Summary

Одноклеточная коллекция трофибластных клеток в пери-имплантации этапе человеческих эмбрионов

Published: June 12, 2020
doi:

Summary

Здесь мы описываем метод нагрева витроцистов человека, культивируя их через период имплантации в пробирке, переваривая их в одиночные клетки и собирая ранние клетки трофибласта для дальнейшего исследования.

Abstract

Имплантация человека, аппозиция и прилипание к эпителии поверхности матки и последующее вторжение бластоцист в материнское решение, является критическим, но загадочным биологическим событием, которое исторически было трудно изучить из-за технических и этических ограничений. Имплантация инициируется развитием трофикодерма до раннейтрофобласти и последующей дифференциацией в отдельные подлины трофибластов. Аномальная ранняя дифференциация трофибластов может привести к отказу имплантации, плацентарным патологиям, аномалиям плода и выкидышу. В последнее время были разработаны методы, позволяющие человеческим эмбрионам расти до 13-го дня после оплодотворения в пробирке в отсутствие материнских тканей, период времени, который охватывает период имплантации у человека. Это дало исследователям возможность исследовать имплантацию человека и резюмировать динамику дифференциации трофибластов в этот критический период, не путая материнские влияния и избегая присущих препятствий для изучения событий ранней дифференциации эмбрионов in vivo. Для характеристики различных подлинаций трофобласти во время имплантации мы приняли существующие двухмерные (2D) расширенные методы культуры и разработали процедуру для энзиматичного переваривания и изоляции различных типов трофибластных клеток для анализа ниже по течению. Эмбрионы, выучатые в 2D условиях, имеют относительно сплющенную морфологию и могут быть неоптимальными при моделировании трехмерных (3D) эмбриональных архитектур in vivo. Тем не менее, трофибласт дифференциации, как представляется, менее пострадавших, о чем свидетельствуют ожидаемые морфологии и экспрессии генов изменения в течение расширенной культуры. Различные подлины трофобласта, включая цитотрофобласт, синцитиотрофобласт и миграционную трофибласт, могут быть разделены по размеру, местоположению и временному появлению и использованы для дальнейшей характеристики или экспериментов. Исследование этих ранних клеток трофибласта может быть полезным в понимании имплантации человека, лечении общих плацентарных патологий и смягчении частоты потери беременности.

Introduction

Имплантация человека и появление ранней плаценты исторически трудно исследовать и остаются в значительной степени неизвестными, потому что человеческие ткани недоступны на данном этапе, когда беременность клинически не обнаруживается. Модели животных являются неадекватными, так как плацентация человека имеет свои уникальные особенности по сравнению с другими эвтерианскими млекопитающими. Например, человеческая плацента вторгается глубоко в decidua с некоторыми клетками trophoblast достижения по крайней мере внутренняя треть миометрия матки в то время как другие клетки реконструировать маточных спиральных артерий. Даже наши ближайшие эволюционные предки, не-человеческие приматы, показывают различия в плацентарный морфологии и трофибласт взаимодействия с материнскойрешающих тканей 1,2,3. Получение предварительной имплантации человеческих эмбрионов в пробирке было невозможно до 1980-х годов, когда клиническое оплодотворение человека в пробирке (ЭКО) началось как обычная практика длялечения бесплодия 4. Теперь, человеческие бластоцисты могут быть выращены в пробирке, чтобы обеспечить выбор более жизнеспособных эмбрионов для передачи, а также позволяют безопасное генетическое тестирование. Улучшение методов культуры эмбрионов, а также все более все более использование ЭКО дали много излишков бластоцист, который остается после цикла лечения пациента были завершены. С согласия пациента, IRB утверждения, и с определенными ограничениями, эти бластоцисты могут быть использованы для научных исследований. Они стали бесценным ресурсом, которые были использованы для получения человеческих эмбриональныхстволовых клеток 5,понимая переход внутренней клеточной массы к эмбриональным стволовым клеткам6,,7, а в последнее время, были успешно культурны до дня (D) 13для реконструкции человеческой имплантации 8,9. Используя недавно разработанные подходы одноклеточной омики, доступ к этой стадии имплантации тканей эмбриона человека предоставил уникальную возможность описать молекулярные механизмы, которые регулируют этот высокодинамительный процесс дифференциации клеток, которые ранеебыло невозможно исследовать 10,,11,12,13.

Здесь мы описываем методы, используемые в нашей недавней публикации, характеризующие динамику дифференциации трофибласта во время имплантациичеловека 12. Этот протокол включает в себя потепление vitrified бластоцисты, расширенный эмбрион культуры до D12 после ЭКО, энзиматическое переваривание эмбриона в одиночные клетки, и сбор клеток для вниз по течению анализы (Рисунок 1). Эта расширенная система культуры поддерживает пери-имплантации стадии развития эмбриона человека без материнского вклада и recapitulates трофибласт дифференциации, которая появляется в соответствии с наблюдениями, сделанными из гистологических образцовмного лет назад 14,15,16,17. Во время имплантации популяция трофибластов состоит как минимум из двух типов клеток: мононуклеастного прародителя типа цитотрофобласта (КТБ) и неизлечимо дифференцированного, многонуклеированного синцитиотрофобласта (СТБ). После пищеварения трипсина, CTB являются небольшими, круглые клетки, которые морфологически неотличимы от других клеточных линий(рисунок 2A, левая панель). Отделение CTB от других клеточных линий, таких как эпибласт и примитивный эндодерм, может быть достигнуто с помощью их различных транскриптомных профилей, выявленных одноклеточной РНК-секвенированием. Синцитиотрофобластные клетки могут быть легко идентифицированы как нерегулярные формы структур, которые значительно больше, чем другие типы клеток и в основном расположены на периферии эмбриона(рисунок 2A, средняя панель; Рисунок 2B, левая панель). Мигрирующие трофибластные клетки (МТБ) являются еще одним подлинием трофибласта, найденным во время расширенной культуры эмбриона, и могут быть признаны, казалось бы, отохаальными от основного тела эмбриона(рисунок 2A, правая панель, рисунок 2B, правая панель). Мигрирующая трофобласть, хотя и выражает многие из тех же маркеров, что и экстра-villous trophoblast (EVT), не следует называть EVT, так как поколенческие структуры в плаценте не появились на этой очень ранней стадии развития.

Экспериментально мы смогли собрать небольшие КТБ и большие СТБ, которые легко различимы после того, как эмбрионы перевариваются в одиночные клетки на D8, D10 и D12(рисунок 2A,B). Мигрирующие трофибласты возникают на более поздних стадиях расширенной культуры эмбриона и могут быть собраны в D12 до энзиматического пищеварения всего эмбриона(рисунок 2A,B). Фенотипически отделяя эти три подлинии трофибласта до анализа одноклеточных клеток, мы можем определить конкретные транскриптомные маркеры и определить биологическую роль каждого типа клеток. Цитотрофобласт являются высоко пролиферативными и выступать в качестве прародителя клеток в поставке СТБ иМТБ дифференцированных линий 10,11,12,13. Syncytiotrophoblast участвуют в производстве плацентарный гормонов для поддержания беременности, а также может быть ответственным за эмбрионы рытьсяв эндометрия 10,11,12,13. Мигрирующая трофибласт имеет еще более сильные особенности инвазивного, миграционного фенотипа и, вероятно, отвечает за более глубокую и обширную колонизациюэндометрия матки 10,,11,,12,,13. После определения транскриптомной подписи каждого типа клеток, кластеризации анализы также выявили два дополнительных подмножества клеток, которые были морфологически неотличимы от CTB и транскриптомы с особенностями STB и MTB, соответственно12. Эти промежуточные клетки стадии, вероятно, в процессе дифференциации от CTB либо MTB или STB подлинажей и были бы упущены, если эмбрионы были слепо усваивается и клетки были разделены транскриптома в одиночку.

Протокол, описанный здесь, использует двухмерную (2D) культурную систему и не может быть оптимальным для поддержки трехмерного (3D) структурного развития, как это было предложено в недавней публикации, описывающей недавно разработанную систему 3Dкультуры 13. Тем не менее, в этой 2D системе дифференциация раннего трофибласта, кажется, согласуется с наблюдениями, сделанными из образцов in vivo14,,15,,16,,17. Этот протокол также может быть легко адаптирован для использования в недавно описанной системе 3D культуры13 с минимальными изменениями. Все шаги выполняются с помощью портативной микроманипуляционной пипетки с коммерчески доступными одноразовыми наконечниками или ротовой пипеткой из тонко вытянутой стеклянной пипетки, прикрепленной к резиновым трубам, фильтру и мундштуку.

Protocol

Все человеческие эмбрионы были пожертвованы с согласия на использование в исследованиях. Протоколы о расширенной культуре эмбрионов человека были одобрены Западным институциональным советом по обзору (исследование No 1179872) и следуют международным руководящим принципам. Любое использ…

Representative Results

Здоровые эмбрионы продемонстрировали продолжающееся распространение в течение расширенной культуры(рисунок 2B). Аномальные эмбрионы начали оттягиваться от внешних краев и распадаться(рисунок 2C). Из нашего опыта, около 75% эмбрионов были прикреплены к ни?…

Discussion

Разработка протокола к культуре человеческих эмбрионов с помощью имплантации позволила ученым исследовать ранее неизведанное время вразработке 8,,9. Здесь мы используем расширенную культурную систему для культуры человеческих эмбрионов и изучаем ранн?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы отметить многих пациентов в Колорадо Центр репродуктивной медицины (CCRM), которые любезно пожертвовал свои эмбрионы для исследований. Мы также хотели бы поблагодарить Карен Маруняк и клиническую лабораторию CCRM за помощь в обработке образцов ХГЧ, а также Сью Маккормик и ее клиническую команду эмбриологии ЭКО в CCRM за помощь в сборе, хранении, отслеживании и донорстве эмбрионов. Финансирование было предоставлено внутри ККРМ.

Materials

3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator Thermo Fisher Scientific 13-998-078
35 mm Corning Primaria tissue culture dish VWR 62406-038 Case of 500
5 mL snap cap tube VWR 60819-295 Pack of 25
60 mm Corning Primaria tissue culture dish VWR 25382-687 Case of 200
6-well dish Agtech Inc. D18 Pack of 1, 10, or 50
Acidic Tyrode's solution Millipore Sigma T1788 100 mL
Biotix 1250 µL pipette tips VWR 76322-156 Pack of 960
Blast, blastocyst culture media Origio 83060010 10 mL
Dilution Solution Kitazato VT802 1 x 4 mL
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets Thermo Fisher Scientific 1367820D 5.75 in. (146mm); 720/Cs
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Millipore Sigma D8537
Embryo culture paraffin oil OvOil Vitrolife 10029 100 mL
Eppendorf PCR tubes 0.2 mL VWR 47730-598 Pack of 1,000
Eppendorf PCR tubes 0.5 mL VWR 89130-980 Case of 500
Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution Millipore Sigma F0895 1 mg
Gilson 1 mL Pipetteman Thermo Fisher Scientific F123602G 1 Pipetteman 200-1000 µL
Gilson 20 µL Pipetteman Thermo Fisher Scientific F123602G 1 Pipetteman 2-20 µL
Gilson 200 µL Pipetteman Thermo Fisher Scientific F123602G 1 Pipetteman 50-200 µL
G-MOPS handling media Vitrolife 10129 125 mL
Handling media Origio 83100060 60 mL
Ibidi 8 well chambered coverslip Ibidi 80826 15 slides per box
IVC1/IVC2 Cell Guidance Systems M11-25/ M12-25 5-5mL aliquots
K System T47 Warming Plate Cooper Surgical 23054
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane Fisher Scientific SLGVR33RS Pack of 50
Mouth pieces IVF Store MP-001-Y 100 pieces
Oosafe center well dish Oosafe OOPW-CW05-1 Case of 500
Quinn's Advantage SPS Origio ART-3010 12x 12 mL
Rubber latex tubing for mouth pieces IVF Store IVFS-NRL-B-5 5 ft.
Stereomicroscope Nikon SMZ1270
Stripper tips Cooper Surgical MXL3-275 20/pk 275 µm
Thawing Solution Kitazato VT802 2 x 4 mL
The Stripper Micropipetter Cooper Surgical MXL3-STR
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red Thermo Fisher Scientific 12604013 1 x 100 mL
Tween20 Millipore Sigma P1379-25ML 25 mL bottle
VWR 1-20 µL pipette tips VWR 76322-134 Pack of 960
VWR 1-200 µL pipette tips VWR 89174-526 Pack of 960
Washing Solution Kitazato VT802 1 x 4 mL

References

  1. Carter, A. M. Animal models of human placentation–a review. Placenta. , 41-47 (2007).
  2. Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion — a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
  3. Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
  4. Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
  5. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  6. O’Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
  7. O’Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
  8. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
  9. Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
  10. Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
  11. Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
  12. West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
  13. Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
  14. Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
  15. Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
  16. Carnegie Institution of Washington. . Contributions to embryology. , (1915).
  17. Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
  18. Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).

Play Video

Cite This Article
Logsdon, D. M., Kile, R. A., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L., Yuan, Y. Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos. J. Vis. Exp. (160), e61476, doi:10.3791/61476 (2020).

View Video