पेरी-प्रत्यारोपण चरण मानव भ्रूण में ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं का एकल सेल संग्रह
Summary
यहां, हम विट्रीफाइड ह्यूमन ब्लास्टोसिस्ट को गर्म करने, उन्हें विट्रो में प्रत्यारोपण अवधि के माध्यम से बनाने, उन्हें एकल कोशिकाओं में पचाने और आगे की जांच के लिए जल्दी ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
मानव प्रत्यारोपण, अपोजिशन और गर्भाशय की सतह एपिथेलिया के लिए आसंजन और मातृ decidua में ब्लास्टोसिस्ट के बाद आक्रमण, एक महत्वपूर्ण अभी तक रहस्यपूर्ण जैविक घटना है कि ऐतिहासिक रूप से तकनीकी और नैतिक सीमाओं के कारण अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो गया है । प्रत्यारोपण ट्रोफेक्टोडर्म के विकास से शुरुआत की जाती है ताकि जल्दी ट्रोफोब्लास्ट और बाद में अलग-अलग ट्रोफोब्लास्ट सबलाइनीज में भेदभाव हो। एबररेंट अर्ली ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव से प्रत्यारोपण विफलता, अपरा विकृतियों, भ्रूण असामान्यताओं और गर्भपात हो सकते हैं। हाल ही में, मानव भ्रूण को मातृ ऊतकों की अनुपस्थिति में विट्रो में 13 के बाद निषेचन तक बढ़ने की अनुमति देने के लिए तरीके विकसित किए गए हैं, एक समय-अवधि जिसमें मनुष्यों में प्रत्यारोपण अवधि शामिल है। इससे शोधकर्ताओं को मानव प्रत्यारोपण की जांच करने और मातृ प्रभावों को भ्रमित किए बिना इस महत्वपूर्ण अवधि के दौरान ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव की गतिशीलता को पुनः रीकैपिटल करने और वीवो में प्रारंभिक भ्रूण भेदभाव की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अंतर्निहित बाधाओं से बचने का अवसर मिला है । प्रत्यारोपण के दौरान विभिन्न ट्रोफोब्लास्ट सबलाइनेज की विशेषता के लिए, हमने मौजूदा दो-आयामी (2D) विस्तारित संस्कृति विधियों को अपनाया है और डाउनस्ट्रीम परख के लिए विभिन्न प्रकार की ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं को एंजाइमेटिक रूप से पचाने और अलग करने के लिए एक प्रक्रिया विकसित की है। 2डी स्थितियों में सुसंस्कृत भ्रूण में अपेक्षाकृत चपटा आकृति विज्ञान होता है और वीवो त्रि-आयामी (3 डी) भ्रूणीय आर्किटेक्चर में मॉडलिंग में उप-अनुकूल हो सकता है। हालांकि, ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव कम प्रभावित होने लगता है जैसा कि विस्तारित संस्कृति के दौरान प्रत्याशित आकृति विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन द्वारा प्रदर्शित किया जाता है। साइटोट्रोफोब्लास्ट, सिंकियोट्रोफोब्लास्ट और प्रवासी ट्रोफोब्लास्ट सहित विभिन्न ट्रोफोब्लास्ट सबलाइनेज को आकार, स्थान और लौकिक उद्भव से अलग किया जा सकता है, और आगे लक्षण वर्णन या प्रयोग के लिए उपयोग किया जाता है। इन प्रारंभिक ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं की जांच मानव प्रत्यारोपण को समझने, आम अपरा विकृतियों का इलाज करने और गर्भावस्था के नुकसान की घटनाओं को कम करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई जा सकती है।
Introduction
मानव प्रत्यारोपण और प्रारंभिक अपरा के उद्भव ऐतिहासिक रूप से जांच करने के लिए मुश्किल है और काफी हद तक अज्ञात रहते हैं क्योंकि मानव ऊतक इस स्तर पर दुर्गम हैं जब गर्भावस्था चिकित्सकीय अज्ञेय है। पशु मॉडल अपर्याप्त हैं, क्योंकि मानव अपरा में अन्य यूथेरियन स्तनधारियों की तुलना में अपनी अनूठी विशेषताएं हैं। उदाहरण के लिए, मानव प्लेसेंटा कुछ ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं के साथ गर्भाशय मायोमेट्रियम के भीतरी तीसरे तक पहुंचने के साथ डिसिडुआ में गहराई से हमला करता है जबकि अन्य कोशिकाएं गर्भाशय सर्पिल धमनियों को फिर से तैयार करती हैं। यहां तक कि हमारे निकटतम विकासवादी पूर्वजों, गैर-मानव वानरों, मातृ,डिकिडुअल ऊतकों1,2,3के साथ अपरा आकृति विज्ञान और ट्रोफोब्लास्ट बातचीत में अंतर दिखाते हैं।, प्री-इम्प्लांटेशन मानव भ्रूण इन विट्रो प्राप्त करना 1 9 80 के दशक तक संभव नहीं था जब नैदानिक मानव इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ) बांझपन4के इलाज के लिए एक नियमित अभ्यास के रूप में शुरू हुआ था। अब, मानव ब्लास्टोसिस्ट को विट्रो में उगाया जा सकता है ताकि हस्तांतरण के लिए अधिक व्यवहार्य भ्रूण के चयन के लिए अनुमति दी जा सके, साथ ही सुरक्षित आनुवंशिक परीक्षण को सक्षम किया जा सके । भ्रूण संस्कृति तकनीकों में सुधार के साथ-साथ आईवीएफ के बढ़ते उपयोग से कई अधिशेष ब्लास्टोसिस्ट मिले हैं जो रोगी के उपचार चक्र पूरा होने के बाद रहता है । रोगी की सहमति, आईआरबी अनुमोदन के साथ, और कुछ प्रतिबंधों के साथ, इन ब्लास्टोसिस्ट का उपयोग अनुसंधान अध्ययनों के लिए किया जा सकता है। वे एक अमूल्य संसाधन बन गए हैं जिनका उपयोग मानव भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं के व्युत्पन्न के लिए किया गया था5,भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में आंतरिक कोशिका द्रव्यमान के संक्रमण को समझना6,7और हाल ही में, मानव प्रत्यारोपण8, 9,9को फिर से तैयार करने के लिए दिन (डी) 13 तक सफलतापूर्वक सुसंस्कृत किया गया है।, हाल ही में विकसित एकल कोशिका ओमिक्स दृष्टिकोणों का उपयोग करके, इन प्रत्यारोपण चरण मानव भ्रूण ऊतकों तक पहुंच ने आणविक तंत्र का वर्णन करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान किए हैं जो इस अत्यधिक गतिशील कोशिका भेदभाव प्रक्रिया को विनियमित करते हैं, जो पहले10, 11,,12,,,13का पता लगाने के लिए असंभव थे।12
यहां, हम मानव प्रत्यारोपण12के दौरान ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव की गतिशीलता की विशेषता हमारे हाल के प्रकाशन में इस्तेमाल किए गए तरीकों का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल में विट्रीफाइड ब्लास्टोसिस्ट का वार्मिंग, डी12 पोस्ट आईवीएफ तक विस्तारित भ्रूण संस्कृति, भ्रूण को एकल कोशिकाओं में एंजाइमेटिक पाचन, और डाउनस्ट्रीम परख(चित्रा 1)के लिए सेल संग्रह शामिल है। यह विस्तारित संस्कृति प्रणाली मातृ इनपुट के बिना पेरी-प्रत्यारोपण चरण मानव भ्रूण विकास का समर्थन करती है और ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव को पुनः प्राप्त करती है जो कई साल पहले 14 ,15,, 16,17 ,,17को हिस्टोलॉजिकल नमूनों से की गई टिप्पणियोंकेअनुरूप दिखाई देती है।17 प्रत्यारोपण के दौरान, ट्रोफोब्लास्ट आबादी में कम से कम दो सेल प्रकार शामिल होते हैं: मोनोन्यूक्लिटेड प्रोजेनिटर जैसे साइटोट्रोफोब्लास्ट (सीटीबी) और मरणासन्न विभेदित, बहुआयामी सिंक्टियोट्रोफोब्लास्ट (एसटीबी)। ट्रिप्सिन पाचन पर, सीटीबी छोटी, गोल कोशिकाएं हैं जो अन्य सेल वंश(चित्रा 2 ए, बाएंपैनल) से रूपात्मक रूप से अविवेच्य हैं। एपिब्लास्ट और आदिम एंडोडर्म जैसे अन्य सेल वंशों से सीटीबी का पृथक्करण, एकल सेल आरएनए अनुक्रमण द्वारा प्रकट उनके अलग-अलग ट्रांसक्रिप्टोर्मिक प्रोफाइल द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। सिंक्टियोट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं को आसानी से अनियमित आकार की संरचनाओं के रूप में पहचाना जा सकता है जो अन्य सेल प्रकारों की तुलना में काफी बड़े होते हैं और मुख्य रूप से भ्रूण की परिधि में स्थित होते हैं(चित्रा 2 ए,मध्य पैनल; चित्रा 2B,बाएं पैनल) । प्रवासी ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाएं (एमटीबी) भ्रूण विस्तारित संस्कृति के दौरान पाई जाने वाली एक और ट्रोफोब्लास्ट सबलाइनेज हैं और इसे भ्रूण के मुख्य शरीर(चित्रा 2 ए,राइट पैनल, फिगर 2 बी,राइट पैनल) से दूर जाने के रूप में पहचाना जा सकता है। प्रवासी ट्रोफोब्लास्ट, हालांकि अतिरिक्त ट्रोफोब्लास्ट (ईवीटी) के रूप में एक ही मार्कर के कई व्यक्त करते हुए, ईवीटी के रूप में संदर्भित नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि अपरा में लहंगा संरचनाएं विकास के इस प्रारंभिक चरण में नहीं उभरी हैं।
प्रायोगिक रूप से, हम छोटे सीटीबी और बड़े एसटीबी को इकट्ठा करने में सक्षम थे जो भ्रूण को डी 8, डी 10 और डी 12(चित्रा 2ए, बी)में एकल कोशिकाओं में पचाने के बाद आसानी से अलग होते हैं। प्रवासी ट्रोफोब्लास्ट विस्तारित भ्रूण संस्कृति के बाद के चरणों में उत्पन्न होते हैं और पूरे भ्रूण(चित्रा 2ए, बी)के एंजाइमेटिक पाचन से पहले D12 में एकत्र किए जा सकते हैं। एकल कोशिका विश्लेषण से पहले इन तीन ट्रोफोब्लास्ट सबलाइनेज को अलग करके, हम विशिष्ट ट्रांसक्रिप्टोमिक मार्कर की पहचान कर सकते हैं और प्रत्येक कोशिका प्रकार की जैविक भूमिका को परिभाषित कर सकते हैं। साइटोट्रोफोब्लास्ट अत्यधिक प्रसारात्मक होते हैं और एसटीबी और एमटीबी विभेदित वंश 10 , 11,12,,1313की आपूर्ति में जनक कोशिकाओं के रूप में कार्य करते हैं ।10 सिंकियटोट्रोफोब्लास्ट गर्भावस्था को बनाए रखने के लिए अपरा हार्मोन का उत्पादन करने में शामिल हैं और एंडोमेट्रियम10 , 11 , 12,,13में बिल करने वालेभ्रूणोंके लिए भी जिम्मेदार होसकते13हैं। प्रवासी ट्रोफोब्लास्ट में आक्रामक, प्रवासी फेनोटाइप की और भी मजबूत विशेषताएं हैं और गर्भाशय एंडोमेट्रियम10 , 11,,,12,13के गहरे और अधिक व्यापक उपनिवेशीकरणकेलिए जिम्मेदार हैं। प्रत्येक कोशिका प्रकार के प्रतिलिपि हस्ताक्षर को परिभाषित करने के बाद, क्लस्टरिंग विश्लेषणों से कोशिकाओं के दो अतिरिक्त सबसेट का भी पता चला है जो सीटीबी से रूपात्मक रूप से अविवेच्य थे और क्रमशः12एसटीबी और एमटीबी की विशेषताओं के साथ ट्रांसक्रिप्टोम थे । इन मध्यवर्ती चरण कोशिकाओं सीटीबी से या तो एमटीबी या एसटीबी सबलाइनेज में अंतर की प्रक्रिया में होने की संभावना है और अगर भ्रूण आंख बंद करके पचा रहे थे और कोशिकाओं को अकेले ट्रांसक्रिप्टोम द्वारा अलग किया गया था अनदेखी की गई होगी ।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक दो आयामी (2डी) संस्कृति प्रणाली का उपयोग करता है और त्रि-आयामी (3 डी) संरचनात्मक विकास का समर्थन करने के लिए इष्टतम नहीं हो सकता है, जैसा कि हाल ही में एक नव विकसित 3 डी संस्कृति प्रणाली13का वर्णन करते हुए एक प्रकाशन द्वारा सुझाया गया है । फिर भी , इस 2डी प्रणाली में प्रारंभिक ट्रोफोब्लास्ट का अंतर वीवो नमूनों14 , 15, 16,,,1717में से की गई टिप्पणियोंकेअनुरूप प्रतीत होता है । इस प्रोटोकॉल को न्यूनतम परिवर्तनों के साथ हाल ही में वर्णित 3 डी संस्कृति प्रणाली13 में उपयोग के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। सभी कदम एक हाथ में माइक्रोमैनिमुलेशन पिपेट के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डिस्पोजेबल टिप्स या रबर ट्यूबिंग, एक फिल्टर और एक मुखपत्र से जुड़े पतले खींचे गए ग्लास पिपेट से मुंह पिपेट के साथ किए जाते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रत्यारोपण के माध्यम से मानव भ्रूण को संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल के विकास ने वैज्ञानिकों को विकासमेंपहले से अज्ञात समय का पता लगाने की अनुमति दी है8 ,9. यहां, हम मानव भ्रूण संस्कृत?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रजनन चिकित्सा के लिए कोलोराडो केंद्र (CCRM) है कि शालीनता से अनुसंधान के लिए अपने भ्रूण दान किया है पर कई रोगियों को स्वीकार करना चाहते हैं । हम एचसीजी नमूनों के प्रसंस्करण में उनकी मदद के लिए करेन मारुनियाक और सीसीआरएम में नैदानिक प्रयोगशाला के साथ-साथ मुकदमा मैककॉर्मिक और सीसीआरएम में उसके नैदानिक आईवीएफ भ्रूणविज्ञान टीम को भ्रूण संग्रह, भंडारण, ट्रैकिंग और दान के साथ उनकी मदद के लिए भी धन्यवाद देना चाहते हैं। सीसीआरएम द्वारा आंतरिक रूप से वित्तपोषण प्रदान किया गया था ।
Materials
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
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