकॉल एक 384 अच्छी तरह से प्रारूप सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख का वर्णन करता है जो विश्वसनीय रूप से जंगली प्रकार के SHP2 या इसके ऑन्कोजेनिक वेरिएंट को लक्षित करने वाले अवरोधकों के सेलुलर लक्ष्य सगाई का पता लगाता है।

Abstract

पीटीपीएन11 प्रोटो-ऑन्कोजीन द्वारा एन्कोडेड एसआरसी-होमोलॉजी 2 (एसएच 2) डोमेन युक्त फॉस्फेट 2 (एसएचपी2), रिसेप्टर टायरोसिन काइनेज (आरटीके) संचालित सेल सिग्नलिंग, सेल सर्वाइवल और प्रसार को बढ़ावा देने वाला एक प्रमुख मध्यस्थ है। इसके अलावा, SHP2 को बी और टी सेल सक्रियण को बाधित करने के लिए प्रतिरक्षा जांच बिंदु रिसेप्टर्स द्वारा भर्ती किया जाता है। Aberrant SHP2 समारोह के विकास, प्रगति, और कई कैंसर के मेटास्टेसिस में फंसाया गया है । दरअसल, छोटे अणु SHP2 अवरोधकों ने हाल ही में रास/आरएएफ/ईआरके मार्ग सक्रियण के साथ ठोस ट्यूमर के उपचार के लिए नैदानिक परीक्षणों में प्रवेश किया है, जिसमें कुछ ऑन्कोजेनिक रास म्यूटेशन के साथ ट्यूमर शामिल हैं । हालांकि, SHP2 अवरोधकों का वर्तमान वर्ग SHP2 ऑनकोजेनिक वेरिएंट के खिलाफ प्रभावी नहीं है जो ल्यूकेमिया में अक्सर होते हैं, और विशिष्ट छोटे अणुओं का विकास जो ऑन्कोजेनिक SHP2 को लक्षित करते हैं, वर्तमान अनुसंधान का विषय है। SHP2 जैसे साइटोसोलिक प्रोटीन से जुड़े अधिकांश दवा खोज अभियानों के साथ एक आम समस्या यह है कि प्राथमिक परख है कि ड्राइव रासायनिक खोज अक्सर विट्रो परख में है कि उंमीदवार यौगिकों के सेलुलर लक्ष्य सगाई की रिपोर्ट नहीं करते हैं । सेलुलर लक्ष्य सगाई को मापने के लिए एक मंच प्रदान करने के लिए, हम दोनों जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती SHP2 सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख विकसित की है । ये परख मज़बूती से कोशिकाओं में SHP2 अवरोधकों के लक्ष्य सगाई का पता लगाने । यहां, हम इस परख का एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो SHP2 अवरोधकों के मूल्यांकन और लक्षण वर्णन के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है।

Introduction

1,2कोशिकाओं में सिग्नल ट्रांसडक्शन में टायरोसिन फॉस्फोरिलेशन महत्वपूर्ण भूमिकानिभाताहै । इस पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन को प्रोटीन टायरोसिन किनासेस (पीटीके) द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है और प्रोटीन टायरोसिन फॉस्फेट (पीटीपीएस) द्वारा उलट जाता है। इसलिए , एबरंट पीटीके या पीटीपी कार्य से कई वंशानुगत या अधिग्रहीत मानव रोगहोतेहैं 3 ,4,5,,6. एसआरसी-होमोलॉजी 2 (एसएच 2) डोमेन युक्त फॉस्फेटे 2 (SHP2) एक व्यापक रूप से व्यक्त गैर-रिसेप्टर प्रकार पीटीपी प्रोटो-ऑन्कोजीन PTPN11 77 द्वारा इनकोडेड है और कई शारीरिक प्रक्रियाओं का एक प्रमुख नियामक है जिसमें रास/आरएएफ/ईआरके, PI3K/Akt, या जेएके/स्टेटिंग सिग्नल्समार्ग 88 केसक्रियण द्वारा सिग्नल ट्रांसडक्शन शामिल है । आम तौर पर, SHP2 गतिविधि को गुमराह संकेत को रोकने के लिए कसकर विनियमित किया जाता है। बेसल स्थितियों के तहत SHP2 को इसके एन-टर्मिनल एसएच 2 डोमेन द्वारा ऑटोइनहिबिट किया जाता है, जो उत्प्रेरक फॉस्फेट डोमेन(चित्रा 1A)9,,10के भीतर सक्रिय साइट तक पहुंच को अवरुद्ध करता है। सेल एक्टिवेशन पर, टायरोसिन फॉस्फोरिलेटेड बाइंडिंग प्रोटीन SHP2 की भर्ती करते हैं, जिससे यह अपनी सक्रिय संरचना को अपनाता है, जिसमें सक्रिय साइट अब अपने सब्सट्रेट्स के लिए सुलभ है। कई कैंसर में SHP2 गतिविधि ऊंचा है। पीटीपीएन11 में दैहिक लाभ-कार्य (जीओएफ) म्यूटेशन की पहचान मुख्य रूप से ल्यूकेमिया में की गई है और एन-एसएच 2 डोमेन को फॉस्फेट डोमेन में बाध्यकारी होने से रोकती है, जिसके परिणामस्वरूप 11 सक्रिय SHP2(चित्रा 1B)11का गठन किया गया है। PTPN11 में जर्मलाइन GOF उत्परिवर्तन नोआन सिंड्रोम के ~ 50% मामलों के लिए जिम्मेदार हैं,द्रोह 12के बढ़ते जोखिम के साथ एक विकासात्मक विकार। ठोस ट्यूमर में, जहां PTPN11 उत्परिवर्तन दुर्लभ हैं, फॉस्फोरिलेटेड बाध्यकारी प्रोटीन के अधिक से अधिक स्तर बढ़ाया SHP2 गतिविधि(चित्रा 1C)के लिए नेतृत्व करते हैं । एसएचपी2 प्रतिरक्षा चेकपॉइंट सिग्नलिंग के लिए भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि चेकपॉइंट रिसेप्टर्स जैसे बीटीएलए या पीडी-1 भर्ती एसएचपी 2 प्रमुख सिग्नलिंग अणुओं को डीफोस्फोरलेट करने के लिए, प्रतिरक्षा कोशिका सक्रियण13,14,,15को रोकता है।,

छोटे अणुओं के साथ पीटीपीएस को लक्षित करना एक चुनौती रही है, क्योंकि पीटीपीएस की सक्रिय साइट अत्यधिक संरक्षित और अत्यधिक आवेशित है; सक्रिय स्थल को लक्षित करने वाले अवरोधक अक्सर शक्तिशाली होते हैं, लेकिन खराब चयनशीलता और मौखिक जैव उपलब्धता16, 17,,18,,19,18,20,,,21, 22,प्रदर्शित करतेहैं। दरअसल, कई रिपोर्ट SHP2 अवरोधक गरीब चयनता और कोशिकाओं में प्रभावकारिता की कमी सेपीड़ित 23। हाल ही में, अच्छी शक्ति और उत्कृष्ट चयनशीलता के साथ एसएचपी 2 के एलोस्टेरिक अवरोधकों की सूचना दी गई है (उदाहरण के लिए, एसएचपी0924 और आरएमसी-455025)और एसएचपी 2 अवरोधकों में नए सिरे से रुचि छिड़ गई है। SHP099 और आरएमसी-4550 पर आधारित यौगिक वर्तमान में रिसेप्टर टायरोसिन काइनेज (आरटीके) पाथवे एक्टिवेशन26, 27,27के साथ ठोस ट्यूमर के इलाज के लिए चरण I नैदानिक परीक्षणों में हैं। ग्राउंडब्रेकिंग करते समय, ये यौगिक कई एसएचपी 2 ऑन्कोजेनिक म्यूटेंट के मुकाबले अप्रभावी हैं जो रक्त कैंसर के रोगियों की एक महत्वपूर्ण संख्या में ल्यूकेमोजेनेसिस ड्राइव करते हैं28,29,,30., SHP2 oncogenic वेरिएंट की ओर SHP099 जैसे यौगिकों की शक्ति की यह कमी उनके अद्वितीय एलोस्टेरिक तंत्र से उपजी है, क्योंकि वे निष्क्रिय, बंद संरचना को बाध्यकारी और स्थिर करके SHP2 गतिविधि को रोकते हैं, जो SHP2 म्यूटेंट में बाधित होता है। इसके अलावा, हाल ही में एक रिपोर्ट31के आधार पर, SHP099-जैसे अवरोधकों के साथ इलाज रोगियों में अनुकूली प्रतिरोध तंत्र काफी बोधगम्य हैं । नतीजतन, अगली पीढ़ी के SHP2 अवरोधकों का विकास जो इसके सक्रिय, खुले राज्य को लक्षित करता है, गहन अनुसंधान का विषय है ।

कोशिकाओं में उपन्यास SHP2 अवरोधकों का लक्षण वर्णन नेतृत्व अनुकूलन प्रक्रिया का एक अनिवार्य पहलू है। शारीरिक परिस्थितियों में अवरोधक का गंभीर रूप से, सिद्ध लक्ष्य सगाई आत्मविश्वास का एक अतिरिक्त स्तर प्रदान करती है कि औषधीय रसायन शास्त्र के लिए संसाधनों को कुशल रूप से आशाजनक सेलुलर प्रभावकारिता के साथ यौगिकों पर तैनात किया जाता है। अतीत में, अपने लक्ष्यों के लिए छोटे अणु अवरोधकों के बंधन का आकलन करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं, मुख्य रूप से प्रोटीन किनासेस32के लिए। एक SHP2 सेलुलर लक्ष्य सगाई परख विकसित करने के लिए, हम एक सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख३३का उपयोग किया । यह परख, प्रोटीन34के लिए इन विट्रो थर्मल शिफ्ट (पीटीएस) परख के समान, लक्ष्य प्रोटीन थर्मल स्थिरता पर नज़र रखता है, जिसे आमतौर पर छोटे अणुओं के बाध्यकारी द्वारा बदल दिया जाता है। मूल परख एक कम थ्रूपुट परख है जो लक्षित प्रोटीन के स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करती है। वैकल्पिक रूप से, हमने थर्मल शिफ्ट परख का हाल ही में सूचित संस्करण चुना जो β-गैलेक्टोसिडेस एंजाइम खंड पूरक (ईएफसी) परख(चित्रा 2)35का उपयोग करता है। इन प्रयोगों के लिए, ब्याज का प्रोटीन कोशिकाओं में एन-या सी-टर्मिनल फ्यूजन प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया जाता है जिसमें एक उन्नत प्रोलेबल टैग (ईपीएल, β-गैलेक्टोसिडेस का 42 अमीनो एसिड टुकड़ा) होता है। कोशिकाओं को तब 384-अच्छी तरह से पीसीआर संगत प्लेटों में स्थानांतरित किया जाता है और ब्याज के यौगिकों के साथ इनक्यूबेटेड किया जाता है। एक थर्मोसाइकिलर का उपयोग कोशिकाओं के लिए तापमान ढाल लागू करने के लिए किया जाता है, जिसका प्रोटीन उनकी थर्मल स्थिरता के आधार पर तापमान में वृद्धि के रूप में विकृत और समग्र होगा। एक उम्मीदवार यौगिक की रुचि के प्रोटीन को बांधने और स्थिर करने की क्षमता के परिणामस्वरूप उस प्रोटीन की थर्मल स्थिरता में वृद्धि होगी। इसलिए, कोशिकाओं के लाइसिस के बाद, उन टैग प्रोटीन है कि एक उंमीदवार परिसर द्वारा स्थिर किया गया है वाहन नियंत्रण के साथ इनक्यूबेटेड कोशिकाओं के टैग प्रोटीन की तुलना में उच्च तापमान पर समाधान में रहेगा । रिपोर्टर एंजाइम स्वीकारकर्ता (ईए) घुलनशील ईपीएल-टैग किए गए प्रोटीन को पूरक करने में सक्षम है, जिसके परिणामस्वरूप ल्यूमिनेसेंस सब्सट्रेट का उपयोग करके पता लगाने योग्य β-गैलेक्टोसिडेस गतिविधि होती है।

हमने हाल ही में एक लघुकृत 384-वेल प्रारूप36में जंगली-प्रकार SHP2 (SHP2-WT) और लगातार SHP2 oncogenic संस्करण (SHP2-E76K) के लिए एक मजबूत सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख विकसित की है। यहां, हम इस परख के एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं, जो कोशिकाओं में SHP2 अवरोधकों द्वारा लक्ष्य सगाई का मज़बूती से पता लगाता है और अवरोधक शक्ति और सेलुलर थर्मल शिफ्ट डेटा के बीच उच्च स्तर के सहसंबंध को दर्शाता है। सामान्य परख कार्यप्रवाह चित्र 3में दर्शाया गया है । हमारा प्लेटफ़ॉर्म एन-टर्मिनल टैग पूर्ण लंबाई ईपीएल-SHP2 फ्यूजन प्रोटीन का उपयोग करता है। इसी पीआईसीपी-ईपीएल-एन-एसएचपी2-डब्ल्यूटीई और पीआईसीपी-ईपीएल-एन-एसएचपी2-ई76के एक्सप्रेशन प्लाज्मिड्स की पीढ़ी के लिए कृपया हमारे हालिया प्रकाशन36का उल्लेख करें। इस परख SHP2 थर्मल प्रोफाइल स्थापित करने और उपस्थिति या अवरोधक की अनुपस्थिति में SHP2 पिघलने तापमान निर्धारित करने के लिए एक थर्मल ढाल का उपयोग किया जा सकता है । एक बार थर्मल प्रोफाइल स्थापित हो जाने के बाद, इसे आइसोथेरल परिस्थितियों में भी किया जा सकता है, जिससे अवरोधक खुराक-प्रतिक्रिया मूल्यांकन की अनुमति मिल सकती है। दोनों प्रकार के प्रयोग नीचे वर्णित हैं।

Protocol

1. सेल कल्चर और रिएजेंट्स की तैयारी 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1x एंटीबायोटिक/एंटीमायोटिक, 20 mM HEPES, और 1 मीटर सोडियम पायरुवेट के साथ विकास मीडिया की एक 500 मिलीएल बोतल तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।<…

Representative Results

SHP2-WT के लिए थर्मल ढाल प्रयोग के परिणामस्वरूप एक संकीर्ण पिघलने संक्रमण के साथ एक सिग्मॉयडल सेलुलर थर्मल प्रोफाइल हुआ जो एक मुड़ा हुआ प्रोटीन(चित्र 4 ए)के लिए विशिष्ट और सुसंगत है। SHP2 में तीन स्…

Discussion

हमने एक लक्ष्य सगाई परख प्रस्तुत की है जो कोशिकाओं में SHP2 फॉस्फेटे के लिए छोटे अणुओं के प्रत्यक्ष बाध्यकारी की पुष्टि कर सकती है । परख कम और उच्च आत्मीयता अवरोधकों के बीच भेदभाव कर सकते हैं और, महत्वपूर?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था 1R21CA195422 (एल टी के लिए), एपस्टीन परिवार फाउंडेशन पुरस्कार (एन डी पी.C) और एनसीआई कैंसर सेंटर सपोर्ट ग्रांट P30CA030199। इसके अतिरिक्त, इस परियोजना को पूरे या भाग में राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों से संघीय धन के साथ वित्त पोषित किया गया है, रासायनिक जीव विज्ञान कंसोर्टियम अनुबंध नहीं के तहत । HHSN261200800001E. इस प्रकाशन की सामग्री जरूरी विचारों या स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग के नीतियों को प्रतिबिंबित नहीं करता है, और न ही व्यापार के नाम, वाणिज्यिक उत्पादों, या संगठनों का उल्लेख करता है अमेरिकी सरकार द्वारा समर्थन मतलब है । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है ।

Materials

384-well gradient equipped thermocycler Eppendorf AG X50h
384-well low dead volume microplate Echo qualified Beckman Coulter, Inc. LP-0200
6-well cell culture plates Greiner Bio-One 657 160 Sterile with lid
Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X Thermo Fisher Scientific 15240-062
Cell counter Thermo Fisher Scientific Countess II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 10566-016 500 mL
Echo acoustic liquid handler Beckman Coulter, Inc. Echo 550
Electronic multichannel pipette Thermo Fisher Scientific E1 ClipTip
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 26140-079 500 mL
HEPES buffer Thermo Fisher Scientific 15630-680 100 mL
InCell Pulse starter kit Eurofins DiscoverX Corp. 94-4007 Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate
Microplate reader Tecan Trading AG Spark
Single channel solution trough Thermo Fisher Scientific S253012005
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-010 100 mM
Thermal microplate sealer Agilent Technologies, Inc. PlateLoc
Transfection reagents Polyplus Transfection jetPRIME
Trypan blue Thermo Fisher Scientific T10282
TrypLE Express reagent Thermo Fisher Scientific 12605-010
Twin.tec 384 real-time PCR plates Eppendorf AG 30132734
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References

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Lambert, L. J., Romero, C., Sheffler, D. J., Celeridad, M., Cosford, N. D. P., Tautz, L. Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (161), e61457, doi:10.3791/61457 (2020).
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