Фосфопротеомная стратегия профилирования осмотического стресса Сигнализация в Арабидопсис
Summary
Представлено здесь фосфопротеомный подход, а именно остановить и пойти экстракции отзыв основе фосфопротеом, который обеспечивает высокую пропускную способность и глубокий охват фосфопротеом Arabidopsis. Такой подход разграничивает обзор осмотического стресса, сигнализируемого в арабидопсисе.
Abstract
Фосфорилирование белка имеет решающее значение для регуляции активности ферментов и экспрессии генов в осмотическом состоянии. Масс-спектрометрия (МС) на основе фосфопротеомики изменила способ изучения трансдукции сигнала растений. Тем не менее, требование много стартовых материалов и длительное время измерения MS для достижения глубины охвата был ограничивающим фактором для высокой пропускной способности исследования глобальных фосфопротеомных изменений в растениях. Для повышения чувствительности и пропускной способности растений фосфопротемики, мы разработали остановки и идти извлечения (этап) наконечник на основе фосфопротеомики подход в сочетании с Tandem Mass Tag (TMT) маркировки для быстрого и всестороннего анализа возмущения фосфорилирования растений в ответ на осмотический стресс. Используя простоту и высокую пропускную способность техники наконечника этапа, вся процедура занимает около одного часа, используя два совета, чтобы закончить обогащение фостопептида, фракционирование и шаги очистки образца, предлагая простой в использовании и высокую эффективность подхода. Такой подход не только обеспечивает углубленный анализ фосфопротеомики растений (идентификация фосфопептида 11 000), но и демонстрирует превосходную эффективность разделения (на 5% перекрытие) между смежными фракциями. Кроме того, мультиплексирование было достигнуто с помощью маркировки TMT для количественной оценки фосфопротеомных изменений растений-мутантов дикого типа и snrk2 decuple. Этот подход успешно используется для того, чтобы выявить фосфориляционные события раф-киназа в ответ на осмотический стресс, который проливает свет на понимание ранней осмотической сигнализации в наземных растениях.
Introduction
Высокая соленость, низкая температура и засуха вызывают осмотические стрессы, что является основным экологическим фактором, влияющим на продуктивностьрастений 1,2. Фосфорилирование белка является одним из наиболее значительных пост-трансляционных модификаций, о посредничестве восприятия сигнала и трансдукции в реакции растенийна осмотический стресс 3,4,5. SNF1 связанных белка киназы 2s (SnRK2s) участвуют в осмотическом стрессе сигнализации6. Девять из десяти членов семьи SnRK2 показывают значительную активацию в ответ на осмотический стресс7,8. snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-dec) мутант, имеющих мутации во всех десяти SnRK2 отображается повышенная чувствительность к осмотическому стрессу. В snrk2-dec мутант, осмотическое стресс-индуцированного накопления инозитол 1,4,5-тризфосфата (IP3), абсцизиновой кислоты (ABA) биосинтеза, и экспрессии генов сильно снижается, подчеркивая жизненно важную роль SnRK2s в осмотической реакциистресса 6. Тем не менее, до сих пор неясно, как SnRK2s kinases регулировать эти биологические процессы. Профилирование фосфопротеомных изменений в ответ на осмотический стресс является эффективным способом преодоления этого разрыва и разграничения осмотических стрессовых механизмов защиты растений.
Масс-спектрометрия (МС) является мощным методом для картирования фосфатом растений9. Характеристика растительной фосфопротеомики, однако, остается проблемой из-за динамического диапазона протеома растений и сложности растительноголисата 4. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали универсальный фосфопротеомный рабочий процесс растений, который устраняет нежелательные помехи, такие как фотосинтетические пигменты и вторичные метаболиты, и позволяет глубокий охват фосфатом растений10. Несколько методов обогащения фоспопептида, таких как иммобилизованная хроматография сродства металла (IMAC) и хроматография оксида металла (MOC) были разработаны для обогащения фоспопептидов до анализа MS11,12,13,14,15,16. Кислотные нефостопептиды, соочищающиеся с помощью фостопептидов, являются основными помехами для обнаружения фостопептида. Ранее мы стандартизировали значение рН и концентрацию органической кислоты буфера загрузки IMAC для устранения связывания нефостопептидов, чтобы получить более 90% специфичности обогащения в обход предварительного дробного шага11.
Потеря образцов в многоступенчатом процессе обогащения и фракционирования фоспопептида препятствует чувствительности идентификации фоспопептида и глубине фосфопротеомного покрытия. Стоп-и-гоу-экстракции советы (этап советы) являются пипетки советы, которые содержат небольшие диски, чтобы крышка конца кончика, который может быть включен с хроматографии для пептидной фракциоции иочистки 17. Потеря образца во время процедуры наконечника этапа может быть сведена к минимуму, избегая передачи образца между трубками. Мы успешно внедрили наконечник этапа в Ga3“-IMAC и Fe3″-IMAC, чтобы отделить низкий обильный несколько фосфорилированных пептидов от потихоть фосфорилированных пептидов, которые улучшили глубину фосфопротеомачеловека 15. Кроме того, использование высокой рН обратной фазы (Hp-RP) кончик стадии продемонстрировал более широкий охват человеческой мембраны протеом по сравнению с сильным обменом катиона (SCX) и сильный анионный обмен (SAX) хроматографии18. Таким образом, интеграция IMAC и Hp-RP этапе отзыв методы могут увеличить покрытие фосфатом растений с простотой, высокой специфичностью и высокой пропускной способностью. Мы показали, что эта стратегия определила более 20000 участков фосфорилирования из саженцев Арабидопсиса, что представляет собой повышенную глубину растительного фосфопротеома19.
Здесь мы сообщаем о этапе наконечник основе фосфопротеомного протокола для фосфопротеомного профилирования в Arabidopsis. Этот рабочий процесс был применен для изучения фосфопротеомного возмущения саженцев диких и snrk2-dec мутантов в ответ на осмотическое напряжение. Фосфопротеомный анализ выявил фосфорилирование сайтов, причастных к активации киназы и раннего осмотического стресса сигнализации. Сравнительный анализ дикого типа и snrk2-dec мутант фосфопротеом данных привело к открытию Raf-как киназы (RAF)-SnRK2 киназы каскад, который играет ключевую роль в осмор стресс сигнализации в высоких растений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Динамический диапазон и сложность растительного протеома и фосфопротеома по-прежнему являются ограничивающим фактором глубины фосфопротеомических анализов. Несмотря на возможность одного запуска LC-MS/MS анализа для выявления 10000 фосфорилированиясайтов 21,2…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Стратегической приоритетной исследовательской программой Китайской академии наук Grant XDB27040106.
Materials
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
References
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
- Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
- Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
- Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
- Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
- Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
- Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
- Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).
- Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).
- Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
- Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
- Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
- Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
- Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
- Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
- Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
- Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
- Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).
