Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Stabilitet og struktur av Bat Major Histocompatibility Complex klasse I med heterologøse β2-Microglobulin

Published: March 10, 2021 doi: 10.3791/61462
Automatic Translation
*1,2, *3,4, *2,5, 1,2, 1,2, 2, 2, 4, 1, 4, 1,2
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Biosafety, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau, 4CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 5Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Protokollen beskriver eksperimentelle metoder for å oppnå stabile store histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I gjennom potensielle β 2-mikroglobulin (β2m) substitusjoner fra forskjellige arter. Den strukturelle sammenligningen av MHC I stabilisert av homolog og heterolog β2m ble undersøkt.

Abstract

Det store histokompatibilitetskomplekset (MHC) spiller en avgjørende rolle i antigenpeptidpresentasjon og T-celle immunresponser mot smittsom sykdom og tumorutvikling. Hybrid MHC I kompleks med heterolog β2-microglobulin (β2m) substitusjon fra forskjellige arter kan stabiliseres in vitro. Dette er et mulig middel for å studere MHC I av pattedyr, når homologe β2m ikke er tilgjengelig. I mellomtiden er det indikert at β2m substitusjon ikke påvirker peptidpresentasjonen betydelig. Det er imidlertid begrenset oppsummering av metodikken og teknologien for hybrid MHC I kompleks med heterolog β2-microglobulin (β2m). Her presenteres metoder for å evaluere muligheten for heterolog β2m substitusjon i MHC I-studien. Disse metodene inkluderer utarbeidelse av uttrykkskonstruksjoner; rensing av inklusjonsorganer og refolding av MHC-komplekset; bestemmelse av protein termobilitet; krystall screening og struktur bestemmelse. Denne studien gir en anbefaling for å forstå funksjon og struktur av MHC I, og er også viktig for T celle respons evaluering under smittsom sykdom og tumor immunterapi.

Introduction

Det store histokompatibilitetskomplekset (MHC) finnes i alle virveldyr og er et sett med gener som bestemmer den cellemedierte immuniteten mot smittsomme patogener. MHC klasse I presenterer endogene peptider, for eksempel viruskomponenter produsert ved virusinfeksjon, til T cellereseptorer (TCR) på overflaten av CD8+ T-celler for å megle cellulær immunitet og delta i immunregulering1. En strukturell studie av MHC I binding til peptider gir informasjon om peptidbindende motiver og presentasjonsfunksjoner av MHC I molekyler, som spiller viktige roller i evalueringen av CD8+ T celle immunresponser og vaksineutvikling.

Siden den første krystalliseringen og strukturelle bestemmelsen av MHC I molekylær av Bjorkman et al. 2 , har krystallstrukturanalysen av MHCI-molekyleri stor grad fremmet forståelsen av hvordan peptider binder seg til MHC I molekyler, og bidrar til å forstå samspillet mellom lette kjeder med tunge kjeder og peptider. En rekke oppfølgingsstudier indikerte at selv om genene som koder lyskjeden ikke er forbundet med MHC, er lyskjeden et viktig protein for montering av MHCI-molekyler 3,4. Den samhandler med de tre domenene i MHC klasse I molekyler på flere overflater. Når lyskjeden er fraværende, kan mhc klasse I molekyler ikke uttrykkes riktig på overflaten av antigen-presentere celler og kan ikke samhandle med TCR for å utøve sine immunologiske funksjoner.

MHC I består av et tungt kjede (H-kjede) og lett kjede (f.eks. β2-mikroglobulin (β2m)), og monteres gjennom binding til et egnet peptid5. Det ekstracellulære segmentet av H-kjeden består av α1-, α2- og α3-domener6. α1- og α2-domenene danner peptidbindingssporet (PBG). Den β2m kjeden fungerer som en strukturell underenhet av monteringskomplekset i MHC I, stabiliserer konformasjonen av komplekset, og er en molekylær chaperone for MHC I H kjede folding7,8,9. En rekke studier har vist at MHC I H kjeder fra ulike pattedyr som (Chiroptera) (Ptal-N * 01:01)10, rhesus macaque (Primates) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, mus (Rodentia) (H-2Kd)14,15, hund (Carnivora) (DLA-88 * 50801)16, storfe (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 og equine (Perissod (Eqca-N*00602 og Eqca-N*00601)18 kan kombineres med heterolog β2m (tabell 1). Disse hybridmolekylene brukes ofte i strukturelle og funksjonelle studier. Metoden for den funksjonelle og strukturelle studien av hybrid MHC I med heterologøse β2m er imidlertid ennå ikke oppsummert. Samtidig er det strukturelle grunnlaget for det omskiftede β2m mellom ulike taxa fortsatt uklart.

Heri oppsummeres prosedyren for MHC I-uttrykk, refolding, krystallisering, krystalldatainnsamling og strukturbestemmelse. I tillegg analyseres potensielle substitusjoner på β2m fra forskjellige arter gjennom å sammenligne den strukturelle konformasjonen av MHC I stabilisert av homolog og heterolog β2m. Disse metodene vil være nyttige for videre MHC I strukturell studie og CD8+ T celle immunrespons evaluering i kreft og smittsomme sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av uttrykk konstruerer

  1. Hent sekvensene av MHC klasse I gener (inkludert spådde gener) fra fra NCBI-databasen.
  2. Hent høyere pattedyr MHC I tunge kjedesekvenser fra Immuno Polymorphism Database (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) og UniProt-databasen (www.uniprot.org).
  3. For å oppnå løselige MHC-komplekser muterer du sekvensene for å fjerne de cytosoliske og transmembraneområdene.
  4. Klone genene koding ectodomains av Ptal-N * 01: 01 (GenBank nr. KT98792919) (rester 1–277) og β2m (GenBank nr. XP_006920478.1) (rester 1–98) i pET-28a vektorer (henholdsvis Novagen, Beijing, Kina).
  5. Sett inn de optimaliserte sekvensene (for Escherichia coli)mellom NcoI- og EcoR1-områdene til en modifisert pET-28a-vektor.
  6. Konstruere menneskelige β2m uttrykk plasmider som tidligere beskrevet20.

2. Peptidsyntese

  1. Peptider prediksjon
    1. Som beskrevet tidligere10, for å screene for peptider som kan binde seg til Ptal-N * 01: 01, forutsi kandidat peptider ved hjelp av protein organer av bat-relaterte virus hendra virus (HeV). For å få høy affinitet peptider basert på den strukturelle modellen fra den elektroniske serveren, NetMHCpan 4.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 og Rosetta FlexPepDock22 spådd potensiell binding i den valgte peptid brøkdelen. I tillegg kan annen programvare og databaser, inkludert BIMAS, Immun epitopdatabasen (IEDB), NetCTL 1.2 og SYFPEITHI kan også brukes, alle integrerer prediksjon av peptid-MHC klasse I bindende affinitet, transportør forbundet med antigenbehandling (TAP) transporteffektivitet, proteasomal C-terminal cleavage og halvtid for dissosiasjon av peptid-HLA klasse I molekyler i sine avlesninger.
    2. Hvis du vil forutsi høybindende peptider, bruker du både NetMHCpan- og Rosetta FlexPepDock-serveren.
      MERK: Dessverre, verken produsert spådommer matchet eksperimentelle data. Dette kan tyde på at gjeldende MHC bindende peptidsforutsigelse ikke var egnet for ikke-menneskelige og ikke-mus pattedyr som, som kan ha en annen måte peptid binding. Derfor må vi kombinere ulike prediksjonsprogramvare og eksperimentelle resultater for omfattende analyse for å oppnå høy affinitetspeptider.
  2. Peptider forberedelse og bevaring
    1. I stedet for å generere tilpassede peptider, bruk spesialiserte tjenesteleverandører. Kjøp alle peptider kommersielt etter peptid prediksjon verktøy, som har en høyere bindende score. Peptid renhet ble fastslått å være > 95% av HPLC og massespektrometri.
    2. Oppbevar alle kjøpte peptider som frysetørket pulver ved -80 °C og oppløses i dimetylsulfoksid (DMSO) før bruk.

3. Rensing av inklusjonsorganer

  1. Transformasjon av E. coli
    1. Forvandle 10 ng av plasmid som inneholder MHC I Ptal-N * 01: 01 H kjede, eller menneskelig β2m eller β2m i 100 μL bl21 (DE3) E. coli. Bad i is i 30 min.
    2. Varmesjokk ved 42 °C i 90 s, etterfulgt av bading i is i 2 min.
    3. Tilsett 800 μL lysogeny buljong (LB: gjærekstrakt, tryptone og NaCl; se Materialstabell ) til trinn 3.1.2 og rist ved 200 rotasjoner per minutt (rpm) på en gyngeplattform ved 37 ° C i 20 min.
    4. Påfør 100 μL bakteriell suspensjon på platen som inneholder tilsvarende antibiotikaresistens (ampicillin: 100 ng / ml), som er de samme som tidligere konstruksjoner.
  2. Inokulere kulturer
    1. Velg en enkelt nylig forvandlet bakteriell klone til 3 ml LB med antibiotika medium (ampicillin: 100 ng / ml) og kultur ved 37 ° C, mens risting på 200 rpm på en gyngeplattform for å aktivere bakteriene. Kulturer kan inokuleres sent på kvelden, for å være klar for induksjon neste morgen.
    2. En natt i forveien, overføre 500 μL av aktivert bakteriell lager i 50 ml LB med antibiotika medium (ampicillin: 100 ng / ml) og inkubere over natten ved 37 ° C, risting ved 200 rpm. For enkelhets skyld ved fremstilling av neste inokulering, frys gjenværende aktiverte bakteriebestanden i 1 ml aliquots (500 μL kultur med 500 μL på 40% glyserol) ved −80 °C til neste preparat er nødvendig.
    3. For å generere store mengder rekombinant protein, overfør bakteriepreparatet til 2 L LB med antibiotikamedium (ampicillin: 100 ng /ml) i forholdet 1:100, inkuber ved 37 °C mens du rister ved 200 o/min. Kultur til en absorbans på 0,6 ved 600 nm oppnås. Tilsett 1 mM isopropyl-1-thio-β-D-galaktopyranoside (IPTG) (variere konsentrasjonen av IPTG for forskjellige MHCer, for det meste mellom 0,1 mM-1 mM) til kolben for induksjon av proteinuttrykk.
  3. Høste bakterier
    1. Overfør bakteriene til sentrifugeflasker og sentrifuge ved 5000 x g i 20 min ved 4 °C. Alle trinn fra nå av bør utføres ved 4 °C.
    2. Resuspend bakteriene i 60 ml fosfat buffer saltvann (PBS) og frigjøre uttrykt rekombinant protein av ultralyd celle disruptor.
      MERK: Generelt er programmet vi satt på denne maskinen ultralyd 6S, intervall 12S, 300 W, 99 ganger).
  4. Rensing av inklusjonsorganer
    1. Sentrifuger den sonikerte bakterielle suspensjonen ved 12 000 x g i 30 min. Kast den supernaturlige og resuspend pellet i et passende volum av vaskebuffer (0,5% Triton-100, 50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Gjenta denne prosessen igjen.
    2. Sentrifuge på 12.000 x g i 10–20 min. Kast det overnaturlige og gjenopplivingsorganet i resuspensjonsbufferen (50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Fjern en 20 μL prøve (inklusjonsorganer i resuspensjonsbuffer) for SDS-PAGE for å teste renheten av inklusjonsorganer.
    3. Sentrifuge gjenværende forberedelse på 12.000 x g i 10-20 min. Kast det overnaturlige. Vei pelleten som inneholder inklusjonslegemene og tilsett oppløsningsbuffer (6 M Gua-HCl, 10% glyserin, 50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA) til en endelig konsentrasjon på 30 mg / ml. Rør langsomt ved hjelp av en magnetisk røre ved 4 °C til inklusjonslegemene er oppløst i oppløsningsbufferen.
    4. Sentrifuge 12 000 x g i 10–20 min. Kast utfellingene. Oppbevar inklusjonslegemene ved −20 °C eller −80 °C.
      MERK: Før du fortsetter med rensing av inklusjonsorganer, må du kontrollere at induksjon og uttrykk for rekombinant protein var vellykket. Kjør prøver fra hver kultur (tatt før og etter IPTG induksjon) på en proteingel; 15% SDS-PAGE (SDS-PAGE konsentrert tyggegummi: H2O, 30% akrylamid, 1 M Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 10% APS og TEMED; SDS-PAGE separasjon gel: H2O, 30% akrylamid, 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 10% SDS, 10% APS og TEMED; se Materialstabellen ) for de β2m, 10 % SDS-PAGE for H-kjeden.

4. Refolding av MHC kompleks

MERK: Effektiviteten av inklusjonsorganer som er omgangslet, vil påvirke utbyttet av protein oppnådd. Folding konkurrerer med polymerisering, så det er allment akseptert at bretting ved lave proteinkonsentrasjoner er den mest vellykkede metoden. I dette papiret er konsentrasjonen av inklusjonsorganer 30 mg/ml.

  1. Klargjør buffer for ommappe.
    1. Varier sammensetningen av refolding bufferen avhengig av proteinet. For eksempel vil pH, ionisk styrke, redoksforhold og tilstedeværelsen av ligandene påvirke refoldingresultatene. Den vanligste er å bruke Tris eller HEPES-baserte buffere ved en nøytral pH med NaCl-konsentrasjonen på 50-500 mM, men dette avhenger også av målproteinet. Følgende er bufferformelen som brukes i denne artikkelen.
    2. Forbered foldebufferen med 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 400 mM L-arginin, 2 mM EDTA-2Na.
    3. Avkjøl bufferen til 4 °C i en 250–300 ml kolbe, og tilsett deretter 5 mM redusert glutation (GSH) og 0,5 mM oksidert glutation (GSSG). Rør langsomt ved hjelp av en magnetisk røre ved 4 °C i ytterligere 10–20 min før du tilsetter inklusjonslegemer og peptider.
  2. Injeksjon og fortynning av MHC H kjede og β2m
    MERK: Temperaturen som refolding utføres kan variere, men generelt, for å minimere aggregering, er 4 °C best. Vi bruker fortynning for å omfolde proteinene.
    1. Bruk en nål fra en 1 ml sprøyte, injiser 1 ml hβ2m inklusjonslegemer eller bβ2m inklusjonslegemer i to refolding buffere (1 liter hver), henholdsvis. Injiser nær den kraftig roterende omrøringsstangen for å oppnå rask og effektiv fortynning. β2m omfolder relativt enkelt og forblir stabil selv i fravær av H-kjeden.
    2. Etter at β2m er oppløst i refoldingsoppløsning, oppløs peptider (5 mg/ml) i DMSO og injiser raskt 200 μL i refoldingsoppløsningen. Rør langsomt i 10–20 min før du tilsetter H-kjedet.
    3. Injiser H-kjedet med samme prosedyre som er beskrevet ovenfor i β2m. H-kjeden er svært ustabil; Derfor er injeksjonsrekkefølgen ganske viktig. Injiser 3 ml H kjedeinkluderingsorganer i to forskjellige refolding buffere (1 liter hver) med hβ2m eller bβ2m, henholdsvis. Den påfølgende injeksjonen av små aliquots i stedet for den enkle anvendelsen av hele mengden protein øker utbyttet av refolded MHC. La omleggingen fortsette ved 4 °C i 8–10 timer.
  3. Konsentrasjon av refolded protein
    1. Bruk ultrafiltrering i et trykkkammer med 10 kDa MMCO membran for konsentrasjon av refolding proteiner. Denne metoden er praktisk og kan kombineres med bufferutveksling. Legg til utvekslingsbuffer (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl pH 8.0) i kammeret og konsentrer til et endelig volum på 30–50 ml.
    2. Overfør refoldingsløsningen til et sentrifugerør, spinn på 12 000 x g i 15 min ved 4 °C for å fjerne bunnspisser.
    3. Overfør forsiktig det overnaturlige og konsentrer deg videre til et endelig volum på ~ 1 ml.
    4. Sentrifuge på 12.000 xg i 10–20 min. Overfør supernatanten til et sterilt rør og rens proteinene ved hjelp av en 10/300 GL størrelse-ekskludering kolonne.
    5. Samle prøvene på toppen og analysere dem ved hjelp av SDS-PAGE (15% polyakrylamid gel).
    6. Samle MHC kompleks topp og konsentrere seg til en endelig konsentrasjon på 15 mg / ml.
    7. Fortynn komplekset til 7,5 mg/ml og 15 mg/ml for krystallisering.

5. Krystallisering, datainnsamling og behandling

  1. Utfør krystallisering av kompleks MHC og peptid ved hjelp av sittedråpedampdiffusjonsteknikken.
  2. Screen Ptal-N* 01: 01 / peptid komplekser med kommersielle krystall kits (f.eks Crystal Screen kit I / II, Index Screen kit, PEGIon kit I / II, og PEGRx kit).
  3. Forsegle den resulterende oppløsningen og likevekten mot 100 μL reservoaroppløsning ved 4 eller 18 °C.
  4. Observere krystallveksten i kulturen i 3 dager, 1 uke, 2 uker, 1 måned, 3 måneder og 6 måneder. Bruk et mikroskop for å se om hver dråpe i krystallplaten har krystaller.
    MERK: Ptal-N*01:01/HeV1(bβ2m) krystaller ble observert i 0,2 M NaCl, 0,1 M Bis-Tris (pH 5,5) og 25 % (w/v) polyetylenglykol 3350 med en konsentrasjon på 7,5 mg/ml. Ptal-N*01:01/HeV1(hβ2m) krystaller ble observert i 0,1 M HEPES, pH 7,0, 2 % w/v polyetylenglykol 3350 i en konsentrasjon på 7,5 mg/ml.
  5. For kryogen beskyttelse, overfør krystallene til en lagringsløsning som inneholder 20% glyserol og deretter avkjøles raskt i en 100 K gassholdig nitrogenstrøm.
  6. Samle røntgendiffraksjonsdata fra strålelinjen BL19U av Shanghai synchrotron stråling anlegget (Shanghai, Kina).

6. Strukturbestemmelse og analyser

  1. Med høy oppløsning strukturelle data, behandle og skalere styrken av samlingen ved hjelp av Denzo programmet og HKL2000 programvarepakke (https://hkl-xray.com/)23.
  2. Etter å ha valgt en bedre innledende modell i Protein Data Bank (PDB), bestemme strukturer ved hjelp av molekylær erstatning med programmet Phaser MR i CCP424 (http://www.ccp4.ac.uk/). Modellen som ble brukt var strukturkoordinatene med Protein Data Bank (PDB) kode 5F1I.
  3. Bruk den raffinerte røntgenmodellen for den første fellesraffinementet. Bruk Phenix avgrense alene og felles moduser for røntgen alene og felles nøytron og røntgen raffinement, henholdsvis.
  4. Etter hver runde med raffinement, manuelt sjekke modellen mot Fo − Fc og 2Fo − Fc positive kjernefysiske tetthet kart i Coot25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/). Dette forenkler riktig plassering av vann og visse D atomer. Alle strukturer ble opprettet av PyMOL (http://www.pymol.org/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tidligere arbeid rapporterte at HeV-avledet HeV1 (DFANTFLP) peptid ble presentert av Ptal-N * 01:0110,19. Heri ble bindingskapasiteten til dette peptidet til Ptal-N*01:01 med homolog β2m (bβ2m) og heterolog human β2m(hβ2m) (figur 1C,1D)evaluert. Krystaller med høyere oppløsning ble dannet, henholdsvis (figur 1E,1F). En krystall er dannet fra Ptal-N * 01: 01 / HeV1 kompleks, som ble dannet gjennom renning med bβ2m, og oppløsningen er 2,31 Å. En krystall er dannet fra Ptal-N * 01: 01 / HeV1 kompleks, som ble dannet gjennom renning med hβ2m, og oppløsningen er 1,6 Å. Ptal-N*01:01/HeV1-komplekset ble vellykket dannet gjennom renning med både bβ2m og hβ2m (figur 1C,1D). I denne sammenheng viste vi at Ptal-N*01:01/HeV1-komplekset ikke ble dannet uten tilstedeværelse av β2m (figur 1A) og H-2Kd som brettes riktig gjennom hβ2m (figur 1B).

Strukturene til Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m og Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m ble deretter analysert. I Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m struktur, rester R3, H31, Q34, D53, W60, Y63 av bβ 2 mbundettil H kjederester gjennom bunnen av PBG og rester Q8, Y10, R12, N24, Y28, N98, N99 bundet til α3-domenet til H-kjeden. I likhet med Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m kompleks, i Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m struktur, bevarte rester H31, D53, W60, Y63 av hβ2m som tilsvarer bβ2m, kom i kontakt med bunnen av PBG og bevarte rester Q8, Y10, R12, N24 som tilsvarer bβ 2 mbundettil α3-domene (figur 2A,2B).

I de samlede strukturene Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m og Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m, gjennomsnittlig rot-gjennomsnittlig-kvadratavvik (RMSD) av rester 1–184 av H-kjedene (danner α1α2 PBG) var 0,248 under alle Cα atomer superposisjon (figur 3A). Dette funnet indikerte at det ikke var noen forskjell mellom disse to kompleksene. Konformasjonene til lignende peptider i kompleksene med forskjellige β2m ble deretter sammenlignet. Strukturen av peptid justering viste at konformasjonene av HeV1 peptider i disse to kompleksene var ganske lik (Figur 3B). I tillegg ble strukturene til gp33(KAVYNFATM) presentert av H-2Db og kompleks med mus β2m (mβ2m) eller hβ2m justert. RMSD av α1α2 PBG av H-2Db var 0,283 og de generelle konformasjonene av peptider i disse to strukturene var også like (figur 3C,3D). Disse dataene indikerer at β2m substitusjon mellom bβ2m og hβ2m, og mβ2m og hβ2m ikke påvirker konformasjonene av presenterte peptider.

Sekvensjustering viste at aminosyrene på β2m fra forskjellige arter er svært bevart (figur 4). Etter analyse av β2m fra forskjellige arter viste at de fleste aminosyrene på β2m som dannet hydrogenbindingene med H-kjeden av MHC ble jeg bevart (figur 4, tabell 2). I mellomtiden var de forskjellige rester også aminosyrer med lignende kjemiske egenskaper hos pattedyr. Men de viktigste rester involvert i β2m binding til H kjeden av MHC jeg viste polymorfimer i kyllinger, fisk og amfibier (Figur 4).

Tabell 1: De ulike pattedyrene kombineres med heterologøse β2m. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Hydrogenbindingsinteraksjoner mellom heterologøse β2m og tung kjede i MHC I av ulike arter. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Figure 1
Figur 1: Rensing av løselige og refolded Ptal-N * 01: 01 / HeV1 komplekse proteiner og fotografier av krystallen som brukes til diffraksjon analyse. M er molekylærvektmarkører i kDa. P1 er aggregatene. P2 er MHC-komplekset. P3 er β2m. (A) Ptal-N * 01: 01 / HeV1 komplekset ble ikke dannet uten tilstedeværelse av β2m. (B) H-2Kd komplekset ble dannet gjennom renning med hβ2m. (C) Ptal-N * 01: 01 / HeV1 kompleks ble dannet gjennom renning med bβ2m. Profilen er merket med de omtrentlige posisjonene til de molekylære massestandardene på 75,0, 44,0 og 13,7 kDa. (D)Ptal-N*01:01/ HeV1-komplekset ble dannet gjennom renning med hβ2m. (E) Krystallen er dannet fra Ptal-N*01:01/HeV1 kompleks, som ble dannet gjennom renning med bβ2m. Den svarte pilen representerer krystallen som brukes til å samle inn data under røntgendiffraksjon. (F)Krystallen er dannet fra Ptal-N * 01: 01 / HeV1 kompleks som ble dannet gjennom renning med hβ2m. Den svarte pilen representerer krystallen som brukes til å samle inn data under røntgendiffraksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Hydrogenbinding mellom β2m og tung kjede i hybrid MHC I-komplekser. Hydrogenbinding mellom β2m og H kjede i (A) Ptal-N*01:01/bβ2m/HeV1 og (B) Ptal-N*01:01/hβ2m/HeV1 MHC komplekser. Hydrogenbindingsinteraksjoner representeres av en svart stiplet linje. Firkanten representerer området zoomet inn og vist til høyre i de tilsvarende fargede boksene. Den røde representerer at homologe β2m og heterologen β2m bruker de samme aminosyrene til å danne hydrogenbindinger med H-kjeden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Lignende konformasjon av MHC-komplekset og de antigene peptidene i hybride MHC I-komplekser. (A)Overleggelsen av α1α2-domener av Ptal-N*01:01/bβ2m (grønn) og Ptal-N*01:01/hβ2m (grå). (B)Superposisjonen av HeV1 peptid med overimposition av α1α2 domene av hvert Ptal-N * 01: 01 molekyl. HeV1 Peptide er representert som rosa i Ptal-N*01:01/bβ2m og som gul i Ptal-N*01:01/hβ2m. (C) Superimposisjon av α1α2-domener av H-2Db /mus β2m (mβ2m) (grønn) og H-2Db /hβ2m (grå). (D)Superposisjonen av gp33 peptid med overimposition av α1α2 domene av hvert H-2Db molekyl. Peptid gp33 er representert som blå i H-2Db /mβ2m og som rosa i H-2Db /hβ2m. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Strukturbasert sekvensjustering av hβ2m med β2m av andre arter. De svarte pilene betegner β-tråder. Rester uthevet i rødt er helt bevart, og rester i blå bokser er svært (> 80%) Bevart. De gule trekantene representerer de viktigste aminosyrene for samspillet mellom de β2m og H-kjedene. Sekvensjusteringen ble generert ved hjelp av Clustal X32 og ESPript33. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Byggingen av et hybridproteinkompleks gjennom heterologisk substitusjon fra ulike taxa er en vanlig strategi for funksjonelle og strukturelle undersøkelser når homologkomplekset ikke er tilgjengelig, for eksempel i MHC I og dets ligandes. Det er imidlertid begrenset oppsummering av metodikken og teknologien. Heri ble strukturen til MHC I, Ptal-N*01:01, stabilisert av bβ2m eller hβ2m analysert. De viktigste aminosyrene til β2m binding til Ptal-N * 01: 01 ble funnet å være bevart mellom og menneske. Ved videre analyse ble nøkkelrester involvert i β2m binding til H-kjeden av MHC jeg funnet å være bevart i pattedyr, men polymorfe hos kyllinger, fisk og amfibier. Disse dataene indikerer at heterolog β2m substitusjon er et mulig middel for å studere MHC I av pattedyr. Det kan imidlertid hende at det ikke er mulig å erstatte pattedyr og fugler, fisk eller amfibier.

Strukturelle studier spiller avgjørende roller i å forstå molekylære mekanismer for peptid presentasjon av MHC I molekyler. Heterologous β2m substitusjon brukes ofte i MHC I strukturellestudier 14,16,17,18,26,27,28. Tidligere arbeid har vist at i storfe MHC I, N * 01801, murine β2m og storfe β2m oppførte seg på samme måte under binding til α1α2 domener av N * 01801 H kjeden17. Heri ble strukturen til et enkelt peptid presentert av samme H-kjede av MHC I, men forskjellige β2m analysert. Disse dataene viser at konformasjonene av peptid er like når stabilisert av cross-taxa β2m, og dermed indikerer at heterolog β2m substitusjon ikke påvirker peptid presentasjon.

Antigenpeptider presentert av MHC I gjenkjennes av TCR for å megle T celleaktivering29. Under virusinfeksjon vil evaluering av antigenspesifikke T-celle immunresponser i stor grad forbedre forståelsen av virusinfeksjoner og være vert for immunresponser. Peptid-MHC tetramer er en viktig teknikk for å evaluere T celleresponser; Det er en teknikk for å tetramerize MHC monomer molekylet, forbedre sin affinitet, og kombinere den med flere TCRS på T-celler. Tetramers er mye brukt i forskning og klinisk diagnose14,29,30. Nylig har TCR-konstruerte T-celler (TCR-T) blitt et hett tema i tumorimmunterapi for deres potensielle effekt ved behandling av ondartede svulster31. MHC I tetramer farging er en viktig metode for screening spesifikke TCR binding til kreft-relaterte antigen peptider presentert av MHC Imolekyler 29. Derfor spiller MHC I tetramerforberedelse en viktig rolle i TCR-screening. I tillegg til binding av MHC I H-kjeden, binder β2m seg også til CD8 på T-celleoverflaten, noe som kan føre til ikke-spesifikk farging under TCR-screening av MHC I tetramerfarging. Heterologisk β2m substitusjon kan redusere denne ikke-spesifikke bindingen av MHC I tetramer.

Det er imidlertid noen begrensninger i protokollen. For det første, selv om E. coli fortsatt er den dominerende uttrykksverten for rekombinante proteiner, kan mange endringer etter oversettelse ikke utføres, og de uttrykte proteinproduktene danner uoppløselige inklusjonsorganer. Deretter, på grunn av lignende substitusjon av noen ikke-pattedyr β2m med pattedyr β2m, er det ikke kjent om ikke-pattedyr β2m kan erstattes av heterologøse β2m for å hjelpe og stabilisere mhc-strukturen. I protokollen har vi tatt med en beskrivelse av våre prøvde analyser ved hjelp av både NetMHCpan og Rosetta FlexPepDock-serveren. Dessverre, ingen produsert spådommer matchet eksperimentelle data. Dette kan tyde på at gjeldende MHC bindende peptidsforutsigelse ikke var egnet for ikke-menneskelige og ikke-mus pattedyr som, som kan ha en annen måte peptid binding. Derfor må vi kombinere ulike prediksjonsprogramvare og eksperimentelle resultater for omfattende analyse for å oppnå høy affinitetspeptider.

I protokollen som er beskrevet her, er hovedtrinnet at MHC kan renatureres riktig. Det er svært viktig å få et MHC-kompleks med høy oppbrettingseffektivitet. Derfor er det viktig å være oppmerksom på å velge passende peptider og øke renheten av inklusjonsorganer.

Til slutt oppsummeres heri en protokoll for MHC I-uttrykk, omfolding, krystallisering, krystalldatainnsamling og strukturbestemmelse. Videre ble muligheten for heterolog β2m substitusjon i MHC I-studien analysert. Denne studien gir en god referanse for å forstå MHC I i strukturelle og funksjonelle studier. I tillegg er disse dataene også signifikante for evaluering av T-celleresponser under smittsom sykdom og tumorimmunterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å erklære.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av det åpne fondet for statlige viktige laboratorier for farmasøytisk bioteknologi, Nan-jing University, Kina (Grant no. KF-GN-201905), National Natural Science Foundation of China (bevilgninger 81971501). William J. Liu støttes av Excellent Young Scientist Program fra NSFC (81822040) og Beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 kDa MMCO membrane Merck millipore PLGC07610
30% Acrylamide LABLEAD A3291-500ml*5
5×Protein SDS Loading Novoprotein PM099-01A
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff Merck millipore UFC901096
Ampicillin Inalco 1758-9314
APS Sigma A3678-100G
BL21(DE3) strain TIANGEN CB105-02
DMSO MP 219605580 Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
DTT Solarbio D1070 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
EDTA-2Na KeyGEN BioTECH KGT515500
Glycerin HUSHI 10010618
GSH Amresco 0399-250G
GSSG Amresco 0524-100G
Guanidine hydrochloride Amresco E424-5KG
hβ2m our lab Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).
IPTG Inalco 1758-1400
L-Arginine Hydrochloride Amresco 0877-5KG
NaCl Solarbio S8210
Protein Marker Fermentas 26614
SDS Boao Rui Jing A112130
Superdex Increase 200 10/300 GL GE Healthcare 28990944
TEMED Thermo 17919 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.
Tris-HCl Amresco 0497-5KG
Triton X-100 Bioruler RH30056-100mL
Tryptone Oxoid LP0042
Yeast extract Oxoid LP0021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
  2. Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).
  3. Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).
  4. Zijlstra, M., et al. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).
  5. Gao, G. F., et al. Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2. Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).
  6. Bjorkman, P. J., Parham, P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules. Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).
  7. Achour, A., et al. Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin. Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).
  8. Kubota, K. Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture. Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).
  9. Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells. Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).
  10. Lu, D., et al. Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats. PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).
  11. Wu, Y., et al. Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus. Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).
  12. Chu, F., et al. First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape. Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).
  13. Liu, J., et al. Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus. Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).
  14. Liu, W. J., et al. Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC. Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).
  15. Mitaksov, V., Fremont, D. H. Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).
  16. Xiao, J., et al. Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I. Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).
  17. Li, X., et al. Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides. Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).
  18. Yao, S., et al. Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles. Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).
  19. Wynne, J. W., et al. Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule. Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).
  20. Zhang, S., et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).
  21. Hoof, I., et al. NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).
  22. Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors. PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).
  23. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  24. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, Pt 5 905-921 (1998).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  26. Glithero, A., et al. Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity. Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).
  27. Tungatt, K., et al. Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig. PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).
  28. McCoy, W. H. t, Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox. PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).
  29. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  30. Zhao, M., et al. Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses. mBio. 9 (4), (2018).
  31. Zhao, L., Cao, Y. J. Engineered T cell therapy for cancer in the clinic. Search Results. 10, 2250 (2019).
  32. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
  33. Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).

Tags

Immunologi og infeksjon Major histokompatibilitet antigen kompleks (MHC) klasse I molekyler β 2-microglobulin (β2m) kompleks struktur peptid TCR tetramer
Stabilitet og struktur av Bat Major Histocompatibility Complex klasse I med heterologøse β<sub>2</sub>-Microglobulin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, D., Liu, K., Lu, D., Wang,… More

Zhang, D., Liu, K., Lu, D., Wang, P., Zhang, Q., Liu, P., Zhao, Y., Chai, Y., Lyu, J., Qi, J., Liu, W. J. Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous β2-Microglobulin. J. Vis. Exp. (169), e61462, doi:10.3791/61462 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter