Summary
이 프로토콜은 다른 종으로부터 잠재적 인 β2-microglobulin (β2m)대체를 통해 안정적인 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 클래스 I를 얻는 실험 방법을 설명합니다. 동종 β2m에의해 안정화된 MHC I의 구조적 비교가 조사되었다.
Abstract
주요 조직 적합성 복합체(MHC)는 전염병 및 종양 발달에 대한 항원 펩타이드 프리젠테이션 및 T 세포 면역 반응에서 중추적인 역할을 한다. 이종β2-마이크로글로불린(β2m)으로복합된 하이브리드 MHC는 체외에서 안정화될 수 있다. 이것은 동종 β2m를사용할 수 없을 때 포유류의 MHC I를 연구하는 가능한 수단입니다. 한편, 포유류 β2m대체가 펩타이드 프리젠테이션에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 그러나, 이종성 β 2-마이크로글로불린(β2m)으로복합된 하이브리드 MHC에 대한 방법론 및기술에 관한 요약이 제한되어 있다. 본명, 이종성의 타당성을 평가하는 방법은 MHC에서2m치환β 연구가 제시된다. 이러한 메서드에는 식 구문 준비가 포함됩니다. 포함 체의 정화 및 MHC 복합체의 재접기; 단백질 열안정성의 결정; 크리스탈 스크리닝 및 구조 결정. 본 연구는 MHC I의 기능 및 구조를 이해하기 위한 권장 사항을 제공하며, 또한 전염병 및 종양 면역 요법 중 T 세포 반응 평가를 위해 유의하다.
Introduction
주요 조직 적합성 복합체 (MHC)는 모든 척추 동물에 존재하며 전염성 병원체에 대한 세포 매개 면역을 결정하는 유전자 세트입니다. MHC 클래스 I는 바이러스 감염시 생성된 바이러스 성분과 같은 내인성 펩티드를CD8+ T 세포 표면에 T 세포 수용체(TCR)에 제시하여 세포 면역을 중재하고 면역 조절1에참여한다. 펩티드에 결합하는 MHC I의 구조 연구는 CD8+ T 세포 면역 반응 및 백신 개발의 평가에 중요한 역할을 하는 MHC I 분자에 의한 펩티드 결합 모티프 및 프리젠테이션 기능에 관한 정보를 제공합니다.
BJorkman 외2에의한 MHC I 분자의 첫 번째 결정화 및 구조적 결정 이후, MHC I 분자의 결정 구조 분석은 펩티드가 MHC I 분자에 결합하는 방법에 대한 이해를 크게 촉진하고, 무거운 사슬 및 펩티드와 광사슬의 상호 작용을 이해하는 데 도움이 된다. 일련의 후속 연구는 광 사슬을 코딩하는 유전자가 MHC와 관련이 없지만, 광 사슬은 MHC I 분자3,4의조립을 위한 핵심 단백질임을 나타냈다. 그것은 여러 표면에 MHC 클래스 I 분자의 세 가지 도메인과 상호 작용. 광사슬이 없을 때, MHC 급 I 분자는 항원 제시 세포의 표면에 정확하게 표현될 수 없고 그들의 면역 기능을 발휘하기 위하여 TCR과 상호 작용할 수 없습니다.
MHC I는 중형 체인(H 체인)과 라이트 체인(즉,β 2-마이크로글로불린(β2m)으로구성되며, 적합한 펩타이드5에결합하여 조립된다. H 사슬의 세포외 세그먼트는 α1, α2 및 α3 도메인6로구성됩니다. α1 및 α2 도메인은 펩타이드 결합 홈(PBG)을 형성한다. β2m체인은 MHC I내 조립 단지의 구조적 서브유닛으로서 작용하여 복합체의 변형을 안정화하고, MHC I H 체인 접이식7,8,9에대한 분자 샤페론이다. 일련의 연구에 따르면 MHC I H 체인은 박쥐(Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10,레서스 마카크(영장류) (마무-B*17)11 (마무-A*01)12 (마무-A*02)13,마우스(로드엔티아)13,마우스(로드텐티아) 2K(14-14) 등 다양한 포유류로부터체인을 보였다.5,개 (카니보라) (DLA-88 *50801)16,가축 (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 및 말 (페리소다실라) (Eqca-N * 00602 및 Eqca-N * 00601)18 그는 18 과 결합 할 수있습니다.β...2.1. 이 하이브리드 분자는 종종 구조적 및 기능적 연구에서 사용됩니다. 그러나, 이종성 β2m를가진 하이브리드 MHC I의 기능및 구조 연구를 위한 방법론은 아직 요약되지 않는다. 한편, 서로 다른 택시 사이의 β2m의구조적 기반은 불분명합니다.
본명, MHC I 발현, 재접이식, 결정화, 결정데이터 수집 및 구조 결정에 대한 절차가 요약된다. 또한, 상이한 종으로부터β 2m의잠재적 대체는 동종 및 이종β2m에의해 안정화된 MHC I의 구조적 형성을 비교하여 분석된다. 이러한 방법은 암 및 전염병에서 추가 MHC I 구조 연구 및 CD8+ T 세포 면역 반응 평가에 도움이 될 것입니다.
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Protocol
1. 식 구문 준비
- NCBI 데이터베이스에서 박쥐에서 MHC 클래스 I 유전자(예측 유전자 포함)의 서열을 검색합니다.
- 면역 다형성 데이터베이스(ipD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) 및 UniProt 데이터베이스(www.uniprot.org)로부터 더 높은 포유류 MHC I 헤비 체인 서열을 검색합니다.
- 수용성 MHC 복합체를 얻으려면 서열을 돌연변이하여 세포및 막 횡단 영역을 제거합니다.
- 박쥐 Ptal-N*01:01의 자궁 도메인을 코딩하는 유전자를 복제합니다(GenBank No. KT987929 19)(잔여물 1~277개) 및 방망이 β2m(젠뱅크No. XP_006920478.1) (잔여물 1-98)를 pET-28a 벡터(노바겐, 베이징, 중국)로 각각
- 최적화된(대장균용)서열을 수정된 pET-28a 벡터의 NcoI 및 EcoR1 부위 사이에 삽입하였다.
- 이전에설명된바와 같이 인간 β2m발현 플라스미드를 구성한다.
2. 펩타이드 합성
- 펩타이드 예측
- 앞서 설명된 바와 같이10,Ptal-N*01:01에 결합할 수 있는 펩티드를 선별하고, 박쥐 관련 바이러스 헨드라 바이러스(HeV)의 단백질 바디를 사용하여 후보 펩티드를 예측한다. 온라인 서버로부터 구조 모델에 기초하여 높은 친화성 펩티드를 얻기 위해 NetMHCpan 4.0 서버(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/) 및 로제타플렉스펩독(22)은 선택한 펩티드 분획에서 잠재적 인 결합을 예측하였다. 또한 BIMAS를 포함한 기타 소프트웨어 및 데이터베이스, 면역 에피토프 데이터베이스(IEDB), NetCTL 1.2 및 SYFPEITHI는 펩타이드-MHC 급 I 결합 친화성, 항원 처리(TAP) 수송 효율, 프테아소말 C 단자 분열 및 펩타이드-HLA 등급의 전파의 반시간 의 예측을 통합하여 사용할 수 있다.
- 고결합 펩티드를 예측하려면 NetMHCpan 과 로제타 플렉스펩독 서버를 모두 사용하십시오.
참고: 불행히도, 생성된 예측도 실험 데이터와 일치하지 않습니다. 이는 현재 MHC 결합 펩티드 예측이 박쥐와 같은 비인간 및 비마우스 포유동물에 적합하지 않았으며, 이는 펩타이드 결합의 다른 방식을 가질 수 있음을 나타낼 수 있다. 따라서, 우리는 높은 친화성 펩티드를 얻기 위해 포괄적 인 분석을위한 다양한 예측 소프트웨어와 실험 결과를 결합해야합니다.
- 펩타이드 제제 및 보존
- 사용자 지정 펩티드를 생성하는 대신 전문 서비스 공급자를 사용합니다. 더 높은 결합 점수를 가진 펩티드 예측 도구에 따라 상업적으로 모든 펩티드를 구입하십시오. 펩티드 순도는 HPLC 및 질량 분석법에 의해 >95%로 결정되었다.
- 구입한 모든 펩티드를 -80°C에서 동결 건조 분말로 저장하고 사용하기 전에 디메틸 설산화물(DMSO)에 용해하십시오.
3. 포함 기관의 정화
- 대장균의 변신
- 박쥐 MHC I Ptal-N*01:01 H 체인을 함유한 플라스미드의 10ng 또는 인간 β2m또는 박쥐 β 2m~ BL21(DE3) 대장균의 100 μL로2m를 변환한다. 30 분 동안 얼음에 목욕.
- 90s42°C에서 열 충격, 2분 동안 얼음으로 목욕.
- 리소제니 국물 800 μL을 추가 (LB: 효모 추출물, 트립폰 및 NaCl; 재료의 테이블을참조) 단계 3.1.2 단계와 20 분 동안 37 °C에서 흔들 플랫폼에 분당 200 회전 (rpm)에서 흔들어.
- 100 μL의 세균현탁액을 해당 항생제 내성(ampicillin: 100 ng/mL)을 함유하는 플레이트에 적용하여 이전 구조와 동일합니다.
- 접종 문화
- 최근 변형된 단일 세균클을 항생제 배지(ampicillin: 100 ng/mL)로 LB3mL로 선택하고 37°C에서 배양하고, 흔들리는 플랫폼에서 200rpm에서 흔들어 박테리아를 활성화시킨다. 문화는 늦은 밤에 접종 할 수 있습니다, 다음 아침에 유도에 대한 준비가 될 수 있습니다.
- 1박 전에, 활성세균육의 500 μL을 항생제 배지(암피실린: 100 ng/mL)로 LB50mL로 옮기고, 37°C에서 하룻밤 동안 배양하여 200rpm에서 흔들어 보세요. 다음 접종을 준비할 때 편의를 위해, 나머지 활성세균육을 1mL 알리쿼트(글리세롤 500μL의 500μL)에서 -80°C에서 동결하여 다음 준비가 필요할 때까지 동결한다.
- 다량의 재조합 단백질을 생성하기 위해 세균 제제를 항생제 배지(암피실린: 100 ng/mL)를 1:100의 비율로 LB 2L로 옮기고, 200 rpm에서 흔들면서 37°C에서 배양한다. 600 nm에서 0.6의 흡수성이 달성 될 때까지 배양. 단백질 발현의 유도를 위해 mM isopropyl-1-티오-β-D-갈라크토피라노사이드(IPTG)를 추가합니다(주로 0.1 mMM-1 mM 사이) 다른 MhC에 대한 IPTG의 농도를 변화시다.
- 수확 박테리아
- 박테리아를 원심분리기 병및 원심분리기로 5000 x g에서 4°C에서 20분 동안 옮긴다. 지금부터 모든 단계는 4 °C에서 수행되어야한다.
- 인산염 완충식염(PBS)의 60mL에서 박테리아를 재중단시키고 초음파 세포 파괴기에 의해 발현된 재조합 단백질을 해방한다.
참고 : 일반적으로,이 기계에 설정 한 프로그램은 초음파 6S, 간격 12S, 300 W, 99 번입니다.)
- 포함 기관의 정화
- 30 분 동안 12,000 x g에서 초음파 세균 현탁액원심을 제거합니다. 상체를 버리고 적절한 세척 버퍼 (0.5 % Triton-100, 50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10mM DTT)의 적절한 볼륨으로 펠릿을 재연하십시오. 이 프로세스를 다시 한 번 반복합니다.
- 10-20 분 동안 12,000 x g의 원심 분리기. 상체를 폐기하고 재서스펜션 버퍼(50m Tris pH 8.0, 100mM NaCl, 10mM EDTA, 10mM DTT)에서 포함 된 바디를 다시 중단하십시오. SDS-PAGE에 대한 20 μL 샘플(재서스펜션 버퍼에 포함된 바디)을 제거하여 포함 바디의 순도를 테스트합니다.
- 10-20 분 동안 12,000 x g에서 나머지 준비원심분리기. 상부체를 폐기합니다. 포함 된 몸을 포함하는 펠릿의 무게를 측정하고 용해 버퍼 (6 M 과-HCl, 10 % 글리세린, 50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10mM EDTA)를 30 mg /mL의 최종 농도로 추가합니다. 4°C에서 자기 교반기로 천천히 저어서 포함 된 몸이 용해 버퍼에 용해 될 때까지 저어줍니다.
- 원심분리기 12,000 x g10-20분 동안 침전을 버리십시오. 포함 바디를 -20°C 또는 -80°C에 저장합니다.
참고: 포함 기관의 정화를 진행하기 전에 재조합 단백질의 유도 및 발현이 성공적이었음을 확인하십시오. 단백질 젤에 각 배양(IPTG 유도 전후 촬영)에서 샘플을 실행; 15% SDS-PAGE (SDS-PAGE 농축 껌: H2O, 30% 아크릴아미드, 1 M Tris-HCl pH 6.8, 10% SDS, 10% APS 및 TEMED; SDS-PAGE 분리 젤: H2O, 30% 아크릴아미드, 1.5 M Tris-HCl pH 8.8, 10% SDS, 10% APS 및 TEMED; H 체인의 β2m,10% SDS-PAGE의 경우 재료 표)를 참조하십시오.
4. MHC 단지의 재접이식
참고: 재접힌 포함 신체의 효율은 얻은 단백질의 수율에 영향을 미칩니다. 접는 중합과 경쟁하므로 일반적으로 낮은 단백질 농도에서 재접이는 것이 가장 성공적인 방법이라는 것이 허용됩니다. 이 논문에서 포함 체 농도는 30 mg/mL입니다.
- 다시 접는 버퍼를 준비합니다.
- 단백질에 따라 재접이식 버퍼의 조성물을 다릅니다. 예를 들어, pH, 이온 강도, 레독스 조건 및 리간드의 존재는 재접기 결과에 영향을 미칩니다. 가장 일반적인 50-500 mMMM의 NaCl 농도와 중성 pH에서 Tris 또는 HEPES 기반 버퍼를 사용 하 여, 하지만 이것은 또한 대상 단백질에 따라 달라 집니다. 다음은 이 문서에서 사용되는 재폴딩 버퍼 수식입니다.
- 100m Tris-HCl pH 8.0, 400mM L-아르기닌, 2mM EDTA-2Na로 접이식 버퍼를 준비한다.
- 버퍼를 250-300 mL 플라스크에서 4°C로 냉각한 다음 5mM 감소글루타티온(GSH) 및 0.5mM 산화 글루타티온(GSSG)을 추가합니다. 포함 된 몸과 펩티드를 추가하기 전에 추가 10-20 분 동안 4 °C에서 자기 교반기를 사용하여 천천히 저어.
- MHC H 체인 및 β2m의주입 및 희석
참고: 재접이 수행되는 온도는 일반적으로 집계를 최소화하기 위해 4°C가 가장 좋습니다. 우리는 희석을 사용하여 단백질을 다시 접습니다.- 1 mL 주사기에서 바늘을 사용하여, 각각 2개의 재접이식 완충제(1리터)에 hβ2m 개조 체 또는 bβ2m 포함 바디의 1 mL를 주입합니다. 빠르게 회전하는 교반 막대 근처에 주입하여 빠르고 효율적인 희석을 얻습니다. β2m는비교적 쉽게 재접을 가지며 H 체인이 없는 경우에도 안정적으로 유지됩니다.
- β2m가재접이식용액에 용해된 후, DMSO에 펩티드(5 mg/mL)를 용해하고 200 μL을 재폴딩 용액에 신속하게 주입한다. H 체인을 추가하기 전에 10-20 분 동안 천천히 저어줍니다.
- β2m에대해 위에서 설명한 것과 동일한 절차로 H 체인을 주입합니다. H 체인은 매우 불안정합니다. 따라서, 주사의 순서는 매우 중요 하다. H사슬 포함 체체 3m를 각각 hβ2m또는 bβ2m로2개의 상이한 재폴딩 버퍼(각 1리터)에 주입한다. 단백질의 전체 양의 단일 적용 대신 작은 알리쿼트의 연속 주사는 다시 접힌 MHC의 수율을 증가시킨다. 8-10 h에 대해 4°C에서 다시 접을 수 있습니다.
- 재접힌 단백질의 농도
- 재접이식 단백질의 농도를 위해 10 kDa MMCO 멤브레인이 있는 가압 챔버에서 울트라 여과를 사용하십시오. 이 방법은 편리하며 버퍼 교환과 결합 할 수 있습니다. 챔버에 교환 버퍼(20m Tris-HCl, 50m NaCl pH 8.0)를 추가하고 30~50mL의 최종 부피에 농축한다.
- 재접이식 용액을 원심분리기 튜브로 옮기고, 침전을 제거하기 위해 4°C에서 15분 동안 12,000 x g에서 회전한다.
- 상체를 조심스럽게 옮기고 ~ 1mL의 최종 부피로 더 집중한다.
- 10-20 분 동안 12,000 xg의 원심 분리기. 상체를 멸균 튜브로 옮기고 10/300 GL 크기 배제 컬럼을 사용하여 단백질을 정화합니다.
- 피크에서 샘플을 수집하고 SDS-PAGE (15 % 폴리 아크릴 라미드 젤)를 사용하여 분석합니다.
- MHC 복합 피크를 수집하고 15 mg / mL의 최종 농도에 집중.
- 복합체를 7.5 mg/mL및 15 mg/mL로 희석하여 결정화를 합니다.
5. 결정화, 데이터 수집 및 처리
- 착석 증기 확산 기술을 사용하여 복잡한 MHC 및 펩티드의 결정화를 수행합니다.
- 상업용 크리스탈 키트(예: 크리스탈 스크린 키트 I/II, 인덱스 스크린 키트, 페기온 키트 I/II, PEGRx 키트) 및 PEGRx 키트로 Ptal-N*01:01/펩타이드 복합체를 스크린합니다.
- 결과 용액을 밀봉하고 4 또는 18 °C에서 100 μL의 저수지 용액에 대해 평형하십시오.
- 3일, 1주, 2주, 1개월, 3개월 및 6개월 동안 문화의 결정적 성장을 관찰한다. 현미경을 사용하여 결정 판의 각 낙하에 결정이 있는지 확인합니다.
참고: Ptal-N*01:01/HeV1(bβ2m)결정은 0.2M NaCl, 0.1 M 비스-트리스(pH 5.5), 폴리에틸렌 글리콜 3,350농도로 7.5 mg/mL 농도로 관찰되었다. Ptal-N*01:01/HeV1(hβ2m)결정은 0.1 M HEPES, pH 7.0, 2%w/v 폴리에틸렌 글리콜 3,350 농도7.5 mg/mL로 관찰되었다. - 극저온 보호의 경우, 20% 글리세롤을 함유한 저장 용액으로 결정을 옮은 다음 100K 기체 질소 스트림에서 빠르게 냉각시합니다.
- 상하이 싱크로트론 방사선 시설(상하이, 중국)의 빔라인 BL19U에서 X선 회절 데이터를 수집합니다.
6. 구조 결정 및 분석
- 고해상도 구조 데이터를 통해 Denzo 프로그램과 HKL2000 소프트웨어 패키지(https://hkl-xray.com/)를 사용하여 컬렉션의 강도를 처리하고 확장합니다(https://hkl-xray.com/) .
- 단백질 데이터 뱅크(PDB)에서 더 나은 초기 모델을 선택한 후, CCP424(http://www.ccp4.ac.uk/)에서 프로그램 Phaser MR을 사용하여 분자 대체를 사용하여 구조를 결정한다. 사용된 모델은 단백질 데이터 뱅크(PDB) 코드 5F1I와 구조 좌표였다.
- 초기 조인트 개선에 세련된 X선 모델을 사용합니다. X선 단독으로 페닉스 정제와 조인트 모드를 사용하여 각각 관절 중성자와 X선 세련미를 사용하십시오.
- 정제의 모든 라운드 후, 수동으로 Fo - Fc와 2Fo에 대한 모델을 확인 - 쿠트25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/)에서 Fc 긍정적 인 핵 밀도지도. 이것은 물과 특정 D 원자의 적절한 배치를 용이하게합니다. 구조의 모든 수치는 PyMOL (http://www.pymol.org/)에 의해 만들어졌습니다.
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Representative Results
이전 작품은 HeV 유래 HeV1 (DFANTFLP) 펩티드가 Ptal-N*01:0110,19에의해 제시되었다고 보고했다. 본 명세서에서, 상동성 박쥐β 2m(bβ2m) 및 이종인간 β2m(hβ2m) (도1C,1D)를가진 Ptal-N*01:01에 이 펩티드의 결합 용량을평가하였다. 높은 해상도의 결정은 각각 형성되었다(그림1E,1F). 결정은 bβ2m로 레나튜레이션을 통해 형성된 Ptal-N*01:01/HeV1 복합체로부터 형성되며, 해상도는 2.31 Å이다. 결정은 ptal-N*01:01/HeV1 복합체로부터 형성되며, 이는 hβ2m로레나튜레이션을 통해 형성되었으며, 해상도는 1.6 Å이다. Ptal-N*01:01/HeV1 복합체는 bβ2m와 hβ2m(도1C,1D)를모두 갖춘 레나튜레이션을 통해 성공적으로 형성되었다. 이러한 맥락에서, Ptal-N*01:01/HeV1 복합체는 β 2m(도1A)와 hβ2m(도1B)를통해 올바르게 접는 H-2Kd의 존재 없이 형성되지 않은 것으로 나타났다.
Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m및 Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m의구조를 분석하였다. Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m구조에서, 잔류물 R3, H31, Q34, D53, W60, Y63의 bβ2m은 PBG 및 잔류물 Q8, Y10, R12, N24, Y28, N98, N99의 α3 도메인에 바인딩된 H사슬의 바닥을 통해 H 사슬 잔류에 묶여 있다. Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m복합체와 유사하게, Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m구조에서, bβ 2m에 해당하는 hβ2m의H31, D53,W60, Y63의 보존된 잔류물은 PBG의 바닥과 접촉하여 보존된 잔류물 Q8, Y10, R12, N24에 상응하는 bβ2m에 해당하는 α3 도메인(도 2A, 2B)에해당한다.
전체 구조물에서 Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m및 Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m,H 체인의 평균 루트 평균 사각 편차(RMSD)는 H 체인(α1α2 PBG 형성)α 0.248C)였다. 이 발견은 이 두 단지 사이에 차이가 없음을 나타냈다. 다른 β2m를가진 복합체에서 유사한 펩티드의 적합성은 그 때 비교되었다. 펩티드 정렬의 구조는 이 두 복합체에서 HeV1 펩티드의 적합성이 매우 유사하다는 것을보여주었다(도 3B). 또한, H-2Db에 의해 제시되고 마우스 β 2m(mβ 2m)또는 hβ2m로복합화된 gp33(KAVYNFATM)의 구조가 정렬되었다. H-2Db의 α1α2 PBG의 RMSD는 0.283이었고 이들 두 구조에서 펩타이드의 전체적인 적합성도 유사하였다(도3C,3D). 이들 데이터는 bβ2m와hβ2m사이의 β2m치환, mβ2m 및 hβ2m이 제시된 펩타이드의 적합성에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
서열 정렬은 상이한 종으로부터 β2m의아미노산이 높게 보존되는 것으로 나타났다(도4). 상이한 종으로부터 β2m의분석에 따르면, MHC의 H 사슬과 수소 결합을 형성하던 β2m의아미노산대부분이 보존된 것으로 나타났다(도4, 표 2). 한편, 다양한 잔류물은 또한 포유류에서 유사한 화학적 특성을 가진 아미노산이었다. 그러나, MHC의 H 사슬에 β2m결합에 관여하는 키 잔기는 닭, 물고기 및 양서류(그림4)에서다형성을 보였다.
표 1: 다양한 포유류가이종β 2m와결합합니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 이종 β2m와다양한 종의 MHC I의 중형 체인 간의 수소 결합 상호 작용. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 1: 회절 분석에 사용되는 용해성 및 재접힌 Ptal-N*01:01/HeV1 복합 단백질 및 사진의 정제. M은 kDa의 분자량 마커입니다. P1은 집계입니다. P2는 MHC 복합체입니다. P3는 β2m(A) Ptal-N*01:01/HeV1 복합체는 β 2m(B)H-2Kd 복합체가hβ2m(C)Ptal-N*01:01/HeV1 복합체를 bbmβ로 렌튜레이션을통해 형성되었다. 프로파일은 75.0, 44.0 및 13.7 kDa의 분자 질량 표준의 대략적인 위치로 표시됩니다. (D)Ptal-N*01:01/HeV1 복합체는 hβ 2m(E)로레나튜레이션을 통해 형성되었으며, 이는 bβ2m로레나튜레이션을 통해 형성되었다. 검은 색 화살표는 X 선 회절 중에 데이터를 수집하는 데 사용되는 결정을 나타냅니다. (F)결정은 ptal-N*01:01/HeV1 복합체로부터 형성되어 hβ2m로레나튜레이션을 통해 형성되었다. 검은 색 화살표는 X 선 회절 중에 데이터를 수집하는 데 사용되는 결정을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 하이브리드 MHC I 복합체에서 β2m와헤비 체인 사이의 수소 결합. β(A) 2m와 H 체인(A) 2m와 H 체인(A) 사이에 수소 결합(A)Ptal-N*01:01/bβ2m/HeV1 및(B)Ptal-N*01:01/hβ2m/HeV1 MHC 복합체. 수소 결합 상호 작용은 검은 점선으로 표시됩니다. 사각형은 확대된 영역을 나타내고 해당 색상의 상자에 오른쪽에 표시됩니다. 빨간색은 동종 β2m와이종β2m가동일한 아미노산을 사용하여 H 사슬과 수소 결합을 형성한다는 것을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 하이브리드 MHC I 복합체에서 MHC 복합체 및 항원 펩티드의 유사한 변형. (A)Ptal-N*01:01/bβ 2m(녹색) 및 Ptal-N*01:01/hβ2m(회색)의α1α2 도메인의 중첩. (B)각 Ptal-N*01:01 분자의 α1α2 도메인의 중첩을 가진 HeV1 펩타이드의 중첩. HeV1 펩타이드는 Ptal-N*01:01/bβ2m에서분홍색으로 표현되며 Ptal-N*01:01/hβ2m(C)α1α2 도메인의 중첩은 H-2Db/mouse β2m(mβ2m)(녹색) 및 H-2Db/h 2m(그레이)의 중첩이다. (D)각 H-2Db 분자의 α1α2 도메인의 중첩을 가진 gp33 펩타이드의 중첩. 펩타이드 gp33은 H-2Db/mβ 2m에서파란색으로 표현되며 H-2Db/hβ 2m.에서 분홍색으로 표현됩니다.
도 4: 다른 종의 β2m와hβ 2 m의 구조 기반 서열 정렬. 검은 색 화살표는 β 가닥을 나타냅니다. 빨간색으로 강조 표시된 잔류물은 완전히 보존되며 파란색 상자의 잔류물은 매우 높습니다(>80%) 보존. 노란색 삼각형은 β2m와H 사슬 사이의 상호 작용을 위한 주요 아미노산을 나타냅니다. 서열 정렬은 Clustal X32 및 ESPript33을사용하여 생성되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
다른 taxa로부터 이종 대체를 통한 하이브리드 단백질 복합체의 시공은 MHC I 및 리간드와 같이 동종 복합체가 제공되지 않을 때 기능및 구조적 조사를 위한 일반적인 전략이다. 그러나 방법론 및 기술에 대한 요약은 제한적입니다. 본명, 박쥐 MHC I, Ptal-N*01:01의 구조, bβ2m 또는 hβ2m에 의해 안정화된 구조가 분석되었다. Ptal-N*01:01에 결합하는 β2m의주요 아미노산은 박쥐와 인간 사이에 보존되는 것으로 나타났습니다. 추가 분석시, MHC의 H 사슬에 β2m결합에 관여하는 키 잔류물은 포유류에서 보존되었지만 닭, 물고기 및 양서류에서 다형성한 것으로 나타났습니다. 이러한 데이터는 이종 β2m대체가 포유류의 MHC I를 연구하는 실현 가능한 수단임을 나타냅니다. 그러나 포유동물과 조류, 물고기 또는 양서류 간의 대체는 실현 가능하지 않을 수 있습니다.
구조 연구는 MHC I 분자에 의해 펩티드 프리젠 테이션의 분자 메커니즘을 이해하는 데 중요한 역할을한다. 이종β2m치환은 MHC I 구조 연구14,16, 17,18,26,27, 27,28에서일반적으로 사용된다. 이전 작품은 소 MHC I, N * 01801에서, 뮤린 β2m 및 소 β2mN의 α1α2 도메인에 바인딩하는 동안 유사하게 행동 한 것으로 나타났다17. 본명, MHC I의 동일한 H 사슬에 의해 제시된 단일 펩티드의 구조를 분석하였으나 다른 β2m를분석했다. 이러한 데이터는 펩타이드의 적합성이2mβ 크로스 택시에 의해 안정화될 때 유사하므로 이종β2m대체가 펩티드 프리젠테이션에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
MHC I에 의해 제시된 항원 펩티드는 TCR에 의해 인식되어 T 세포활성화(29)를중재한다. 바이러스 감염 중 항원 특이적 T 세포 면역 반응의 평가는 바이러스 감염 및 숙주 면역 반응에 대한 이해를 크게 향상시킬 것입니다. 펩티드-MHC 테트라머는 T 세포 반응을 평가하는 중요한 기술이다. 그것은 MHC 단량체 분자를 테트라머로 만들고, 그것의 친화성을 향상하고, T 세포에 다중 TCRS와 결합하는 기술입니다. 테트라머는 연구 및 임상진단(14,29,30)에널리 사용된다. 최근에는 TCR-엔지니어링 T 세포(TCR-T)가 악성종양(31)의치료에 있어 잠재적 효능에 대한 종양 면역 요법에서 화제가 되고 있다. MHC I 테트라머 염색은 MHC I분자(29)에의해 제시된 암 관련 항원 펩티드에 대한 특정 TCR 결합을 선별하는 중요한 방법이다. 따라서, MHC I 테트라머 제제는 TCR 스크리닝에서 중요한 역할을 한다. MHC I H 체인의 결합외에도,β 2m는 또한 MHC I 테트라머 염색에 의한 TCR 스크리닝 중에 비특이적 염색으로 이어질 수 있는 T 세포 표면의 CD8에 결합한다. 이종 β2m대체는 MHC I 테트라머의 이러한 비특이적 결합을 감소시킬 수 있다.
그러나 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 대장균은 재조합 단백질에 대한 지배적인 발현 숙주로 남아 있지만, 많은 번역 후 변형을 수행할 수 없으며 발현 된 단백질 제품은 불용성 포함 체를 형성한다. 이어서, 포유류 β2m를가진 일부 비포유류β2m의유사한 대체로 인해, 비포유동물 β2m가 2m β이종으로 대체되어 MHC 구조를 지원하고 안정화시킬 수 있는지는 알려지지 않았다. 프로토콜에서 NetMHCpan 및 로제타 FlexPepDock 서버를 모두 사용하여 시도한 분석에 대한 설명이 포함되어 있습니다. 불행히도, 두 가지 생성된 예측도 실험 데이터와 일치하지 않습니다. 이는 현재 MHC 결합 펩티드 예측이 박쥐와 같은 비인간 및 비마우스 포유동물에 적합하지 않았으며, 이는 펩타이드 결합의 다른 방식을 가질 수 있음을 나타낼 수 있다. 따라서, 우리는 높은 친화성 펩티드를 얻기 위해 포괄적 인 분석을위한 다양한 예측 소프트웨어와 실험 결과를 결합해야합니다.
여기에 설명된 프로토콜에서 핵심 단계는 MHC를 올바르게 재성화할 수 있다는 것입니다. 높은 재접이식 효율을 가진 MHC 복합체를 확보하는 것이 매우 중요합니다. 따라서, 적합한 펩티드를 선택하고 포함 신체의 순도를 증가시키는 데 주의를 기울이는 것이 중요합니다.
결론적으로, 본 원에서 MHC I 발현, 재접기, 결정화, 결정 데이터 수집 및 구조 결정에 대한 프로토콜을 요약한다. 더욱이, MHC에서이종β 2m치환의 타당성을 분석했다. 이 연구는 구조 및 기능 연구에서 MHC I를 이해하기 위한 사운드 참조를 제공합니다. 또한, 이들 데이터는 또한 전염병 및 종양 면역 요법 중 T 세포 반응의 평가를 위해 유의하다.
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Disclosures
저자는 선언할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 제약 생명 공학의 국가 핵심 실험실의 오픈 펀드에 의해 지원되었다, 난징 대학, 중국 (그랜트 번호. KF-GN-201905), 중국 국립 자연과학 재단 (보조금 81971501). 윌리엄 J. 리우NSFC (81822040)와 베이징 신스타 과학 기술 계획 (Z18100006218080)의 우수 젊은 과학자 프로그램에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
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