ניתוח של חילוף החומרים של תאי הרוצח הטבעי האנושי
Summary
במאמר זה, אנו מתארים שיטה למדוד גליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלי בתאים קטלניים אנושיים עיקריים (NK) מבודדים מדם היקפי, במנוחה או בעקבות הפעלה המושרה IL15. הפרוטוקול המתואר יכול להיות מורחב בקלות לתאי NK אנושיים ראשוניים המופעלים על ידי ציטוקינות אחרים או גירויים מסיסים.
Abstract
תאי רוצח טבעי (NK) לתווך בעיקר תגובות אנטי-סרטיות ואנטי-ויראליות מולדות חיסוניות ומגיבים למגוון רחב של ציטוקינות וגירויים אחרים כדי לקדם הישרדות, התפשטות תאית, ייצור ציטוקינות כגון אינטרפרון גמא (IFNơ) ו / או תוכניות cytotoxicity. הפעלת תא NK על ידי גירוי ציטוקין דורש שיפוץ משמעותי של מסלולים מטבוליים כדי לתמוך בדרישות ביו-אנראזטיות וביו-סינתטיות שלהם. יש גוף גדול של ראיות המצביעות על כך חילוף חומרים לקוי של תאים NK קשורה מספר מחלות כרוניות כולל השמנת יתר וסרטן, אשר מדגיש את החשיבות הקלינית של הזמינות של שיטה כדי לקבוע את חילוף החומרים של תאים NK. כאן אנו מתארים את השימוש במנתח שטף חוץ-תאי, פלטפורמה המאפשרת מדידות בזמן אמת של גליקוליזה וצריכת חמצן מיטוכונדריאלי, ככלי לניטור שינויים בחילוף החומרים של האנרגיה של תאי NK אנושיים. השיטה המתוארת כאן מאפשרת גם ניטור של שינויים מטבוליים לאחר גירוי של תאי NK עם ציטוקינות כגון IL-15, מערכת כי הוא נחקר כעת במגוון רחב של ניסויים קליניים.
Introduction
תאי רוצח טבעי (NK) הם לימפוציטים מולדים לתווך תגובות אנטי-סרטני ואנטי ויראלי. תאי NK מהווים 5-15% מכל הלימפוציטים בדם היקפי אנושי, וניתן למצוא אותם גם בטחול, כבד, מח עצם ובלוטות לימפה. תאי NK אינם מבטאים קולטנים קלונוטיפים פולימורפיים, כגון קולטני תאי T (TCR) או קולטני תאי B (BCR). לעומת זאת, ההפעלה של פונקציות cytolytic שלהם מתבקש על ידי המעורבות של קולטנים המזהים ליגנדים שונים על פני השטח של תא היעד1,,2.
מנוחה תאי NK אנושיים מבודדים מדם היקפי יכול לשרוד במשך כמה ימים במדיום תרבות בתוספת נסיוב אנושי. הפעלה של תאי NK על ידי ציטוקינות כגון IL-15 או IL-2 מניעה את התאים להתפשטות ולעלייה ביכולת ההרג שלהם, בין היתר3,,4,,5. מספר מחקרים הראו מתאם ישיר בין הפעלת תא NK ושינויים בפעילות חילוף החומרים שלהם6. שינויים מטבוליים אלה נועדו לענות על הדרישות הספציפיות של התאים במונחים של אנרגיה וביוסינתזה.
תאים אירוביים ואורגניזמים להשיג אנרגיה באמצעות סדרה של תגובות כימיות המערבות את הקטבוליזם וחמצון של פחמימות, שומן וחלבונים. באמצעות שילוב של גליקוליזה, מחזור חומצה tricarboxylic (TCA) וphosphorylation חמצוני, תאים אאוקריוטיים לענות על רוב הביקוש ATP שלהם ולקבל ביניים הנדרשים אבני בניין עבור מקרומולקולות חיוני לצמיחת תאים והתפשטות. תהליך הגליקוליזה(איור 1A)מתחיל בכניסה של גלוקוז בתא. בציטוסול, גלוקוז הוא זרחן והפך pyruvate (עם ייצור נטו של 2 מולקולות של ATP לכל מולקולת גלוקוז), אשר ניתן להפחית ללקטאט או מועבר לתוך המיטוכונדריה כדי להפוך אצטיל-CoA ולהיכנס מחזור TCA. מחזור TCA ממשיך רכיבה על אופניים מתודלק עם מולקולות יותר של אצטיל-CoA ומייצר CO 2 (כי בסופו של דבריהיה לפזר מחוץ לתא, על ידי תגובה עם H2O במדיום, ייצור חומצה פחמתית תוביל חומציות של המדיום) ו NADH, המולקולה האחראית על תרומת אלקטרונים לשרשרת תחבורת אלקטרונים (ETC). האלקטרונים נעים דרך מתחמי חלבון שונים ולבסוף מתקבלים על ידי חמצן. מתחמים אלה (I, III ו- IV) גם לשאוב H+ מ מטריצה מיטוכונדריאלי לחלל intermembrane. כתוצאה מההדרגה האלקטרוכימית שנוצרה, ה-H+ ייכנס שוב למטריצה דרך V המורכב (ATP-סינתאז), וישקיע את האנרגיה הפוטנציאלית שנצברה בדור ה-ATP.
הן גליקוליזה והן הנשימה המיטוכונדריאלית ניתן לחסום בנקודות שונות באמצעות מעכבים. הידע והשימוש של מעכבים אלה היה הבסיס להתפתחות של תסיסה שטף חוץ תאי. על ידי מדידת שני פרמטרים פשוטים בזמן אמת כגון pH וחמצן, מנתח השטף החוץ-תאי משער את קצב גליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלית בצלחת 96-באר. בדיקת הלחץ גליקוליזה מבוצעת במדיום בסיס ללא גלוקוז (איור 1B)7. המדידות הראשונות של קצב החומציות החוץ-תאי (ECAR) מצביעות על חומציות עצמאית-גליקוליזה. הוא מכונה חומציות שאינה גליקולית ומתאים עם CO2 המיוצר על ידי TCA אשר, כפי שהוסבר קודם לכן, משתלב עם H2O במדיום כדי ליצור H+ (TCA מקושר ECAR). הזריקה הראשונה היא גלוקוז כדי לגרום לניצול גלוקוז ולהגביר את הגליקווליזה. הזריקה השנייה משלבת את שניהם רוטנון, מעכב מורכב אני, ואנטימיצין A, מעכב III מורכב יחד, כדי לחסום את התאים ETC. להגיב לירידה דרמטית זו בייצור ATP מיטוכונדריאלי על ידי הפעלת גליקוליזה כדי לשמור על רמות ATP הסלולר, וזה מייצג את כמות גליקוליזה כי אינו בשימוש על ידי התא במצב בסיס, אבל יכול להיות מגויס פוטנציאלי בתגובה לעליות בביקוש ATP (גליקוזיס מפצה). הזריקה השלישית היא הגלוקוז אנלוגי 2-Deoxyglucose (DG), אשר מתחרה עם גלוקוז כצע לאנזים hexokinase. המוצר של פוספורילציה זו, 2-deoxyglucose-6-פוספט לא ניתן להפוך pyruvate, ולכן גליקוליזה חסומה, אשר מוריד את ECAR למינימום שלה. ECAR נמדד בשלב זה כולל מקורות אחרים של חומציות חוץ תאית כי אינם מיוחסים גליקוליזה או פעילות נשימתית, כמו גם כל גליקוליזה שיורית לא מעוכב באופן מלא על ידי 2-DG (פוסט 2-DG-חומציות).
בדיקת הלחץ המיטוכונדריאלי מבוצעת במדיום עם גלוקוז(איור 1C)8. המדידות הראשונות של קצב צריכת החמצן (OCR) תואמות לקו הבסיס של הנשימה המיטוכונדריאלית (הנשימה הבסיסית). הזריקה הראשונה היא oligomycin, אשר מעכב את חזרתם של פרוטונים דרך סינתאז ATP (V מורכב), חסימת סינתזה ATP ובכך במהירות hyperpolarize קרום המיטוכונדריה, אשר מונע פרוטון נוסף שאיבה דרך מתחמי נשימה, ומוביל לירידה OCR. ההשוואה בין הנשימה הבסיסית לבין הערך שניתן על-ידי הוספת אוליגומיצין מייצגת את הנשימה המקושרת ל-ATP. שאר oligomycin-קצב רגיש של צריכת חמצן נקרא דליפת פרוטון, אשר מייצג את זרימת פרוטונים דרך דוטל השימנים או חלבונים קרום המיטוכונדריה הפנימית כגון טרנסלוקאז נוקלאוטיד אדנין9. הזריקה השנייה היא uncoupler 2,4-dinitrophenol (DNP), יונופור שגורם כניסה מסיבית של H+ לתוך מטריצת המיטוכונדריה, אשר מוביל depolarization של קרום המיטוכונדריה ושיבוש של סינתזה ATP מיטוכונדריאלי. תאים מגיבים לפיזה של כוח מניע פרוטון על ידי הגדלת קצב תחבורת אלקטרונים וצריכת חמצן לרמות מרביות בניסיון חסר תועלת לשחזר את פוטנציאל קרום (קיבולת נשימתית מקסימלית). ההבדל בין קיבולת הנשימה המקסימלית לנשימה הבסיסית הוא קיבולת הנשימה הרזרבית של התא, המייצג את כמות הנשימה שאינה בשימוש על ידי התא כדי ליצור ATP במצב בסיס, אבל יכול להיות מגויס בתגובה לעליות בביקוש ATP או בתנאים שלמתח 8. הזריקה השלישית היא שילוב של רוטנון ואנטימיצין A. הזרקה זו עוצרת לחלוטין את ETC ו OCR יורד לרמה הנמוכה ביותר שלה, עם צריכת החמצן הנותרת להיות לא מיטוכונדריאלי (נגרמת על ידי NADPH-oxidases, וכו ‘).
שינויים במסלולים מטבוליים יכול איכשהו לחזות את התפקוד של תאי NK, כפי שהוצע כי הפעלה רציפה של תאי NK עם ציטוקינות במבחנה יכול להוביל תשישות תא NK על ידי המחקר של מסלולים מטבולייםשונים 10,11. המתאם בין מצב חילוף החומרים של תא NK ותפקוד חשוב מאוד מנקודת המבט של אימונותרפיה סרטן. בתחום זה, הפעלה של תאי NK עם אינפוזיה של IL-15, לבד או בשילוב עם נוגדנים טיפוליים חד-בוניים נבדקו על מנת לשפר את הרג תאיםסרטניים 12,13,14. הידע של המצב חילוף החומרים של תאי NK בתגובה אסטרטגיות טיפול אלה יספק מנבא יקר של מצב הפעלת תא NK ופונקציית הרג.
המחקר של מסלולים מטבוליים בתאים מיאלואידים ולימפה אחרים כגון מונוציטים, T ו-B תאיםתוארו 15 ושיטות אופטימיזציהפורסמו 16. בפרוטוקול זה אנו מספקים שיטה המשלבת הן פרוטוקול בידוד NK המניב מספרים גבוהים של תאי NK טהורים ו-קיימא ופרוטוקול ממוטב כדי למדוד פעילות מטבולית באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי. כאן אנו מראים כי זוהי שיטה חוקית לחקר שינויים מטבוליים במנוחה ו IL-15 מופעל תאי NK אנושיים. עבור אחסון שטף חוץ תאי, פרמטרים כגון מספר תא וריכוזי סמים נבדקו וממוטבים. בהשוואה לשיטות התרגם אחרות, מנתח השטף החוץ-תאי הוא אוטומטי לחלוטין ומצליח לבדוק בזמן אמת, עם כמויות נמוכות מאוד של תאים, עד 92 דגימות בו-זמנית, ובכך מאפשר הקרנות תפוקה גבוהות (עם דגימות מרובות ושכפולים) באופן מהיריחסית 17.
שיטה זו יכולה לשמש חוקרים המעוניינים להעריך את תפקוד תא NK על ידי לימוד חילוף החומרים של תאי NK. זה יכול להיות מיושם גם על תאים המופעלים על ידי ציטוקינות אחרים, נוגדנים או גירויים מסיסים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בנייר זה, הקמנו פרוטוקול לבידוד יעיל וculing טהור וית קיימא תאי NK אנושיים ראשוניים מדם היקפי. יש לנו גם אופטימיזציה התנאים למדידה של הפעילות חילוף החומרים של תאי NK אלה העריכו על ידי קצב צריכת חמצן וקצב חומציות חוץ תאית באמצעות מנתח שטף חוץ תאי. בהשוואה לשיטות התרגם אחרות, מנתח השטף החוץ-תאי מה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לד”ר מייקל נ. סאק (המכון הלאומי ללב, ריאות ודם) על התמיכה והדיון. מחקר זה נתמך על ידי תוכניות המחקר התוך-ממורל של המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לסרטן והמכון הלאומי ללב, ריאות ודם. JT נתמכת על ידי תוכנית רמון y Cajal (להעניק RYC2018-026050-I) של MICINN (ספרד).
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | MilliporeSigma | D8375-5G | Glycolyisis stress test injector compound |
| 2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) | MilliporeSigma | D198501 | ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound |
| 96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid | Costar | 3799 | NK cell culture |
| Antimycin A | MilliporeSigma | A8674 | Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| BD FACSDIVA Software | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| BD LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive |
| CyQUANT cell proliferation assay | ThermoFisher Scientific | C7026 | Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye |
| EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II | Stemcell technologies | 17851 | NK cell isolation from PBMCs |
| EasySep Human NK cell Enrichment Kit | Stemcell technologies | 19055 | NK cell isolation from PBMCs |
| EasySep Magnet | Stemcell technologies | 18001 | NK cell isolation from PBMCs |
| EDTA 0.5 M, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | NK sell separation buffer |
| FACS tubes | Falcon-Fisher Scientific | 352235 | Flow cytometry experiment |
| Falcon 50 ml Conical tubes | Falcon-Fisher Scientific | 14-432-22 | NK cell separation |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437-028 | NK cell separation buffer |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Flow data analysis | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270 | Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer |
| Human IL-15 | Peprotech | 200-15-50ug | NK cell stimulation |
| Human serum (HS) | Valley Biomedical | 9C0539 | NK cell culture medium supplement |
| IMDM | Gibco | 12440053 | NK cell culture medium |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | Component of stress test media |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34965 | Viability dye for flow cytometry staining |
| LSM | mpbio | 50494X | PBMCs separation from human blood |
| Mouse anti-human CD3 BV711 | BD Biosciences | 563725 | T cell flow cytometry staining |
| Mouse anti-human CD56 PE | BD Pharmingen | 555516 | NK flow cytometry staining |
| Mouse anti-human NKp46 PE | BD Pharmingen | 557991 | NK flow cytometry staining |
| Oligomycin | MilliporeSigma | 75351 | Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound |
| PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | NK cell separation buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | For determination of protein concentration |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | Cell lysis |
| Rotenone | MilliporeSigma | R8875 | Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| Seahorse Wave Controller Software | Agilent | Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer | |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent | For data analysis | |
| Seahorse XF Base Medium | Agilent | 102353-100 | Extracellular Flux assay base medium |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Extracellular Flux Analyzer | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml). |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S5761 | To prepare the Cell-Tak solution |
| Sodium pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test medium |
References
- Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
- Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors. Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).
- Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. Interleukin-2 augments natural killer cell activity. Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).
- Anton, O. M., et al. Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).
- Marcais, A., et al. The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells. Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).
- Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PloS One. 11 (3), 0152016 (2016).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).
- Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment. Frontiers in Immunology. 10, 2278 (2019).
- Felices, M., et al. Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219 (2018).
- Miller, J. S., et al. A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).
- Conlon, K. C., et al. IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion. Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).
- Dubois, S., et al. IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities. Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).
- Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
- Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
- Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. Journal of Visualized Experiments. (116), e54615 (2016).
- Theorell, J., Bryceson, Y. T. Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).
- Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
- O’Brien, K. L., Finlay, D. K. Immunometabolism and natural killer cell responses. Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).
- Ahn, B. H., et al. A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).
- Stram, A. R., Payne, R. M. Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).
- Armstrong, J. A., et al. Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift. Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).
- Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
- Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464 (2015).
- Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).
- Michelet, X., et al. Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).
