تحليل استقلاب الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية
Summary
في هذه الورقة، نحن وصف طريقة لقياس تحلل التحلل والتنفس الميتوكوندريا في الإنسان الرئيسي القاتل الطبيعي (NK) الخلايا المعزولة من الدم المحيطي، في بقية أو بعد تنشيط الناجمة عن IL15. يمكن تمديد البروتوكول الموصوف بسهولة إلى خلايا NK البشرية الأولية التي يتم تنشيطها بواسطة السيتوكينات الأخرى أو المحفزات القابلة للذوبان.
Abstract
الطبيعية القاتل (NK) الخلايا التوسط أساسا الفطرية المضادة للورم والاستجابات المناعية المضادة للفيروسات والاستجابة لمجموعة متنوعة من السيتوكينات وغيرها من المحفزات لتعزيز البقاء على قيد الحياة, انتشار الخلايا, إنتاج السيتوكينات مثل انترفيرون غاما (IFNγ) و / أو برامج السمية الخلوية. NK تفعيل الخلية من قبل تنشيط السيتوكين يتطلب إعادة عرض كبيرة من المسارات الأيضية لدعم متطلباتها الحيوية والإنقاث البيولوجية. هناك مجموعة كبيرة من الأدلة التي تشير إلى أن ضعف استقلاب الخلايا NK يرتبط بعدد من الأمراض المزمنة بما في ذلك السمنة والسرطان، مما يسلط الضوء على الأهمية السريرية لتوافر طريقة لتحديد استقلاب الخلايا NK. هنا نحن وصف استخدام محلل تدفق خارج الخلية، منصة التي تسمح قياسات في الوقت الحقيقي من تحلل واستهلاك الأكسجين الميتوكوندريا، كأداة لرصد التغيرات في استقلاب الطاقة من الخلايا NK الإنسان. الطريقة المذكورة هنا يسمح أيضا لرصد التغيرات الأيضية بعد تحفيز الخلايا NK مع السيتوكينات مثل IL-15، وهو النظام الذي يجري حاليا التحقيق في مجموعة واسعة من التجارب السريرية.
Introduction
خلايا “القاتل الطبيعي” (NK) هي الخلايا اللمفاوية الفطرية التي تتوسط الاستجابات المضادة للورم والفيروسات. تشكل خلايا NK 5-15٪ من جميع الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي البشري، ويمكن العثور عليها أيضًا في الطحال والكبد ونخاع العظام والعقد الليمفاوية. لا تعبر خلايا NK عن مستقبلات clonotypic متعددة الأشكال، مثل مستقبلات الخلايا التائية (TCR) أو مستقبلات الخلايا B (BCR). في المقابل، يتم دفع تفعيل وظائفها الخلوية من خلال إشراك المستقبلات التي تعترف ligands ثابت على سطح الخلية المستهدفة1،2.
يستريح الإنسان NK الخلايا المعزولة من الدم المحيطي يمكن البقاء على قيد الحياة لعدة أيام في المتوسطة الثقافة تكملها مصل الإنسان. تفعيل خلايا NK بواسطة السيتوكينات مثل IL-15 أو IL-2 يدفع الخلايا إلى الانتشار وزيادة قدرتها على القتل، من بين تأثيرات أخرى3،4،5. وقد أظهرت العديد من الدراسات وجود علاقة مباشرة بين تنشيط الخلايا NK والتغيرات في نشاطهم الأيضي6. هذه التغييرات الأيضية متجهة لتلبية الاحتياجات الخاصة للخلايا من حيث الطاقة والإنحلال الحيوي.
الخلايا الهوائية والكائنات الحصول على الطاقة من خلال سلسلة من التفاعلات الكيميائية التي تنطوي على تقويض وأكسدة الكربوهيدرات والدهون والبروتينات. من خلال مزيج من تحلل، وحامض ثلاثي الكربوكسيلي (TCA) دورة والفوسفورة التأسد، الخلايا eukaryotic تلبية غالبية الطلب ATP والحصول على وسيطة المطلوبة ككتل بناء للجزيئات الجزيئات الأساسية لنمو الخلايا والانتشار. تبدأ عملية تحلل الجلوكوز(الشكل 1A)بدخول الجلوكوز في الخلية. في السيتوسول، الجلوكوز هو الفوسفور وتحويلها إلى بيروفات (مع صافي إنتاج 2 جزيئات من ATP لكل جزيء الجلوكوز)، والتي يمكن تخفيضها إلى اللاكتات أو نقلها إلى الميتوكوندريا ليتم تحويلها إلى أسيتيل-CoA وتدخل دورة TCA. تستمر دورة TCA في ركوب الدراجات التي تغذيها جزيئات أكثر من أسيتيل-COA وتنتج CO2 (التي ستنتشر في نهاية المطاف خارج الخلية ، ومن خلال التفاعل مع H2O في الوسط ، سوف تولد حمض الكربونيك الذي سيؤدي إلى تحمض الوسط) و NADH ، الجزيء المسؤول عن التبرع بالإلكترونات لسلسلة نقل الإلكترونات (ETC). الإلكترونات السفر من خلال مختلف مجمعات البروتين وأخيرا قبلت من قبل الأكسجين. هذه المجمعات (I, III و IV) أيضا ضخ H+ من مصفوفة الميتوكوندريا في الفضاء intermembrane. ونتيجة للتدرج الكهروكيميائي المتولدة، فإن H+ سيدخل مرة أخرى في المصفوفة من خلال V المعقدة (ATP-synthase)، باستثمار الطاقة المحتملة المتراكمة في توليد ATP.
يمكن منع كل من تحلل التحلل والتنفس الميتوكوندريا في نقاط مختلفة باستخدام مثبطات. وكان معرفة واستخدام هذه المثبطات الأساس لتطوير مقايسة التدفق خارج الخلية. من خلال قياس اثنين من المعايير البسيطة في الوقت الحقيقي مثل الهيدروجيني والأكسجين، محلل تدفق خارج الخلية يستنتج معدل تحلل الغليك والتنفس الميتوكوندريا في لوحة 96-جيدا. يتم إجراء اختبار الإجهاد تحلل في وسط القاعدية دون الجلوكوز (الشكل 1B)7. والقياسات الأولى لمعدل التحمض خارج الخلية (ECAR) تدل على تحمض تحلل مستقل. ويشار إلى هذا التحمض غير glycolytic ويرتبط مع CO2 التي تنتجها TCA التي، كما أوضح من قبل، يجمع مع H2O في المتوسط لتوليد H+ (ECAR المرتبطة TCA). الحقنة الأولى هي الجلوكوز للحث على استخدام الجلوكوز وتعزيز تحلل الجلوكوز. الحقنة الثانية تجمع بين كل من الرتينون، مثبطات معقدة I، ومضاد مضادة للاكتئاب A، مثبط مجمع الثالث معا، لمنع الخلايا ETC تستجيب لهذا الانخفاض الكبير في إنتاج ATP الميتوكوندريا عن طريق تفعيل تحلل للحفاظ على مستويات ATP الخلوية، وهذا يمثل كمية من glycolysis التي لا تستخدمها الخلية في الحالة القاعدية ولكن يمكن أن يحتمل أن يتم تجنيدها استجابة للزيادات في ATP الطلب (تعويض الجلسانية). الحقنة الثالثة هي الجلوكوز التناظرية 2-Deoxyglucose (DG)، الذي ينافس الجلوكوز كركيزة للهكية الانزيم. لا يمكن تحويل نتاج هذا الفسفر، 2-deoxyglucose-6-الفوسفات إلى بيروفات، وبالتالي يتم حظر تحلل، مما يقلل من ECAR إلى الحد الأدنى. ويشمل قياس الـ ECAR في هذه المرحلة مصادر أخرى من التحمض خارج الخلية لا تعزى إلى تحلل التحلل أو النشاط التنفسي، وكذلك إلى أي تحلل متبقي لا يمنعه بشكل كامل 2-DG (بعد 2-DG-acidification).
يتم تنفيذ اختبار الإجهاد الميتوكوندريا في المتوسط مع الجلوكوز (الشكل 1C)8. القياسات الأولى لمعدل استهلاك الأكسجين (OCR) تتوافق مع الخط الأساسي لتنفس الميتوكوندريا (التنفس القاعدي). الحقنة الأولى هي أولغوميسين، الذي يمنع عودة البروتونات من خلال سينثاز ATP (V المعقدة)، وحجب تركيب ATP وبالتالي بسرعة فرط القطب غشاء الميتوكوندريا، مما يمنع ضخ البروتونات من خلال مجمعات الجهاز التنفسي، ويؤدي إلى انخفاض في OCR. وتمثل المقارنة بين التنفس الأساسي والقيمة التي تُعطى عن طريق إضافة ألتغوميسين التنفس المرتبط بـ ATP. ويسمى معدل أقليجوميسين المتبقية من استهلاك الأكسجين تسرب البروتونات، والذي يمثل تدفق البروتونات من خلال ثنائي الدهون أو البروتينات في الغشاء الميتوكوندريا الداخلية مثل النيوكليوتيدات أدينينtranslocase 9. الحقنة الثانية هي uncoupler 2،4-dinitrophenol (DNP)، وهو ionophore الذي يحفز دخول ضخمة من H+ في مصفوفة الميتوكوندريا، مما يؤدي إلى إزالة القطب من غشاء الميتوكوندريا وتعطيل تخليق ATP الميتوكوندريا. تستجيب الخلايا لتبديد قوة البروتون الدافعة عن طريق زيادة معدل نقل الإلكترون واستهلاك الأكسجين إلى أقصى مستويات في محاولة عقيمة لاستعادة إمكانات الغشاء (القدرة التنفسية القصوى). والفرق بين القدرة التنفسية القصوى والتنفس القاعدي هو قدرة الجهاز التنفسي الاحتياطية للخلية، والتي تمثل كمية التنفس التي لا تستخدمها الخلية لتوليد ATP في الحالة القاعدية ولكن يمكن أن يكون من المحتمل تجنيد استجابة للزيادات في الطلب ATP أو في ظل ظروف الإجهاد8. الحقنة الثالثة هي مزيج من الروتينون ومضادات الديميسينين A. هذه الحقن توقف تماما وSOCS انخفاض OCR إلى أدنى مستوى لها، مع استهلاك الأكسجين المتبقية يجري غير الميتوكوندريا (الناجمة عن NADPH-أوكسيداسيس، الخ).
يمكن أن التغيرات في المسارات الأيضية التنبؤ بطريقة أو بأخرى عمل الخلايا NK، كما اقترح أن التنشيط المستمر للخلايا NK مع السيتوكينات في المختبر يمكن أن يؤدي إلى استنفاد الخلايا NK من خلال دراسة مسارات التمثيل الغذائي المختلفة10،11. العلاقة بين NK حالة الأيضية الخلية والوظيفة مهم جدا من وجهة نظر العلاج المناعي السرطان. في هذا المجال، تم اختبار تفعيل خلايا NK مع ضخ IL-15، وحدها أو بالاشتراك مع الأجسام المضادة العلاجية أحادية النسيلة من أجل تحسين الخلايا السرطانية قتل12،13،14. من شأن معرفة الحالة الأيضية للخلايا NK استجابة لهذه الاستراتيجيات العلاجية توفير مؤشر قيمة لحالة تنشيط الخلية NK و وظيفة القتل.
وقد وصفت دراسة المسارات الأيضية في الخلايا النخاعية واللمفاوية الأخرى مثل الخلايا الأحادية، T و B الخلايا15 والطرق الأمثل قد نشرت16. في هذا البروتوكول ونحن نقدم طريقة تجمع بين كل من بروتوكول العزلة NK التي تعطي أعدادا كبيرة من الخلايا النقية والقابلة للحياة NK وبروتوكول محسن لقياس النشاط الأيضي باستخدام محلل تدفق خارج الخلية. هنا نظهر أن هذا هو وسيلة صالحة لدراسة التغيرات الأيضية في الراحة و IL-15 تنشيط الخلايا NK الإنسان. بالنسبة للفحص الخارج عن الخلية، تم اختبار المعلمات مثل عدد الخلايا وتركيزات الأدوية وتحسينها. بالمقارنة مع أساليب التنفس الأخرى ، محلل تدفق خارج الخلية مؤتمتة بالكامل وقادرة على اختبار في الوقت الحقيقي ، مع كميات منخفضة جدا من الخلايا ، تصل إلى 92 عينات في وقت واحد ، وبالتالي يسمح بالفحص عالي الإنتاجية (مع عينات متعددة ومكررات) بطريقة سريعة نسبيا17.
يمكن استخدام هذه الطريقة من قبل الباحثين المهتمين في تقييم وظيفة الخلية NK من خلال دراسة NK استقلاب الخلية. ويمكن تطبيقه كذلك على الخلايا التي تنشطها السيتوكينات الأخرى، والأجسام المضادة أو المحفزات القابلة للذوبان.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الورقة، أنشأنا بروتوكولاً لعزل واستزراع الخلايا النقية النقية والأساسية NK البشرية من الدم المحيطي. كما قمنا بتحسين ظروف قياس النشاط الأيضي لهذه الخلايا NK التي تم تقييمها من قبل معدل استهلاك الأكسجين ومعدل التحمض خارج الخلية باستخدام محلل تدفق خارج الخلية. بالمقارنة مع أساليب التن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور مايكل ن. ساك (المعهد الوطني للقلب والرئة والدم) على الدعم والمناقشة. وقد دعمت هذه الدراسة من قبل برامج البحوث داخل الأمعاء من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للسرطان والمعهد الوطني للقلب والرئة والدم. ويدعم JT من قبل برنامج رامون y Cajal (منحة RYC2018-026050-I) من MICINN (إسبانيا).
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | MilliporeSigma | D8375-5G | Glycolyisis stress test injector compound |
| 2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) | MilliporeSigma | D198501 | ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound |
| 96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid | Costar | 3799 | NK cell culture |
| Antimycin A | MilliporeSigma | A8674 | Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| BD FACSDIVA Software | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| BD LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive |
| CyQUANT cell proliferation assay | ThermoFisher Scientific | C7026 | Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye |
| EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II | Stemcell technologies | 17851 | NK cell isolation from PBMCs |
| EasySep Human NK cell Enrichment Kit | Stemcell technologies | 19055 | NK cell isolation from PBMCs |
| EasySep Magnet | Stemcell technologies | 18001 | NK cell isolation from PBMCs |
| EDTA 0.5 M, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | NK sell separation buffer |
| FACS tubes | Falcon-Fisher Scientific | 352235 | Flow cytometry experiment |
| Falcon 50 ml Conical tubes | Falcon-Fisher Scientific | 14-432-22 | NK cell separation |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437-028 | NK cell separation buffer |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Flow data analysis | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270 | Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer |
| Human IL-15 | Peprotech | 200-15-50ug | NK cell stimulation |
| Human serum (HS) | Valley Biomedical | 9C0539 | NK cell culture medium supplement |
| IMDM | Gibco | 12440053 | NK cell culture medium |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | Component of stress test media |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34965 | Viability dye for flow cytometry staining |
| LSM | mpbio | 50494X | PBMCs separation from human blood |
| Mouse anti-human CD3 BV711 | BD Biosciences | 563725 | T cell flow cytometry staining |
| Mouse anti-human CD56 PE | BD Pharmingen | 555516 | NK flow cytometry staining |
| Mouse anti-human NKp46 PE | BD Pharmingen | 557991 | NK flow cytometry staining |
| Oligomycin | MilliporeSigma | 75351 | Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound |
| PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | NK cell separation buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | For determination of protein concentration |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | Cell lysis |
| Rotenone | MilliporeSigma | R8875 | Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| Seahorse Wave Controller Software | Agilent | Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer | |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent | For data analysis | |
| Seahorse XF Base Medium | Agilent | 102353-100 | Extracellular Flux assay base medium |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Extracellular Flux Analyzer | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml). |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S5761 | To prepare the Cell-Tak solution |
| Sodium pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test medium |
References
- Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
- Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors. Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).
- Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. Interleukin-2 augments natural killer cell activity. Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).
- Anton, O. M., et al. Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).
- Marcais, A., et al. The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells. Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).
- Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PloS One. 11 (3), 0152016 (2016).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).
- Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment. Frontiers in Immunology. 10, 2278 (2019).
- Felices, M., et al. Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219 (2018).
- Miller, J. S., et al. A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).
- Conlon, K. C., et al. IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion. Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).
- Dubois, S., et al. IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities. Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).
- Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
- Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
- Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. Journal of Visualized Experiments. (116), e54615 (2016).
- Theorell, J., Bryceson, Y. T. Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).
- Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
- O’Brien, K. L., Finlay, D. K. Immunometabolism and natural killer cell responses. Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).
- Ahn, B. H., et al. A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).
- Stram, A. R., Payne, R. M. Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).
- Armstrong, J. A., et al. Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift. Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).
- Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
- Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464 (2015).
- Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).
- Michelet, X., et al. Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).
