Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

יציבות ומבנה של בת גדולה Histocompatibility קומפלקס מחלקה I עם β הטרולוגי2-מיקרוגלובולין

Published: March 10, 2021 doi: 10.3791/61462
Automatic Translation
*1,2, *3,4, *2,5, 1,2, 1,2, 2, 2, 4, 1, 4, 1,2
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Biosafety, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau, 4CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 5Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

הפרוטוקול מתאר שיטות ניסיוניות להשגת תחליפים מורכבים יציבים של היסטו-תאימות (MHC) מסוג I באמצעות β פוטנציאלייםשל 2-microglobulin (β2מ ') החלפות ממינים שונים. ההשוואה המבנית של MHC אני התייצב על ידי הומולוגי הטרולוגי β2מ 'נחקרו.

Abstract

מתחם ההיסטו-תאימות העיקרי (MHC) ממלא תפקיד מרכזי בהצגת פפטיד אנטיגן ותגובות חיסוניות של תאי T נגד מחלות זיהומיות והתפתחות גידולים. MHC היברידית אני מורכב עם β הטרולוגי2-microglobulin (β2מ ') החלפה ממינים שונים ניתן לייצב במבחנה. זהו אמצעי ריאלי ללמוד MHC I של יונקים, כאשר הומולוגי β2מ 'אינו זמין. בינתיים, הוא הצביע על כך β יונקים2מ 'החלפה אינה משפיעה באופן משמעותי על מצגת פפטיד. עם זאת, יש סיכום מוגבל לגבי המתודולוגיה ואת הטכנולוגיה עבור MHC היברידית אני מורכב עם β הטרולוגית2-microglobulin (β2מ '). להלן, מוצגות שיטות להערכת ההיתכנות של החלפה הטרולוגית β2מ 'במחקר MHC I. שיטות אלה כוללות הכנת מבני ביטוי; טיהור גופי ההכללה וכיסוי מחדש של קומפלקס MHC; קביעת תרמו יציבות חלבון; סינון קריסטל וקביעת מבנה. מחקר זה מספק המלצה להבנת תפקוד ומבנה של MHC I, והוא גם משמעותי להערכת תגובת תאי T במהלך מחלות זיהומיות ואימונותרפיה הגידול.

Introduction

קומפלקס ההיסטו-תאימות העיקרי (MHC) קיים בכל בעלי החוליות והוא קבוצה של גנים הקובעים את החסינות בתיווך התא לפתוגנים זיהומיות. MHC Class I מציג פפטידים אנדוגניים, כגון רכיבים ויראליים המיוצרים על זיהום בנגיף, לקולטנים של תאי T (TCR) על פני השטח של תאי CD8+ T כדי לתווך חסינות תאית ולהשתתף בוויסות החיסון1. מחקר מבני של MHC אני מחייב פפטידים מספק מידע לגבי מוטיבים מחייב פפטיד ותכונות מצגת על ידי מולקולות MHC I, אשר ממלא תפקידים חיוניים בהערכת תגובות חיסוניות CD8+ T תא ופיתוח חיסון.

מאז ההתגבשות הראשונה והקביעה המבנית של MHC I מולקולרית על ידי ביורקמן ואח'2, ניתוח מבנה הגביש של מולקולות MHC I קידם מאוד את ההבנה כיצד פפטידים נקשרים למולקולות MHC I, ומסייע להבין את האינטראקציה של שרשראות אור עם שרשראות כבדות ופפטידים. סדרה של מחקרי מעקב הצביעו על כך שלמרות שהגנים המקודדים את שרשרת האור אינם קשורים ל- MHC, שרשרת האור היא חלבון מפתח להרכבת מולקולות MHC I3,4. זה אינטראקציה עם שלושת התחומים של מולקולות מסוג MHC I על משטחים מרובים. כאשר שרשרת האור נעדרת, מולקולות מסוג MHC I אינן יכולות להתבטא כראוי על פני השטח של תאים המציגים אנטיגן ואינן יכולות לקיים אינטראקציה עם TCR כדי להפעיל את הפונקציות החיסוניות שלהן.

MHC I מורכב משרשרת כבדה (שרשרת H) ושרשרת קלה (כלומר, β 2-מיקרוגלובולין (β2מ ')), ומורכב באמצעות כריכה לפפטידמתאים 5. המקטע החוץ-תאי של שרשרת H מורכב מתחומים α1, α2 ו- α36. התחומים α1 ו α2 יוצרים את חריץ מחייב פפטיד (PBG). שרשרת β2מ 'משמשת כקומוניט מבני של מתחם ההרכבה ב- MHC I, מייצבת את הקונפורמציה של המתחם, והיא מלווה מולקולרית עבור שרשרת MHC I H המתקפלת7,8,9. סדרה של מחקרים הראו כי MHC I H שרשראות מיונקים שונים כגון עטלף (כירופטרה) (Ptal-N * 01:01)10, מקוק רזוס (פרימטים) (Mamu-B *17)11 (Mamu-A *01)12 (Mamu-A *02)13, עכבר (מכרסם) (H-2Kd)14,15, כלב (קרניבורה) (DLA-88 * 50801)16, בקר (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 וסוסים (פריסodactyla) (Eqca-N * 00602 ו Eqca-N * 00601)18 יכול לשלב עם β הטרולוגי2מ '(טבלה 1). מולקולות היברידיות אלה משמשות לעתים קרובות במחקרים מבניים ותפקודיים. עם זאת, המתודולוגיה למחקר הפונקציונלי והמבני של ה- MHC I ההיברידי עם βהטרולוגית 2מ 'עדיין לא סוכמה. בינתיים, הבסיס המבני למחלף β 2 מ'ביןמסות שונות עדיין לא ברור.

להלן, ההליך עבור ביטוי MHC אני, refolding, התגבשות, איסוף נתוני קריסטל וקביעת מבנה מסוכמים. בנוסף, תחליפים פוטנציאליים של β2מ 'ממינים שונים מנותחים באמצעות השוואת הקונפורמציה המבנית של MHC אני התייצב על ידי הומולוגית הטרולוגית β2מ '. שיטות אלה יהיה מועיל למחקר מבני נוסף MHC אני CD8+ T תאים תגובה חיסונית הערכה בסרטן ומחלות זיהומיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מבני ביטוי

  1. אחזר את הרצפים של גנים מסוג MHC I (כולל גנים חזויים) מעטלפים ממסד הנתונים של NCBI.
  2. לאחזר רצפי שרשרת כבדים MHC I יונק גבוה יותר מתוך מסד הנתונים פולימורפיזם אימונו (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) ואת מסד הנתונים UniProt (www.uniprot.org).
  3. כדי להשיג קומפלקסים מסיסים MHC, mutagenize הרצפים כדי להסיר את האזורים ציטוסוליים transmembrane.
  4. לשכפל את הגנים קידוד האקטודומאים של העטלף Ptal-N * 01:01 (GenBank לא. KT98792919) (שאריות 1-277) ועטלף β2מטר (GenBank לא. XP_006920478.1) (שאריות 1-98) לווקטורים pET-28a (Novagen, בייג'ינג, סין), בהתאמה.
  5. הוסף את הרצפים הממוטבים (עבור Escherichia coli)שהוכנסו בין אתרי NcoI ו- EcoR1 של וקטור pET-28a שונה.
  6. לבנות פלסמידים ביטוי β2מ 'כפי שתואר קודם לכן20.

2. סינתזת פפטיד

  1. חיזוי פפטידים
    1. כפי שתואר קודם לכן10, כדי לסנן פפטידים שעלולים להיקשר Ptal-N * 01:01, לחזות פפטידים מועמד באמצעות גופי החלבון של וירוסים הקשורים עטלפים הנדרה וירוס (HeV). כדי להשיג פפטידים בעלי זיקה גבוהה המבוססים על המודל המבני מהשרת המקוון, NetMHCpan 4.0 שרת (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 ו Rosetta FlexPepDock22 חזו כריכה פוטנציאלית בשבר פפטיד שנבחר. בנוסף, תוכנות ומאגרי מידע אחרים כולל BIMAS, ניתן להשתמש גם במסד הנתונים של האפיטופים החיסוניים (IEDB), NetCTL 1.2 ו- SYFPEITHI, כולם משלבים חיזוי של פפטיד-MHC מחלקה I מחייב זיקה, טרנספורטר הקשורים לעיבוד אנטיגן (TAP) יעילות תחבורה, מחשוף C-מסוף פרוטאזומלי ומחצית זמן של ניתוק של פפטיד-HLA מחלקה I מולקולות בקריאתם.
    2. כדי לחזות פפטידים בעלי איגוד גבוה, השתמש הן בשרת NetMHCpan והן בשרת Rosetta FlexPepDock.
      הערה: למרבה הצער, אף אחת מהתחזיות המיוצרות לא תאמה את הנתונים הניסיוניים. הדבר עשוי להצביע על כך שתחזיות פפטיד מחייבות MHC הנוכחיות לא היו מתאימות ליונקים שאינם אנושיים ולא עכברים כגון עטלפים, אשר עשויים להיות בעלי אופן שונה של קשירה פפטיד. לכן, אנחנו צריכים לשלב תוכנות חיזוי שונות ותוצאות ניסיוניות לניתוח מקיף כדי להשיג פפטידים זיקה גבוהה.
  2. הכנה ושימור פפטידים
    1. במקום ליצור פפטידים מותאמים אישית, השתמש בספקי שירות מיוחדים. לרכוש את כל הפפטידים מסחרית בעקבות כלי חיזוי פפטיד, אשר יש ציון מחייב גבוה יותר. טוהר הפפטיד נקבע להיות >95% על ידי HPLC וספקטרומטריית מסה.
    2. אחסנו את כל הפפטידים שנרכשו כאבקה מיובשת בהקפאה ב-80°C ומתמוססים בדמתיל סולפוקסיד (DMSO) לפני השימוש.

3. טיהור גופי ההכללה

  1. טרנספורמציה של אי קולי
    1. להפוך 10 ng של פלסמיד המכיל עטלף MHC אני Ptal-N * 01:01 H שרשרת, או אדם β2מ 'או עטלף β2מ 'לתוך 100 μL של BL21(DE3) E. coli. להתרחץ בקרח במשך 30 דקות.
    2. הלם חום ב 42 מעלות צלזיוס במשך 90 s, ואחריו רחצה בקרח במשך 2 דקות.
    3. הוסף 800 μL של מרק lysogeny (LB: תמצית שמרים, tryptone ו NaCl; לראות את הטבלה של חומרים) לשלב 3.1.2 ולנער ב 200 סיבובים לדקה (סל"ד) על פלטפורמת נדנדה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
    4. החל 100 μL של השעיה חיידקית על הצלחת המכילה את ההתנגדות לאנטיביוטיקה המתאימה (ampicillin: 100 ng / mL), אשר זהים מבנים קודמים.
  2. לחסן תרבויות
    1. בחר שיבוט חיידקי אחד שהפך לאחרונה ל-3 מ"ל של LB עם מדיום אנטיביוטי (אפיקילין: 100 ng/mL) ותרבות ב-37 מעלות צלזיוס, תוך טלטול במהירות של 200 סל"ד על פלטפורמת נדנדה להפעלת החיידקים. תרבויות ניתן לחסן מאוחר בלילה, כדי להיות מוכן אינדוקציה למחרת בבוקר.
    2. לילה אחד מראש, להעביר 500 μL של מלאי חיידקים מופעל לתוך 50 מ"ל של LB עם מדיום אנטיביוטי (ampicillin: 100 ng/mL) ואת הדגירה לילה ב 37 °C (69 °F), רועד ב 200 סל"ד. לנוחות בעת הכנת החסן הבא, להקפיא את מלאי חיידקים מופעל הנותרים ב 1 מ"ל aliquots (500 μL של תרבות עם 500 μL של 40% גליצרול) ב -80 מעלות צלזיוס עד ההכנה הבאה יש צורך.
    3. כדי ליצור כמויות גדולות של חלבון רקומביננטי, להעביר את ההכנה החיידקית לתוך 2 L של LB עם מדיום אנטיביוטי (ampicillin: 100 ng/mL) ביחס של 1:100, דגירה ב 37 °C (60 °F) תוך טלטול ב 200 סל"ד. תרבות עד ספיגה של 0.6 ב 600 ננומטר מושגת. הוסף 1 מ"מ איזופרופיל-1-thio-β-D-גלאקטופירנואיד (IPTG) (לשנות את הריכוז של IPTG עבור MHCs שונים, בעיקר בין 0.1 mM-1 mM) לבקבוק עבור אינדוקציה של ביטוי חלבון.
  3. חיידקי קציר
    1. מעבירים את החיידקים לבקבוקי צנטריפוגה וצנטריפוגה ב-5000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. כל השלבים מעתה והלאה צריך להתבצע ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. Resuspend את החיידקים ב 60 מ"ל של מלוחים חיץ פוספט (PBS) ולשחרר את החלבון רקומביננטי לידי ביטוי על ידי משבש תאים קוליים.
      הערה: באופן כללי, התוכנית שהצבנו על מכונה זו היא קולית 6S, מרווח 12S, 300 W, 99 פעמים).
  4. טיהור גופי ההכללה
    1. צנטריפוגה השעיית חיידקים sonicated ב 12,000 x g במשך 30 דקות. השלך את supernatant ו resuspend גלולה בנפח המתאים של מאגר כביסה (0.5% טריטון-100, 50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 מ"מ EDTA, 10 mM DTT). חזור על תהליך זה פעם נוספת.
    2. צנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 10-20 דקות. השלך את supernatant ולהשתיל מחדש את גופי ההכלה במאגר resuspension (50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). הסר דגימת μL 20 (גופי הכללה במאגר לשימוש חוזר) עבור SDS-PAGE כדי לבדוק את הטוהר של גופי הכללה.
    3. צנטריפוגה ההכנה הנותרת ב 12,000 x g במשך 10-20 דקות. השלך את הסופרנט. לשקול את גלולה המכילה את גופי ההכללה ולהוסיף חיץ פירוק (6 M גואה-HCl, 10% גליצרין, 50 מ"מ Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 מ"מ EDTA) לריכוז הסופי של 30 מ"ג / מ"ל. מערבבים לאט באמצעות stirrer מגנטי ב 4 מעלות צלזיוס עד גופי ההכללה מומסים במאגר פירוק.
    4. צנטריפוגה 12,000 x g במשך 10-20 דקות. אחסן את גופי ההכללה ב -20 °C (60 °F) או -80 °C (69 °F).
      הערה: לפני שתמשיך עם טיהור גופי ההכללה, אשר כי האינדוקציה והביטוי של חלבון רקומביננטי הצליחו. הפעל דגימות מכל תרבות (נלקח לפני ואחרי אינדוקציה IPTG) על ג'ל חלבון; 15% SDS-PAGE (מסטיק מרוכז SDS-PAGE: H2O, 30% אקרילאמיד, 1 M Tris-HCl pH 6.8, 10% SDS, 10% APS ו- TEMED; ג'ל הפרדה SDS-PAGE: H2O, 30% אקרילאמיד, 1.5 M Tris-HCl pH 8.8, 10% SDS, 10% APS ו- TEMED; ראה את טבלת החומרים ) עבור β2מ ', 10% SDS-PAGE עבור שרשרת H.

4. תיקון מחדש של קומפלקס MHC

הערה: היעילות של גופי הכללה refolded ישפיע על התשואה של חלבון המתקבל. קיפול מתחרה עם פולמריזציה, ולכן מקובל כי refolding בריכוזי חלבון נמוכים היא השיטה המוצלחת ביותר. במאמר זה, ריכוז גופי ההכללה הוא 30 מ"ג / מ"ל.

  1. הכן מאגר תיקיות חוזרות.
    1. שנה את ההרכב של אגם refolding בהתאם לחלבון. לדוגמה, ה- pH, הכוח היוני, תנאי redox והנוכחות של ליגנדים ישפיעו על תוצאות refolding. הנפוץ ביותר הוא להשתמש במאגרים מבוססי Tris או HEPES ב- pH ניטרלי עם ריכוז NaCl של 50-500 מ"ר, אך הדבר תלוי גם בחלבון היעד. להלן נוסחת מאגר התיקיות מחדש המשמשת במאמר זה.
    2. הכן את המאגר המתקפל עם 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 400 מ"מ L-ארגנין, 2 מ"מ EDTA-2Na.
    3. מצננים את המאגר ל-4 מעלות צלזיוס בבקבוקון של 250-300 מ"ל, ולאחר מכן מוסיפים גלוטתיון מופחת ב-5 מ"מ (GSH) וגלוטתיון מחומצן של 0.5 מ"מ (GSSG). מערבבים לאט בעזרת מערבל מגנטי ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10-20 דקות נוספות לפני הוספת גופי ההכללה והפפטידים.
  2. הזרקה ודילול של שרשרת MHC H β2מ '
    הערה: הטמפרטורה שבה מתבצעת refolding עשוי להשתנות, אם כי בדרך כלל, על מנת למזער את הצבירה, 4 מעלות צלזיוס הוא הטוב ביותר. אנו משתמשים בדילול כדי לספול מחדש את החלבונים.
    1. באמצעות מחט ממזרק 1 מ"ל, להזריק 1 מ"ל של גופי הכללה hβ2מ 'או bβ2גופי הכללה לתוך שני מאגרי refolding (1 ליטר כל אחד), בהתאמה. להזריק ליד מוט ערבוב מסתובב במרץ כדי לקבל דילול מהיר ויעיל. β2מטרים חוזרים בקלות יחסית ונשארים יציבים גם בהיעדר שרשרת H.
    2. לאחר β2מ 'כבר מומס בתמיסת refolding, להמיס פפטידים (5 מ"ג / מ"ל) ב DMSO במהירות להזריק 200 μL לתוך פתרון refolding. מערבבים לאט במשך 10-20 דקות לפני הוספת שרשרת H.
    3. להזריק את שרשרת H עם אותו הליך המתואר לעיל עבור β2מ '. שרשרת H היא מאוד לא יציבה; לכן, סדר ההזרקה הוא די חשוב. להזריק 3 מ"ל של גופי הכללת שרשרת H לשני מאגרי refolding שונים (1 ליטר כל אחד) עם hβ2מ 'או bβ2מ ', בהתאמה. הזרקה רצופה של aliquots קטן במקום היישום היחיד של כל כמות החלבון מגביר את התשואה של MHC refolded. אפשר refolding להמשיך ב 4 מעלות צלזיוס עבור 8-10 שעות.
  3. ריכוז חלבון מפולס
    1. השתמשו בסינון אולטרה-סינון בתא בלחץ עם קרום MMCO של 10 kDa לריכוז חלבוני הקרייה מחדש. שיטה זו נוחה וניתן לשלבה עם חילופי מאגרים. הוסף מאגר החלפה (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl pH 8.0) לתא ולהתרכז לנפח הסופי של 30-50 מ"ל.
    2. להעביר את פתרון refolding לצינור צנטריפוגה, להסתובב ב 12,000 x g במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר משקעים.
    3. בזהירות להעביר את supernatant ולהתרכז עוד יותר לנפח הסופי של ~ 1 מ"ל.
    4. צנטריפוגה ב 12,000 xגרם במשך 10-20 דקות. מעבירים את ה-supernatant לצינור סטרילי ומטהרים את החלבונים באמצעות עמודת אי-הכללה בגודל 10/300 GL.
    5. לאסוף את הדגימות בשיא ולנתח אותם באמצעות SDS-PAGE (15% פוליאקרילאמיד ג'ל).
    6. לאסוף את השיא המורכב MHC ולהתרכז לריכוז הסופי של 15 מ"ג / מ"ל.
    7. לדלל את המתחם ל 7.5 מ"ג / מ"ל ו 15 מ"ג / מ"ל להתגבשות.

5. התגבשות, איסוף ועיבוד נתונים

  1. בצע התגבשות של MHC מורכב ופפטיד באמצעות טכניקת דיפוזיה אדי ישיבה.
  2. הקרין את קומפלקסים Ptal-N*01:01/פפטיד עם ערכות קריסטל מסחריות (למשל, ערכת מסך קריסטל I/II, ערכת מסך אינדקס, ערכת PEGIon I/II וערכת PEGRx).
  3. לאטום את הפתרון וכתוצאה מכך שיווי משקל נגד 100 μL של פתרון המאגר ב 4 או 18 מעלות צלזיוס.
  4. שימו לב לגידול הגביש בתרבות במשך 3 ימים, שבוע, שבועיים, חודש, 3 חודשים ו-6 חודשים. השתמש במיקרוסקופ כדי לראות אם כל טיפה בלוח הגביש יש גבישים.
    הערה: Ptal-N * 01:01 /HeV1(bβ2מ ') גבישים נצפו 0.2 M NaCl, 0.1 M ביס-טריס (pH 5.5), ו 25% (w / v) פוליאתילן גליקול 3,350 בריכוז של 7.5 מ"ג / מ"ל. Ptal-N * 01:01 / HeV1 (hβ2מ ') גבישים נצפו 0.1 M HEPES, pH 7.0, 2% w / v פוליאתילן גליקול 3,350 בריכוז של 7.5 מ"ג / מ"ל.
  5. להגנה קריוגנית, העבירו את הגבישים לתמיסת אחסון המכילה 20% גליצרול ולאחר מכן התקררו במהירות בזרם חנקן גזי של 100 K.
  6. לאסוף נתוני עקיפת רנטגן מקו הקרן BL19U של מתקן קרינת synchrotron שנגחאי (שנגחאי, סין).

6. קביעת מבנה וניתוחים

  1. עם נתונים מבניים ברזולוציה גבוהה, לעבד ולהדרג את עוצמת האוסף באמצעות תוכנית Denzo ואת חבילת התוכנה HKL2000 (https://hkl-xray.com/)23.
  2. לאחר בחירת מודל ראשוני טוב יותר בבנק נתוני החלבון (PDB), קבע את המבנים באמצעות החלפה מולקולרית עם התוכנית Phaser MR ב- CCP424 (http://www.ccp4.ac.uk/). המודל שבו נעשה שימוש היה קואורדינטות המבנה עם קוד בנק נתוני החלבון (PDB) 5F1I.
  3. השתמש במודל הרנטגן המעודן לעידון המפרקים הראשוני. השתמש Phenix לחדד לבד ומצבי המפרקים עבור רנטגן לבד ואת נויטרונים משותף עידון רנטגן, בהתאמה.
  4. לאחר כל סבב של עידון, לבדוק באופן ידני את המודל מול Fo - Fc ו 2Fo - Fc חיובי מפות צפיפות גרעינית ב Coot25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/). זה מקל על המיקום הנכון של מים ואטומי D מסוימים. כל דמויות המבנים נוצרו על ידי PyMOL (http://www.pymol.org/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עבודה קודמת דיווחה כי HeV1 נגזר HeV1 (DFANTFLP) פפטיד הוצג על ידי Ptal-N * 01:0110,19. להלן, הקיבולת מחייבת של פפטיד זה Ptal-N * 01:01 עם עטלף הומולוגי β2מ '(bβ2מ ') ו אנושיהטרולוגי β2m (hβ2m) (איור 1C,1D) הוערך. גבישים ברזולוציה גבוהה יותר נוצרו, בהתאמה (איור 1E,1F). גביש נוצר ממתחם Ptal-N*01:01/HeV1, אשר נוצר באמצעות renaturation עם bβ2מ ', ואת הרזולוציה היא 2.31 Å. גביש נוצר ממתחם Ptal-N*01:01/HeV1, אשר נוצר באמצעות renaturation עם hβ2מ ', ואת הרזולוציה היא 1.6 Å. מתחם Ptal-N*01:01/HeV1 נוצר בהצלחה באמצעות התחדשות עם bβ2m ו- hβ2m(איור 1C,1D). בהקשר זה, הראינו כי מתחם Ptal-N*01:01/HeV1 לא נוצר ללא נוכחותם של β2מטרים (איור 1A)וה- H-2Kd המתקפלים כראוי דרך hβ2m (איור 1B).

המבנים של Ptal-N * 01:01 / HeV1 / bβ2m ו Ptal-N * 01:01 / HeV1 / hβ2מ 'נותחו לאחר מכן. במבנה Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2מ', שאריות R3, H31, Q34, D53, W60, Y63 של bβ2m מאוגד שאריות שרשרת H דרך החלק התחתון של PBG ושאריות Q8, Y10, R12, N24, Y28, N98, N99 מאוגד לתחום α3 של שרשרת H. בדומה למתחם Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2מ', במתחם Ptal-N*01:01/HeV1/hβמבנה של 2מ', שאריות שמורות H31, D53, W60, Y63 של hβ2מ 'אשר תואמים bβ2מ ', יצר קשר עם החלק התחתון של PBG ושימור שאריות Q8, Y10, R12, N24 אשר תואמים bβ2m מאוגד α3 תחום (איור 2A,2B).

במבנים הכוללים Ptal-N * 01:01 / HeV1 / bβ2מ 'ו Ptal-N * 01:01 / HeV1 / hβ2מ ', סטיית השורש-ממוצעת-ריבוע הממוצעת (RMSD) של שאריות 1-184 של שרשראות H (היוצרות את α1α2 PBG) הייתה 0.248 תחת כל סופרפוזיציית האטומיםC α (איור 3A). ממצא זה הצביע על כך שאין הבדל בין שני מתחמים אלה. ההתאמות של פפטידים דומים במתחמים עם β שונים2מ 'הושוו אז. מבנה יישור הפפטיד הראה כי ההתאמות של פפטידים HeV1 בשני מתחמים אלה היו די דומות (איור 3B). בנוסף, המבנים של gp33 (KAVYNFATM) שהוצגו על ידי H-2Db ומורכבים עם העכבר β2m (mβ2m) או hβ2מ 'היו מיושרים. RMSD של α1α2 PBG של H-2Db היה 0.283 ואת ההתאמות הכוללות של פפטידים בשני מבנים אלה היו גם דומים (איור 3C,3D). נתונים אלה מצביעים עלכךβ 2 מ 'החלפהביןbβ 2 m ו hβ2מ ', ו mβ2m ו hβ2מ 'אינם משפיעים על ההתאמות של פפטידים שהוצגו.

יישור רצף הראה כי חומצות האמינו של β2מ 'ממינים שונים שמורים מאוד (איור 4). לאחר ניתוח של β2מ 'ממינים שונים הראו כי רוב חומצות האמינו של β2מ 'שיצרו את קשרי המימן עם שרשרת H של MHC אני נשמרו (איור 4, לוח 2). בינתיים, השאריות המגוונות היו גם חומצות אמינו בעלות תכונות כימיות דומות ביונקים. עם זאת, שאריות המפתח המעורבות β2מ 'מחייב לשרשרת H של MHC הראיתי פולימורפיזם בתרנגולות, דגים ודו-חיים(איור 4).

טבלה 1: היונקים השונים משתלבים עם β הטרולוגיים2מ '. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: אינטראקציות קשר מימן בין β הטרולוגית2מ 'ושרשרת כבדה ב- MHC I ממינים שונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Figure 1
איור 1: טיהור החלבונים המורכבים של Ptal-N*01:01/HeV1 המסיסים והתצלומים של הגביש המשמשים לניתוח עקיפה. M הוא סמני משקל מולקולריים ב- kDa. P1 הוא אגרגטים. P2 הוא מתחם MHC. P3 הוא β2m.(A)Ptal-N * 01:01 / HeV1 קומפלקס לא נוצר ללא נוכחות של β2מ'. (B)H-2Kd קומפלקס נוצר באמצעות renaturation עם hβ2m. (C) Ptal-N * 01:01 / HeV1 קומפלקס נוצר באמצעות renaturation עם bβ2m. הפרופיל מסומן במיקומים המשוערים של תקני המסה המולקולרית של 75.0, 44.0 ו- 13.7 kDa. (ד) Ptal-N * 01:01 / HeV1 קומפלקס נוצר באמצעות renaturation עם hβ2m. (E) הגביש נוצר מ Ptal-N * 01:01 / HeV1 קומפלקס, אשר נוצר באמצעות renaturation עם bβ 2מ '. החץ השחור מייצג את הגביש המשמש לאיסוף נתונים במהלך עקיפת קרני רנטגן. (ו)הקריסטל נוצר ממתחם Ptal-N*01:01/HeV1 אשר נוצר באמצעות renaturation עם hβ2מ '. החץ השחור מייצג את הגביש המשמש לאיסוף נתונים במהלך עקיפת קרני רנטגן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מימן מליטהביןβ 2 מ ' ושרשרת כבדה במתחמי MHC I היברידיים. מימן מליטהביןβ 2 מ ' ו H שרשרת ב (A) Ptal-N * 01:01 / bβ2m / HeV1 ו (B) Ptal-N * 01:01 / hβ2m / HeV1 MHC מתחמים. אינטראקציות קשר מימן מיוצגות על ידי קו מנוקד שחור. הריבוע מייצג את האזור המוגדל ומוצג מימין בתיבות הצבעוניות המתאימות. האדום מייצג כי homologous β2מ 'ואת β הטרולוגית2מ 'להשתמש באותן חומצות אמינו כדי ליצור קשרי מימן עם שרשרת H. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: התאמה דומה של קומפלקס MHC ופפטידים אנטיגניים במתחמי MHC I היברידיים. (A) הסופרפוזיציה של תחומי α1α2 של Ptal-N * 01:01 / bβ2מטר (ירוק) ו Ptal-N * 01:01 / hβ2מ ' (אפור). (B) הסופרפוזיציה של פפטיד HeV1 עם סופרפוזיציה של תחום α1α2 של כל מולקולת Ptal-N * 01:01. HeV1 פפטיד מיוצג כמו ורוד Ptal-N * 01:01 /bβ2מ 'וצהוב ב Ptal-N * 01:01/hβ2מ '.(ג)הסופרפוזיציה של תחומי α1α2 של H-2Db /mouse β2מטר (mβ2מ ') (ירוק) ו H-2Db / hβ2m (אפור). (D) הסופרפוזיציה של פפטיד gp33 עם סופרפוזיציה של תחום α1α2 של כל מולקולת H-2Db. פפטיד gp33 מיוצג כחול H-2Db / mβ2מ 'ורוד H-2Db / hβ2מ '. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 4
איור 4: יישור רצף מבוסס מבנה של hβ2m עם β2מ 'של מינים אחרים. החצים השחורים מציינים גדילי β. השאריות המודגשות באדום שמורות לחלוטין, והשאריות בקופסאות כחולות הן מאוד (>80%) שמור. המשולשים הצהובים מייצגים את חומצות האמינו העיקריות לאינטראקציה בין βשרשראות 2מ ' ו- H. יישור הרצף נוצר באמצעות Clustal X32 ו- ESPript33. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בניית קומפלקס חלבונים היברידי באמצעות החלפה הטרולוגית ממסה שונה היא אסטרטגיה נפוצה לחקירות תפקודיות ומבניות כאשר המתחם ההומולוגי אינו זמין, כגון ב- MHC I ובליגנדים שלו. עם זאת, יש סיכום מוגבל לגבי המתודולוגיה והטכנולוגיה. להלן, המבנה של בת MHC אני, Ptal-N * 01:01, התייצב על ידי bβ2m או hβ2מ 'נותח. חומצות האמינו העיקריות של β2מ 'מחייב Ptal-N * 01:01 נמצאו שמורים בין עטלף לאדם. לאחר ניתוח נוסף, שאריות המפתח המעורבות β2מ 'מחייבים לשרשרת H של MHC נמצאה שמורה ביונקים אך פולימורפית בתרנגולות, דגים ודו-חיים. נתונים אלה מצביעים על כך שהחלפה הטרולוגית של β2מ ' היא אמצעי ריאלי שבאמצעותו ניתן לחקור את ה- MHC I של היונקים. עם זאת, החלפה בין יונקים לציפורים, דגים או דו-חיים אינה אפשרית.

מחקרים מבניים ממלאים תפקיד מרכזי בהבנת המנגנונים המולקולריים של מצגת פפטיד על ידי מולקולות MHC I. הטרולוגית β2מ 'החלפה משמשת בדרך כלל במחקרים מבניים MHC I14,16,17,18,26,27,28. עבודה קודמת הראתה כי בקר MHC אני, N * 01801, מורין β2מ 'ו שור β2מ 'התנהג באופן דומה במהלך קשירה לתחומי α1α2 של N * 01801 H שרשרת17. כאן, המבנה של פפטיד יחיד שהוצג על ידי אותה שרשרת H של MHC אני אבל שונה β2מ 'נותח. נתונים אלה מראים כי ההתאמות של פפטיד דומות כאשר התייצבו על ידי מסה צולבת β 2 מ ', ובכך מצביעים עלכךβ הטרולוגית 2 מ 'החלפה אינה משפיעה עלמצגתפפטיד.

אנטיגן פפטידים שהוצגו על ידי MHC אני מוכרים על ידי TCR לתווך הפעלת תא T29. במהלך זיהום ויראלי, הערכה של תגובות חיסוניות תאי T ספציפיות לאנטיגן תשפר מאוד את ההבנה של זיהומים ויראליים ותארח תגובות חיסוניות. טטרמר פפטיד-MHC היא טכניקה חשובה להערכת תגובות תאי T; זוהי טכניקה כדי tetramerize מולקולת מונומר MHC, לשפר את הזיקה שלה, ולשלב אותו עם TCRS מרובים על תאי T. Tetramers נמצאים בשימוש נרחב במחקר ואבחון קליני14,29,30. לאחרונה, תאי TCR מהונדסים (TCR-T) הפכו לנושא חם באימונותרפיה של הגידולים בשל יעילותם הפוטנציאלית בטיפול בגידולים ממאירים31. כתמי טטרמר MHC I היא שיטה חיונית להקרנת TCR ספציפי מחייב פפטידים אנטיגן הקשורות לסרטן שהוצגו על ידי MHC אני מולקולות29. לכן, הכנת טטרמר MHC אני ממלא תפקיד חיוני בהקרנת TCR. בנוסף לכריכה של שרשרת MHC I H, β2מ 'נקשר גם ל- CD8 על משטח תא T, מה שעלול להוביל לכתמים לא ספציפיים במהלך הקרנת TCR על ידי כתמי טטרמר MHC I. הטרולוגית β2מ 'החלפה עשוי להקטין את האיגוד הלא ספציפי הזה של טטרמר MHC I.

עם זאת, קיימות מספר מגבלות לפרוטוקול. ראשית, למרות ש- E. coli נשאר מארח הביטוי הדומיננטי לחלבונים רקומביננטיים, לא ניתן לבצע שינויים רבים לאחר התרגום ומוצרי החלבון המובעים יוצרים גופי הכללה בלתי מסיסים. לאחר מכן, בשל החלפה דומה של כמה שאינם יונקים β2מ 'עם יונקים β2מ ', לא ידוע אם β שאינם יונקים2מ 'יכול להיות מוחלף על ידי β הטרולוגית2מ 'כדי לסייע ולייצב את מבנה MHC שלהם. בפרוטוקול, כללנו תיאור על הניתוחים המנוסים שלנו באמצעות שרת NetMHCpan ו Rosetta FlexPepDock. למרבה הצער, אף אחת מהתחזיות לא הניבה תחזיות התואמות לנתונים הניסיוניים. הדבר עשוי להצביע על כך שתחזיות פפטיד מחייבות MHC הנוכחיות לא היו מתאימות ליונקים שאינם אנושיים ולא עכברים כגון עטלפים, אשר עשויים להיות בעלי אופן שונה של קשירה פפטיד. לכן, אנחנו צריכים לשלב תוכנות חיזוי שונות ותוצאות ניסיוניות לניתוח מקיף כדי להשיג פפטידים זיקה גבוהה.

בפרוטוקול המתואר כאן, השלב העיקרי הוא שניתן לשחזר את ה- MHC כראוי. חשוב מאוד להשיג קומפלקס MHC עם יעילות refolding גבוהה. לכן, חשוב לשים לב לבחור פפטידים מתאימים ולהגדיל את הטוהר של גופי הכללה.

לסיכום, בזאת מסוכם פרוטוקול עבור ביטוי MHC I, refolding, התגבשות, איסוף נתוני קריסטל וקביעת מבנה. יתר על כן, ההיתכנות של תחליפי β2מ 'הטרולוגיים במחקר MHC אני נותח. מחקר זה מספק התייחסות קולית להבנת MHC I במחקרים מבניים ותפקודיים. בנוסף, נתונים אלה משמעותיים גם להערכת תגובות תאי T במהלך מחלות זיהומיות ואימונותרפיה של גידולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין על מה להצהיר.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הפתוחה של מעבדת מפתח המדינה של ביוטכנולוגיה פרמצבטית, אוניברסיטת נאן-ג'ינג, סין (גרנט לא. KF-GN-201905), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענקים 81971501). ויליאם ג'יי ליו נתמך על ידי תוכנית המדען הצעיר המצוינת של NSFC (81822040) ובייג'ינג תוכנית כוכב חדש של מדע וטכנולוגיה (Z181100006218080).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 kDa MMCO membrane Merck millipore PLGC07610
30% Acrylamide LABLEAD A3291-500ml*5
5×Protein SDS Loading Novoprotein PM099-01A
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff Merck millipore UFC901096
Ampicillin Inalco 1758-9314
APS Sigma A3678-100G
BL21(DE3) strain TIANGEN CB105-02
DMSO MP 219605580 Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
DTT Solarbio D1070 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
EDTA-2Na KeyGEN BioTECH KGT515500
Glycerin HUSHI 10010618
GSH Amresco 0399-250G
GSSG Amresco 0524-100G
Guanidine hydrochloride Amresco E424-5KG
hβ2m our lab Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).
IPTG Inalco 1758-1400
L-Arginine Hydrochloride Amresco 0877-5KG
NaCl Solarbio S8210
Protein Marker Fermentas 26614
SDS Boao Rui Jing A112130
Superdex Increase 200 10/300 GL GE Healthcare 28990944
TEMED Thermo 17919 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.
Tris-HCl Amresco 0497-5KG
Triton X-100 Bioruler RH30056-100mL
Tryptone Oxoid LP0042
Yeast extract Oxoid LP0021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
  2. Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).
  3. Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).
  4. Zijlstra, M., et al. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).
  5. Gao, G. F., et al. Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2. Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).
  6. Bjorkman, P. J., Parham, P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules. Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).
  7. Achour, A., et al. Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin. Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).
  8. Kubota, K. Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture. Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).
  9. Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells. Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).
  10. Lu, D., et al. Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats. PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).
  11. Wu, Y., et al. Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus. Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).
  12. Chu, F., et al. First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape. Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).
  13. Liu, J., et al. Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus. Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).
  14. Liu, W. J., et al. Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC. Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).
  15. Mitaksov, V., Fremont, D. H. Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).
  16. Xiao, J., et al. Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I. Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).
  17. Li, X., et al. Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides. Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).
  18. Yao, S., et al. Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles. Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).
  19. Wynne, J. W., et al. Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule. Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).
  20. Zhang, S., et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).
  21. Hoof, I., et al. NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).
  22. Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors. PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).
  23. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  24. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, Pt 5 905-921 (1998).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  26. Glithero, A., et al. Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity. Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).
  27. Tungatt, K., et al. Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig. PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).
  28. McCoy, W. H. t, Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox. PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).
  29. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  30. Zhao, M., et al. Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses. mBio. 9 (4), (2018).
  31. Zhao, L., Cao, Y. J. Engineered T cell therapy for cancer in the clinic. Search Results. 10, 2250 (2019).
  32. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
  33. Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 169 מולקולות גדולות של קומפלקס אנטיגן היסטו-תאימות (MHC) β 2-מיקרוגלובולין (β2מ ') מבנה מורכב פפטיד TCR טטרמר
יציבות ומבנה של בת גדולה Histocompatibility קומפלקס מחלקה I עם β הטרולוגי<sub>2</sub>-מיקרוגלובולין
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, D., Liu, K., Lu, D., Wang,… More

Zhang, D., Liu, K., Lu, D., Wang, P., Zhang, Q., Liu, P., Zhao, Y., Chai, Y., Lyu, J., Qi, J., Liu, W. J. Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous β2-Microglobulin. J. Vis. Exp. (169), e61462, doi:10.3791/61462 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter