近植入阶段人类胚胎中特罗福细胞的单细胞集合
Summary
在这里，我们描述了一种加热玻璃化人类胚胎的方法，通过体外植入期培养它们，将其消化成单细胞，并收集早期成体细胞，以作进一步研究。
Abstract
人类植入，对子宫表面上皮的定位和附着力，以及随后对母体十分细胞的侵扰，是一个关键但神秘的生物事件，由于技术和伦理上的限制，在历史上一直难以研究。植入是由早期三磷细胞的营养细胞发育和随后分化为不同的成吉龙体亚系而启动的。畸变早期成体分化可能导致植入失败、胎盘病理、胎儿异常和流产。最近，人们已经开发出一些方法，允许人类胚胎在没有母体组织的情况下生长到体外受精后的第13天，这一时期包括人类植入期。这给了研究人员机会，研究人类植入和重述在这个关键时期，不混淆母体影响和避免内在的障碍，研究早期胚胎分化事件在体内的动态。为了描述植入过程中不同的成虫细胞亚系，我们采用了现有的二维（2D）扩展培养方法，并开发了一种酶消化和分离不同类型的成吉本细胞进行下游测定的程序。在二维条件下培养的胚胎具有相对扁平的形态，在体内三维（3D）胚胎结构建模方面可能不理想。然而，在扩展培养过程中，预期形态和基因表达变化表明，成图细胞分化的影响较小。不同的成虫细胞亚系，包括细胞萎缩细胞、同步性细胞和迁徙成虫细胞，可以按大小、位置和时间出现来分离，并用于进一步表征或实验。研究这些早期成体细胞可能有助于理解人类植入，治疗常见的胎盘病理，并减轻妊娠损失的发生率。
Introduction
人类植入和早期胎盘的出现在历史上很难调查，而且在很大程度上仍然未知，因为当怀孕在临床上无法察觉时，人体组织在这个阶段是无法接近的。动物模型不足，因为与其他动物哺乳动物相比，人类的放置有其独特的特征。例如，人类胎盘侵入到十分深，一些细胞细胞至少达到子宫肌膜的内三分之一，而其他细胞则重塑子宫螺旋动脉。即使是我们最亲密的进化祖先，非人类灵长类动物，也表现出与母体十,化组织1、2、3的胎儿形态和成骨细胞相互作用的差异。直到20世纪80年代，临床人类体外受精（IVF）开始作为治疗不孕症的常规做法，才有可能在体外获得人类胚胎。现在，人类胚胎可以在体外生长，以便选择更可行的胚胎进行移植，并实现安全的基因测试。胚胎培养技术的改进，以及试管婴儿的使用日益增多，产生了许多多余的胚胎，这些胚胎在患者的治疗周期完成后仍然存在。经患者同意、IRB 批准以及某些限制，这些囊肿可用于研究。它们已成为用于获得人类胚胎干细胞5的宝贵资源，了解内细胞质量向胚胎干细胞6、7,的过渡，最近，它们被成功培养，直到第（D）天（D）13，重塑人类植入8、9。,9通过利用最近开发的单细胞组理方法，获得这些植入阶段人类胚胎组织提供了独特的机会来描述调节这种高度动态细胞分化过程的分子机制，这些机制以前是不可能探索的10、11、12、13。,11,12,13
在这里，我们描述了我们最近的出版物中使用的方法，这些方法描述了人类植入12期间成体细胞分化的动态。该协议包括维他化胚胎的升温，将胚胎培养扩展到D12后IVF，将胚胎酶消化成单细胞，以及细胞收集用于下游测定（图1）。这种扩展的培养系统支持近植入阶段人类胚胎发育，无需母体输入，并重述了与,多年前14、15、16、17等组织,15学标本的观察16结果一致的成骨细胞分化。在植入过程中，成粒细胞群体由至少两种细胞类型组成：单核祖细胞细胞（CTB）和端膜分化的多核同步细胞（STB）。在三辛消化时，CTB是小而圆的细胞，在形态上与其他细胞系系无法区分（图2A，左面板）。CTB与其他细胞系系（如表膜细胞和原始内端膜）的分离可以通过单细胞RNA测序揭示的不同转录特征实现。同步细胞很容易被识别为不规则形状的结构，明显大于其他细胞类型，主要位于胚胎的外围（图2A，中间面板;图 2B，左面板）。移殖成细胞（MTB）是在胚胎扩展培养过程中发现的另一种成吉本细胞亚系，可以识别为似乎远离胚胎主体（图2A，右面板，图2B，右面板）。移栖成虫虽然表达许多与额外小虫细胞相同的标记，但不应称为EVT，因为胎盘中的双生结构尚未在发育的早期阶段出现。
在实验中，我们能够收集到小CTB和大型STB，这些在胚胎被消化成D8、D10和D12的单细胞后很容易区分（图2A，B）。迁移性成虫在胚胎发育的后期产生，可以在D12收集，然后对整个胚胎进行酶消化（图2A，B）。通过表型分离这三个三个三个三个三个三族细胞子系在单细胞分析之前，我们可以识别特定的转录标记，并定义每种细胞类型的生物学作用。细胞萎缩细胞是高度增殖的，在提供STB和MTB分化血统10，11，12，13,11,12时充当祖细胞。同步性细胞参与生产胎盘激素来维持妊娠，并可能负责胚胎钻进内膜10，11，12，13。10,11,12,13迁徙的龙骨细胞具有更强烈的侵入性，迁移表型的特点，并可能导致子宫子宫,内膜10，11，12，13,11,12的更深入和更广泛的殖民化。在定义每种细胞类型的转录特征后，聚类分析还发现另外两个细胞子集，这些细胞在形态上与CTB无法区分，并且具有STB和MTB特征的转录组，分别是12。这些中间阶段细胞很可能在从CTB到MTB或STB子系的区分过程中，如果胚胎被盲目消化，细胞被转录组单独分离，就会被忽视。
此处描述的协议使用二维 （2D） 培养系统，可能不理想支持三维 （3D） 结构开发，正如最近一份描述新开发的 3D 文化系统13 的出版物所建议的那样。然而，在这个2D系统中，早期成体细胞的分化似乎与体内标本14、15、16、17,15,16的观察结果一致。此协议也可以很容易地适应到最近描述的 3D 培养系统13 中的使用，变化最小。所有步骤都使用手持式微操作移液器进行，该移液器配有市售的一次性吸管或从连接到橡胶管、过滤器和喉舌的细拉玻璃移液器中移液器中移液器。
Protocol
Representative Results
Discussion
通过植入培养人类胚胎的协议的制定，使科学家能够探索一个以前未知的发育时间。,9在这里，我们使用一个扩展的培养系统来培养人类胚胎，并在小胎盘形成之前研究早期成肌细胞分化。此处介绍的方法允许我们收集不同的 TB 子线，用于下游单细胞分析。这项工作使科学界有机会了解人类发展的这一关键和神秘的时期，并可能为流产或其他性腺病理?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢科罗拉多生殖医学中心（CCRM）的许多患者慷慨地捐赠了他们的胚胎用于研究。我们还要感谢卡伦·马鲁尼亚克和CCRM的临床实验室在处理hCG样品方面的帮助，以及苏·麦考密克和她的临床IVF胚胎学团队在CCRM的胚胎收集、储存、跟踪和捐赠方面的帮助。资金由CCRM内部提供。
Materials
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
- Carter, A. M. Animal models of human placentation–a review. Placenta. , 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion — a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
- Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- O’Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
- O’Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
- West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
- Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
- Carnegie Institution of Washington. . Contributions to embryology. , (1915).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
- Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).
