Fosforproteomic strategi for profilering osmotisk stress signalering i Arabidopsis
Summary
Præsenteret her er en fosforproteomic tilgang, nemlig stop og gå udvinding tip baseret fosforproteomic, som giver høj-gennemløb og dyb dækning af Arabidopsis fosforproteome. Denne tilgang afgrænser overblikket over osmotisk stresssignalering i Arabidopsis.
Abstract
Proteinphosphorylering er afgørende for reguleringen af enzymaktivitet og genekspression under osmotisk tilstand. Massespektrometri (MS)-baserede fosforproteomics har ændret måden at studere plantesignaltransduktion på. Kravet om masser af råvarer og forlænget MS-målingstid for at opnå dækningsdybden har imidlertid været den begrænsende faktor for den høje gennemstrømningsundersøgelse af globale fosforprotemiske ændringer i planter. For at forbedre følsomheden og gennemstrømningen af plantephosphoproteomics har vi udviklet en stop and go-ekstraktion (fase) spidsbaseret fosforproteomics-tilgang kombineret med Tandem Mass Tag (TMT) mærkning til hurtig og omfattende analyse af plantephosphoryleringsengturbation som reaktion på osmotisk stress. Ved at udnytte enkelheden og den høje gennemløb af fasespidsteknikken tager hele proceduren cirka en time at bruge to spidser til at afslutte fosforberigelse, fraktionering og prøverensningstrin, hvilket tyder på en brugervenlig og høj effektivitet af tilgangen. Denne fremgangsmåde giver ikke kun en dybdegående plantephoosphoproteomics-analyse (> 11.000 fosforidentifikation), men viser også den overlegne adskillelseseffektivitet (< 5% overlapning) mellem tilstødende fraktioner. Desuden er multipleksering opnået ved hjælp af TMT-mærkning for at kvantificere fosforprotemiske ændringer af vilde og snrk2 decuple mutantplanter. Denne tilgang er med succes blevet brugt til at afsløre fosforyleringshændelserne i Raf-lignende kinases som reaktion på osmotisk stress, som kaster lys over forståelsen af tidlig osmotisk signalering i landplanter.
Introduction
Høj saltholdighed, lav temperatur og tørke forårsager osmotiske belastninger, som er en vigtig miljøfaktor, der påvirker planteproduktivitet1,2. Proteinphosphorylering er en af de mest betydningsfulde ændringer efter oversættelsen , der formidler signalopfattelse og transduktion i anlæggets reaktion på osmotisk stress3,4,5. SNF1-relateret protein kinase 2s (SnRK2s) er involveret i den osmotiske stress signalering6. Ni af ti medlemmer af SnRK2 familien viser betydelig aktivering som reaktion på osmotisk stress7,8. Den snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (snrk2-dec) mutant har mutationer i alle ti SnRK2 vises overfølsomhed over for osmotisk stress. I snrk2-dec mutant, den osmotiske stress-induceret ophobning af inositol 1,4,5-trisphosphat (IP3), abscissyre (ABA) biosyntese, og genekspressioner er stærkt reduceret, fremhæver den afgørende rolle SnRK2s i osmotisk stressrespons6. Det er dog stadig uklart, hvordan SnRK2s kinases regulerer disse biologiske processer. Profilering af fosforprotemomic ændringer som reaktion på osmotisk stress er en effektiv måde at bygge bro over denne kløft og til at afgrænse osmotiske stress-udløste forsvarsmekanismer i planter.
Massespektrometri (MS) er en effektiv teknik til kortlægning af plantephoproteome9. Karakterisering af plantephosphoproteomics er imidlertid fortsat en udfordring på grund af det dynamiske udvalg af planteproteom og kompleksiteten af plante lysat4. For at overvinde disse udfordringer udviklede vi en universel plantephoproteomic arbejdsgang, som eliminerer uønskede interferenser som fra fotosyntetiske pigmenter og sekundære metabolitter og muliggør den dybe dækning af plantefosforproteome10. Der er udviklet flere fosforberigelsesmetoder såsom immobiliseret metalion-affinitetskromatografi (IMAC) og metaloxidkromatografi (MOC) til berigelse af fosforider forud for MS-analyse11,12,13,14,15,16. Sure ikke-phosphopeptider, der er medrensende med fosfortider, er de største interferenser for fosfordetektion. Tidligere har vi standardiseret pH-værdien og koncentrationen af organisk syre i IMAC-belastningsbuffer for at eliminere bindingen af ikke-phosphopeptider for at opnå mere end 90% berigelse specificitet uden om præfraktionstrin11.
Prøvetab i flertrinsprocessen for fosforberigelse og fraktionering hæmmer fosforidentifikationens følsomhed og dybden af fosforprotemisk dækning. Stop-and-go-ekstraktionsspidser (trinspidser) er pipettespidser, der indeholder små diske til at lægge låg på enden af spidsen, som kan indarbejdes med kromatografi til peptidfraktionering og rengøring17. Prøvetab under fasespidsproceduren kan minimeres ved at undgå prøveoverførsel mellem rørene. Vi har med succes implementeret fase tip i Ga3 +-IMAC og Fe3 +-IMAC at adskille lav rigelige flere fosforitilerede peptider fra enkeltvis phosphorylated peptider, som forbedrede dybden af menneskelige fosforeom15. Desuden har brugen af høj pH-bakfase (Hp-RP) trinspids vist den bredere dækning af humanmembran proteom sammenlignet med stærk kation udveksling (SCX) og stærk anion udveksling (SAX) kromatografi18. Derfor kan integration af IMAC- og Hp-RP-scenespidsteknikker øge plantens fosforproteome-dækning med enkelhed, høj specificitet og høj gennemløb. Vi har vist, at denne strategi identificerede mere end 20.000 fosforyleringssteder fra Arabidopsis-frøplanter, hvilket repræsenterer en forbedret dybde af plantephoproteome19.
Her rapporterer vi en fase tip-baseret fosforproteomic protokol for fosforproteomic profilering i Arabidopsis. Denne arbejdsgang blev anvendt til at studere fosforproteomic forstyrrelse af vilde-type og snrk2-dec mutant kimplanter som reaktion på osmotisk stress. Fosforproteomic analyse afslørede fosforylering steder impliceret i kinase aktivering og tidlig osmotisk stress signalering. Sammenlignende analyse af wild-type og snrk2-dec mutant phosphoproteome data førte opdagelsen af en Raf-lignende kinase (RAF)-SnRK2 kinase kaskade, som spiller en central rolle i osmore stress signalering i høje planter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det dynamiske område og kompleksiteten af planteproteom og fosforproteom er stadig en begrænsende faktor til dybden af fosforproteomics analyser. På trods af at LC-MS/MS-analysen med en enkelt kørsel er i stand til at identificere 10.000 fosforyleringssteder21,22, er dækningen af hele plantefosforproteomet stadig begrænset. Derfor kræves der en fosforæmisk arbejdsgang, der giver høj følsomhed og overlegen adskillelseseffektivitet, ved profilering af det…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af det strategiske prioriterede forskningsprogram for det kinesiske videnskabsakademi, Grant XDB27040106.
Materials
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
References
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
- Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
- Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
- Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
- Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
- Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
- Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
- Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).
- Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).
- Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
- Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
- Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
- Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
- Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
- Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
- Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
- Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
- Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).
